CN116987660B - 中药小分子组合物促进胰岛类器官体外成熟的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞生物学及再生医学领域，提出了一种利用中药小分子组合物促进胰岛类器官体外成熟的方法，该方法将多能干细胞诱导分化形成胰腺祖细胞，之后利用含有中药小分子组合物的培养基继续培养，得到成熟的胰岛类器官；其中，中药小分子组合物包括葛根素0.1～5μM、甘草酸2～10μM、芦丁2～10μM、黄芩苷10～25μM、黄连素0.1～2μM。本发明利用中药小分子组合物在体外促进人多能干细胞定向分化为成熟胰岛类器官，提高β细胞的比例和标志性基因INS的表达。本发明的方法可为胰岛发育、胰岛研究模型等领域提供一个理想的研究平台，同时具有重要的药物研发、指导药物精准治疗等临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种中药小分子组合物促进胰岛类器官体外成熟的方法。
背景技术
糖尿病（diabetes mellitus, DM）是一种由于人体胰岛素分泌不足或其生物作用障碍而导致的慢性代谢性疾病。长期的高血糖状态将引起失明、肾衰竭、心脏病发作、中风等多种并发症，严重危害了全球的公共卫生，造成了严重的社会经济负担。
对于1型糖尿病以及胰岛功能受损严重的2型糖尿病患者，采用胰岛素强化治疗方案或胰岛素泵治疗虽然可在一定程度上调控血糖，但这些方法的疗效有限，仍无法有效阻止糖尿病及其并发症的发生发展。糖尿病患者受损的胰岛组织难以修复，通过胰岛移植可以从根本上治愈糖尿病。但目前胰岛供体严重缺乏，如何获得有效的、充足的胰岛细胞是目前干细胞再生医学的研究难点。人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）体外诱导分化的胰岛类器官（islet organoid，IO）可在结构和功能上与体内胰岛器官相似，并且可以进行大规模培养，是极具潜力的糖尿病细胞替代疗法。Alireza Rezania等成功地在体外获得了hPSCs来源的胰岛β细胞，但其分化效率和生物功能均与临床应用有较大差距。因此，如何提高仿生胰岛类器官的分化效率和生物功能是亟需解决的重要问题。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种中药小分子组合物促进胰岛类器官体外成熟的方法，以解决上述问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案实现方式如下：
一种中药小分子组合物促进胰岛类器官体外成熟的方法，将多能干细胞诱导分化形成胰腺祖细胞，之后利用含有中药小分子组合物的培养基继续培养，得到成熟的胰岛类器官；其中，中药小分子组合物包括葛根素0.1～5μM、甘草酸2～10μM、芦丁2～10μM、黄芩苷10～25μM、黄连素0.1～2μM。
进一步，该方法包括如下步骤：
S1、诱导形成内胚层细胞
将多能干细胞依次在分化培养基I、分化培养基II中培养；其中，分化培养基I在RPIM1640培养基的基础上，添加FAF-BSA、NaHCO3、葡萄糖、人活化素A和CHIR99021；分化培养基II在RPIM1640培养基的基础上，添加FAF-BSA、NaHCO3、葡萄糖、维生素C和FGF7；
S2、诱导形成胰腺祖细胞
将上述获得的内胚层细胞依次在分化培养基III、分化培养基IV中培养；其中，分化培养基III在RPIM1640培养基的基础上，添加NaHCO3、葡萄糖、FAF-BSA、维生素C、FGF7、SANT-1、维生素A酸、LDN193189、ITS-X和TPB PdBU/PKC Activator II；分化培养基IV在分化培养基III的基础上减少FGF7的用量；
S3、诱导形成成熟胰岛类器官
将上述获得的胰腺祖细胞依次在分化培养基V、分化培养基VI、分化培养基VII中培养；其中，分化培养基V在MCDB131培养基的基础上，添加NaHCO3、葡萄糖、FAF-BSA、SANT-1、维生素A酸、LDN193189、ITS-X、T3 sodium、ALK5抑制剂II和中药小分子组合物；分化培养基VI在MCDB131培养基的基础上，添加NaHCO3、葡萄糖、FAF-BSA、LDN193189、ITS-X、T3sodium、ALK5抑制剂II、γ secretase inhibitor XX和中药小分子组合物；分化培养基VII在MCDB131培养基的基础上，添加NaHCO3、葡萄糖、FAF-BSA、LDN193189、ITS-X、T3 sodium、ALK5抑制剂II和中药小分子组合物。
进一步，分化培养基V中中药小分子组合物包括葛根素0.5～5μM、甘草酸2～6μM、芦丁3～8μM、黄芩苷5～15μM、黄连素0.2～1μM；
分化培养基VI中中药小分子组合物包括葛根素0.1～2μM、甘草酸2～6μM、芦丁1～3μM、黄芩苷15～25μM、黄连素0.2～1μM；
分化培养基VII中中药小分子组合物包括葛根素0.1～2μM、甘草酸2～6μM、芦丁1～3μM、黄芩苷15～25μM、黄连素0.2～1μM。
进一步，在分化培养基I中培养2.5~4天，在分化培养基II中培养2~4天，在分化培养基III中培养2~4天，在分化培养基IV中培养3~5天，在分化培养基V在培养3~5天，在分化培养基VI中培养6~10天，在分化培养基VII中培养6~14天，培养基每天换液。
进一步，中药小分子组合物中的葛根素、甘草酸、芦丁、黄芩苷、黄连素分别溶于DMSO中制成储存液使用。
本发明还提供了一种用于上述所述的方法的中药小分子组合物，包括葛根素0.1～5μM、甘草酸2～10μM、芦丁2～10μM、黄芩苷10～25μM、黄连素0.1～2μM。
本发明还提供了一种如上述所述的中药小分子组合物在促进胰岛类器官体外成熟上的应用。
相对于现有技术，本发明所述的中药小分子组合物促进胰岛类器官体外成熟的方法具有以下优势：
本发明利用中药小分子组合物在体外促进人多能干细胞定向分化为成熟胰岛类器官，提高β细胞（INS+细胞）的比例和标志性基因INS的表达。本发明的方法可为胰岛发育、胰岛研究模型等领域提供一个理想的研究平台，同时具有重要的药物研发、指导药物精准治疗等临床应用价值。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为hPSC的多能性免疫荧光检测结果图；
图2为本发明得到的胰岛类器官形态特征图；
图3为本发明各阶段标志物荧光检测结果图；
图4为本发明所述的中药小分子组合物不同添加阶段的结果对比图；
图5为本发明所述的中药小分子组合物在S3中不同添加阶段的结果对比图；
图6为本发明所述的中药小分子诱组合物对胰岛类器官相关细胞标志物基因表达的影响对比图；
图7为本发明所述的中药小分子诱组合物对胰岛类器官相关细胞分化效率的影响对比图；
图8为本发明所述的中药小分子的浓度对胰岛类器官的成熟度的影响对比图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
所述百分比浓度均为体积/体积(V/V)百分比浓度。
本发明提供了一种中药小分子组合物促进胰岛类器官体外成熟的方法，该方法包括如下步骤：
S1、诱导形成内胚层细胞
将多能干细胞依次在分化培养基I中培养2.5~4天，在分化培养基II中培养2~4天；其中，分化培养基I在RPIM1640培养基的基础上，添加0.5~1% FAF-BSA，1~2g/l NaHCO3，10~15mM葡萄糖，100~200ng/mL Activin A和0.3~3μM CHIR99021；分化培养基II在RPIM1640培养基的基础上，添加0.5~1% FAF-BSA，1~2g/l NaHCO3，10~15mM葡萄糖，0.25~0.5mMvitamin C和50~100ng/ml FGF7；
优选地，添加0.5% FAF-BSA，1.5g/l NaHCO3，10mM葡萄糖，100ng/mL Activin A，3μM CHIR99021，0.25mM vitamin C和50ng/ml FGF7；
S2、诱导形成胰腺祖细胞
将上述获得的内胚层细胞依次在分化培养基III中培养2~4天，在分化培养基IV中培养3~5天；其中，分化培养基III在RPIM1640培养基的基础上，添加2.5~5g/l NaHCO3、10~15mM葡萄糖、2~5% FAF-BSA、0.25~0.5 mM维生素C、50~100ng/ml FGF7、0.25~0.5μM SANT-1、1~2μM retinoic acid、100~200nM LDN193189、1:200 ~1:100 ITS-X和200~300nM TPBPdBU/PKC Activator II；分化培养基IV在分化培养基III的基础上减少FGF7的用量，FGF7用量为2~5 ng/ml；
优选地，添加2.5g/l NaHCO3、10mM葡萄糖、2% FAF-BSA、0.25 mM维生素C、0.25μMSANT-1、1μM retinoic acid、100nM LDN193189、1:200 ITS-X和200nM TPB PdBU/PKCActivator II，分化培养基III添加50ng/ml FGF7，分化培养基IV添加2 ng/ml FGF7；
S3、诱导形成成熟胰岛类器官
将上述获得的胰腺祖细胞依次在在分化培养基V在培养3~5天，在分化培养基VI中培养6~10天，在分化培养基VII中培养6~14天；其中，分化培养基V在MCDB131培养基的基础上，添加1.5~2g/l NaHCO3，20~30mM 葡萄糖，2~3% FAF-BSA，0.25~0.5μM SANT-1，0.05~0.1μM retinoic acid维生素A酸，100~200nM LDN193189，1:200~1:100 ITS-X，1~2μM T3sodium，10~12μM ALK5 inhibitor II和中药小分子组合物；分化培养基VI在MCDB131培养基的基础上，添加1.5~2g/l NaHCO3，20~30mM 葡萄糖，2~3% FAF-BSA，100~200nMLDN193189，1:200~1:100 ITS-X，1~2μM T3 sodium，10~12μM ALK5 inhibitor II，100~200nM γ secretase inhibitor XX和中药小分子组合物；分化培养基VII在MCDB131培养基的基础上，添加1.5~2g/l NaHCO3，20~30mM 葡萄糖，2~3% FAF-BSA，100~200nMLDN193189，1:200~1:100 ITS-X，1~2μM T3 sodium，10~12μM ALK5 inhibitor II和中药小分子组合物；
优选地，添加1.5g/l NaHCO3，20mM 葡萄糖，2% FAF-BSA，0.25μM SANT-1，0.05μMretinoic acid维生素A酸，100nM LDN193189，1:200 ITS-X，1μM T3 sodium，10μM ALK5inhibitor II，100 nM γ secretase inhibitor XX；
中药小分子组合物包括葛根素0.1～5μM、甘草酸2～10μM、芦丁2～10μM、黄芩苷10～25μM、黄连素0.1～2μM；
优选地，分化培养基V中中药小分子组合物包括葛根素0.5～5μM、甘草酸2～6μM、芦丁3～8μM、黄芩苷5～15μM、黄连素0.2～1μM；
分化培养基VI中中药小分子组合物包括葛根素0.1～2μM、甘草酸2～6μM、芦丁1～3μM、黄芩苷15～25μM、黄连素0.2～1μM；
分化培养基VII中中药小分子组合物包括葛根素0.1～2μM、甘草酸2～6μM、芦丁1～3μM、黄芩苷15～25μM、黄连素0.2～1μM。
各中药小分子化合物分别溶于DMSO中制成储存液使用。
更优选地，分化培养基V中中药小分子组合物包括葛根素为2μM、甘草酸为2μM、芦丁为5μM、黄芩苷为10μM、黄连素为0.2μM；
分化培养基VI中中药小分子组合物包括葛根素0.1μM、甘草酸2μM、芦丁2μM、黄芩苷20μM、黄连素0.2μM；
分化培养基VII中中药小分子组合物包括葛根素0.1μM、甘草酸2μM、芦丁2μM、黄芩苷20μM、黄连素0.2μM。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
然而，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的内容不限于此。
实施例中用到的相关试剂示于表5。
实施例
体外诱导人多能干细胞定向分化为成熟胰岛类器官，具体步骤如下：
分化前，对人多能干细胞hPSC的多能性进行检测。如图1中a图-e图所示，表明hPSC具备良好的分化潜能。
S1、诱导形成内胚层细胞
人多能干细胞iPS传代2~3天后进行诱导分化培养，更换分化培养基I，培养4天，每天换液；之后更换分化培养基II，培养2天，每天换液，可获得内胚层细胞。
其中，分化培养基I在RPIM1640培养基的基础上，添加0.5% FAF-BSA，1.5g/lNaHCO3，10mM葡萄糖，100ng/mL Activin A和3μM CHIR99021；
分化培养基II在RPIM1640培养基的基础上，添加0.5% FAF-BSA，1.5g/l NaHCO3，10mM葡萄糖，0.25 mM vitamin C维生素C和50 g/ml FGF7。
通过免疫荧光方法对内胚层细胞标记物蛋白SOX17和FOXA2验证。具体方法为：用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，0.1% Triton X-100和5% 驴血清通透和封闭1小时。清洗后进行一抗孵育，4℃过夜。清洗后进行二抗孵育，室温2小时。清洗后进行DAPI细胞核染色5分钟。在倒置荧光显微镜（Leica，Dmi8）下进行荧光拍照，如图3中b图-c图，可见FOXA2和SOX17的高表达，证明本发明的诱导方法已将人多能干细胞分化为内胚层细胞。
S2、诱导形成胰腺祖细胞
将上述培养方法获得的内胚层细胞继续分化培养，更换分化培养基III，培养2天，每天换液；更换分化培养基IV，培养3天，每天换液，可获得胰腺祖细胞。
其中，分化培养基III在RPIM1640培养基的基础上，添加2.5g/l NaHCO3，10mM葡萄糖，2% FAF-BSA，0.25mM vitamin C，50ng/ml FGF7，0.25μM SANT-1，1μM retinoic acid，100nM LDN193189，1:200 ITS-X和200nM TPB PdBU/PKC Activator II。
分化培养基IV在RPIM1640培养基的基础上，添加2.5g/l NaHCO3，10mM 葡萄糖，2%FAF-BSA，0.25mM vitamin C，2ng/ml FGF7，0.25μM SANT-1，1μM retinoic acid维生素A酸，100nM LDN193189，1:200 ITS-X和200 nM TPB PdBU/PKC Activator II。
通过上述相同免疫荧光方法检测胰腺祖细胞标记物蛋白PDX1和SOX9，如图3中f图-g图，可见PDX1和SOX9的高表达，证明本发明的诱导方法已将内胚层细胞分化为胰腺祖细胞。
S3、诱导形成成熟胰岛类器官
将上述培养方法获得的胰腺祖细胞继续分化培养，更换分化培养基V，培养4天，每两天换液；更换分化培养基VI，培养6天，每天换液；更换分化培养基VII，培养6天，每天换液；最终可获得成熟胰岛类器官，如图2所示。
其中，分化培养基V在MCDB131培养基的基础上，添加1.5g/l NaHCO3，20mM 葡萄糖，2% FAF-BSA，0.25μM SANT-1，0.05μM retinoic acid维生素A酸，100nM LDN193189，1:200 ITS-X，1μM T3 sodium，10μM ALK5 inhibitor II和中药小分子组合物（葛根素2μM、甘草酸2μM、芦丁5μM、黄芩苷10μM、黄连素0.2μM）。
分化培养基VI在MCDB131培养基的基础上，添加1.5g/l NaHCO3，20mM葡萄糖，2%FAF-BSA，100nM LDN193189，1:200 ITS-X，1μM T3 sodium，10μM ALK5 inhibitor II，100nM γ secretase inhibitor XX和中药小分子组合物（葛根素0.1μM、甘草酸2μM、芦丁2μM、黄芩苷20μM、黄连素0.2μM）。
分化培养基VII在MCDB131培养基的基础上，添加1.5g/l NaHCO3，20mM 葡萄糖，2%FAF-BSA，100nM LDN193189，1:200 ITS-X，1μM T3 sodium，10μM ALK5 inhibitor II和中药小分子组合物（葛根素0.1μM、甘草酸2μM、芦丁2μM、黄芩苷20μM、黄连素0.2μM）。
通过上述相同免疫荧光方法可以检测到胰岛类器官中内分泌细胞的标记物蛋白INS、PDX1、NKX6.1（如图3中n图、o图、r图）和导管细胞标记物蛋白CK19（如图3中s图）。
通过流式细胞术检测胰岛类器官中β细胞（INS+细胞）的比例。具体为：利用胰蛋白酶将胰岛类器官消化为单细胞，用4%多聚甲醛固定30分钟，用Intracellular StainingPermeabilization Wash Buffer（Biolegend，421002）通透后加入抗体孵育。洗涤后用细胞筛过滤，用流式细胞仪（Beckman，CytoFLEX）进行检测。从图7中所示的实施例可以看出，本实施例产生的了大于70%的INS+细胞。
实验1 中药小分子组合物添加阶段的影响
表1 中药小分子组合物添加阶段列表
注：“+”代表添加中药小分子组合物，“-”代表未添加中药小分子组合物。
对照组
S1- S3阶段均不添加中药小分子组合物。
对比例1
与实施例的区别在于，将中药小分子组合物应用于S1阶段，且中药小分子组合物（葛根素2μM、甘草酸2μM、芦丁5μM、黄芩苷10μM、黄连素0.2μM）和中药小分子组合物（葛根素0.1μM、甘草酸2μM、芦丁2μM、黄芩苷20μM、黄连素0.2μM）分别添加至分化培养基I和分化培养基II中，其余操作均相同。
对比例2
与实施例的区别在于，将中药小分子组合物应用于S2阶段，且中药小分子组合物（葛根素2μM、甘草酸2μM、芦丁5μM、黄芩苷10μM、黄连素0.2μM）和中药小分子组合物（葛根素0.1μM、甘草酸2μM、芦丁2μM、黄芩苷20μM、黄连素0.2μM）分别添加至分化培养基III和分化培养基IV中，其余操作均相同。
对实施例、对照组、对比例1-2得到的类器官通过实时荧光定量PCR检测上述细胞标记物的基因表达情况。
具体为：用TRIZOL试剂裂解细胞，提取总RNA。使用PrimeScript™ RT reagentKit with gDNA Eraser（Takara，RR047A）试剂盒去除基因组DNA并进行反转录获得cDNA。使用TB Green® Premix Ex Taq™ II （Takara，RR820）试剂盒，以及相应引物进行反应体系配制。引物序列见表6。使用实时荧光定量PCR仪（Thermo Fisher, Step One Plus）进行检测并计算Ct值，用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量（如图4）。
实验2 中药小分子组合物在S3不同阶段的影响
表2 S3中药小分子组合物添加阶段列表
注：“+”代表添加中药小分子组合物，“-”代表未添加中药小分子组合物。
对比例3
与实施例的区别在于，将中药小分子组合物（葛根素0.1μM、甘草酸2μM、芦丁2μM、黄芩苷20μM、黄连素0.2μM）分别添加至分化培养基VI和分化培养基VII中，其余操作均相同。
对比例4
与实施例的区别在于，将中药小分子组合物（葛根素2μM、甘草酸2μM、芦丁5μM、黄芩苷10μM、黄连素0.2μM）和中药小分子组合物（葛根素0.1μM、甘草酸2μM、芦丁2μM、黄芩苷20μM、黄连素0.2μM）分别添加至分化培养基V和分化培养基VII中，其余操作均相同。
对比例5
与实施例的区别在于，将中药小分子组合物（葛根素2μM、甘草酸2μM、芦丁5μM、黄芩苷10μM、黄连素0.2μM）和中药小分子组合物（葛根素0.1μM、甘草酸2μM、芦丁2μM、黄芩苷20μM、黄连素0.2μM）分别添加至分化培养基V和分化培养基VI中，其余操作均相同。
对实施例、对比例3-5得到的类器官通过实时荧光定量PCR检测上述细胞标记物的基因表达情况。具体操作同前（如图5）。实验3 中药小分子组合物的协同作用
表3 各中药小分子添加情况列表
注：“+”代表添加中药小分子，“-”代表未添加中药小分子。
对比例6
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基V不添加葛根素，其余操作均相同。
对比例7
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基V不添加甘草酸，其余操作均相同。
对比例8
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基V不添加芦丁，其余操作均相同。
对比例9
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基V不添加黄芩苷，其余操作均相同。
对比例10
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例1的区别在于，分化培养基V不添加黄连素，其余操作均相同。
对比例11
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基VI不添加葛根素，其余操作均相同。
对比例12
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基VI不添加甘草酸，其余操作均相同。
对比例13
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基VI不添加芦丁，其余操作均相同。
对比例14
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基VI不添加黄芩苷，其余操作均相同。
对比例15
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基VI不添加黄连素，其余操作均相同。
对比例16
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基VII不添加葛根素，其余操作均相同。
对比例17
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基VII不添加甘草酸，其余操作均相同。
对比例18
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基VII不添加芦丁，其余操作均相同。
对比例19
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基VII不添加黄芩苷，其余操作均相同。
对比例20
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基VII不添加黄连素，其余操作均相同。
1、对对比例7-对比例20得到的类器官通过实时荧光定量PCR检测上述细胞标记物的基因表达情况。具体操作同前（如图6）。
2、对对比例7-对比例20得到的类器官通过流式细胞术检测胰岛类器官中β细胞（INS+细胞）的比例。具体操作同前（如图7）。
实验4 中药小分子的浓度的影响
表4不同中药小分子浓度添加情况列表
对比例21
本对比例提供的成熟胰岛类器官的系列培养基的制备方法，与实施例的区别在于，分化培养基V和VII所添加的中药小分子组合物浓度改变为葛根素2μM、甘草酸2μM、芦丁5μM、黄芩苷10μM、黄连素0.2μM，其余操作均相同。
对对比例21得到的类器官通过实时荧光定量PCR检测上述细胞标记物的基因表达情况。具体操作同前（如图8）。
结果与分析：
1、如图4所示，检测可见，与未添加中药小分子组合物的对照组、只在S1阶段添加中药小分子组合物的对比例1和只在S2阶段添加中药小分子组合物的对比例2相比较，在S3培养阶段添加中药小分子组合物可以显著提高胰岛类器官的INS和NKX6.1基因的表达量，证明只有在S3阶段添加中药小分子诱组合物可以促进胰岛类器官的成熟。
2、如图5所示，检测可见，与培养基V未添加中药小分子诱组合物的对比例3、培养基VI未添加中药小分子诱组合物的对比例4和培养基VII未添加中药小分子诱组合物的对比例5进行培养的胰岛类器官相比较，在S3培养阶段培养基V/VI/VII均添加中药小分子诱组合物的情况下，可以显著提高胰岛类器官的INS和NKX6.1基因的表达量，证明需要培养基V/VI/VII中同时添加中药小分子诱组合物可以促进胰岛类器官的成熟。
3、如图6所示，检测可见经中药小分子诱组合物处理的胰岛类器官的INS基因的表达量显著优于未经中药小分子诱组合物处理的胰岛类器官，且5种中药小分子的联合应用效果最佳。如图7所示，经中药小分子诱组合物处理的胰岛类器官中INS+细胞占比显著高于未经中药小分子诱组合物处理的胰岛类器官，且5种中药小分子的联合应用效果最佳。
4、如图8所示，与改变培养基VI和VII中中药小分子组合物浓度培养的胰岛类器官相比，本实施例所提供的中药小分子组合物浓度培养的胰岛类器官中INS和NKX6.1基因的表达量显著提高，证明改变培养基VI和VII中中药小分子组合物的浓度会显著影响胰岛类器官的成熟。
表5 相关试剂
表6 相关引物
表7 相关抗体
上述实验结果证明了本发明的诱导方法已将胰腺祖细胞分化为胰岛类器官，并且在中药小分子诱组合物的作用下，培养的胰岛类器官的成熟度优于未添加中药小分子诱组合物培养的胰岛类器官。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种中药小分子组合物促进胰岛类器官体外成熟的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
S1、诱导形成内胚层细胞
将多能干细胞依次在分化培养基I中培养2.5~4天，在分化培养基II中培养2~4天；其中，分化培养基I在RPIM1640培养基的基础上，添加0.5~1% FAF-BSA，1~2g/l NaHCO3，10~15mM葡萄糖，100~200ng/mL Activin A和0.3~3μM CHIR99021；分化培养基II在RPIM1640培养基的基础上，添加0.5~1% FAF-BSA，1~2g/l NaHCO3，10~15mM葡萄糖，0.25~0.5mMvitamin C和50~100ng/ml FGF7；
S2、诱导形成胰腺祖细胞
将上述获得的内胚层细胞依次在分化培养基III中培养2~4天，在分化培养基IV中培养3~5天；其中，分化培养基III在RPIM1640培养基的基础上，添加2.5~5g/l NaHCO3、10~15mM葡萄糖、2~5% FAF-BSA、0.25~0.5 mM维生素C、50~100ng/ml FGF7、0.25~0.5μM SANT-1、1~2μM retinoic acid、100~200nM LDN193189、1:200 ~1:100 ITS-X和200~300nM TPB PdBU/PKC Activator II；分化培养基IV在RPIM1640培养基的基础上，添加2.5~5g/l NaHCO3，10~15mM 葡萄糖，2~5% FAF-BSA，0.25~0.5 mM维生素C，2~5ng/ml FGF7，0.25~0.5μM SANT-1，1~2μM retinoic acid，100~200nM LDN193189，1:200 ~1:100 ITS-X和200~300 nM TPBPdBU/PKC Activator II；
S3、诱导形成成熟胰岛类器官
将上述获得的胰腺祖细胞依次在分化培养基V培养3~5天，在分化培养基VI中培养6~10天，在分化培养基VII中培养6~14天；其中，分化培养基V在MCDB131培养基的基础上，添加1.5~2g/l NaHCO3，20~30mM 葡萄糖，2~3% FAF-BSA，0.25~0.5μM SANT-1，0.05~0.1μMretinoic acid维生素A酸，100~200nM LDN193189，1:200~1:100 ITS-X，1~2μM T3 sodium，10~12μM ALK5 inhibitor II和中药小分子组合物；分化培养基VI在MCDB131培养基的基础上，添加1.5~2g/l NaHCO3，20~30mM 葡萄糖，2~3% FAF-BSA，100~200nM LDN193189，1:200~1:100 ITS-X，1~2μM T3 sodium，10~12μM ALK5 inhibitor II，100~200nM γ secretaseinhibitor XX和中药小分子组合物；分化培养基VII在MCDB131培养基的基础上，添加1.5~2g/l NaHCO3，20~30mM 葡萄糖，2~3% FAF-BSA，100~200nM LDN193189，1:200~1:100 ITS-X，1~2μM T3 sodium，10~12μM ALK5 inhibitor II和中药小分子组合物；
其中，分化培养基V中中药小分子组合物包括葛根素0.5～5μM、甘草酸2～6μM、芦丁3～8μM、黄芩苷5～15μM、黄连素0.2～1μM；
分化培养基VI中中药小分子组合物包括葛根素0.1～2μM、甘草酸2～6μM、芦丁1～3μM、黄芩苷15～25μM、黄连素0.2～1μM；
分化培养基VII中中药小分子组合物包括葛根素0.1～2μM、甘草酸2～6μM、芦丁1～3μM、黄芩苷15～25μM、黄连素0.2～1μM。
2.根据权利要求1所述的中药小分子组合物促进胰岛类器官体外成熟的方法，其特征在于：中药小分子组合物中的葛根素、甘草酸、芦丁、黄芩苷、黄连素分别溶于DMSO中制成储存液使用。
3.一种中药小分子组合物在促进胰岛类器官体外成熟上的应用，其特征在于：包括如下步骤：
S1、诱导形成内胚层细胞
将多能干细胞依次在分化培养基I中培养2.5~4天，在分化培养基II中培养2~4天；其中，分化培养基I在RPIM1640培养基的基础上，添加0.5~1% FAF-BSA，1~2g/l NaHCO3，10~15mM葡萄糖，100~200ng/mL Activin A和0.3~3μM CHIR99021；分化培养基II在RPIM1640培养基的基础上，添加0.5~1% FAF-BSA，1~2g/l NaHCO3，10~15mM葡萄糖，0.25~0.5mMvitamin C和50~100ng/ml FGF7；
S2、诱导形成胰腺祖细胞
将上述获得的内胚层细胞依次在分化培养基III中培养2~4天，在分化培养基IV中培养3~5天；其中，分化培养基III在RPIM1640培养基的基础上，添加2.5~5g/l NaHCO3、10~15mM葡萄糖、2~5% FAF-BSA、0.25~0.5 mM维生素C、50~100ng/ml FGF7、0.25~0.5μM SANT-1、1~2μM retinoic acid、100~200nM LDN193189、1:200 ~1:100 ITS-X和200~300nM TPB PdBU/PKC Activator II；分化培养基IV在RPIM1640培养基的基础上，添加2.5~5g/l NaHCO3，10~15mM 葡萄糖，2~5% FAF-BSA，0.25~0.5 mM维生素C，2~5ng/ml FGF7，0.25~0.5μM SANT-1，1~2μM retinoic acid，100~200nM LDN193189，1:200 ~1:100 ITS-X和200~300 nM TPBPdBU/PKC Activator II；
S3、诱导形成成熟胰岛类器官
将上述获得的胰腺祖细胞依次在分化培养基V培养3~5天，在分化培养基VI中培养6~10天，在分化培养基VII中培养6~14天；其中，分化培养基V在MCDB131培养基的基础上，添加1.5~2g/l NaHCO3，20~30mM 葡萄糖，2~3% FAF-BSA，0.25~0.5μM SANT-1，0.05~0.1μMretinoic acid维生素A酸，100~200nM LDN193189，1:200~1:100 ITS-X，1~2μM T3 sodium，10~12μM ALK5 inhibitor II和中药小分子组合物；分化培养基VI在MCDB131培养基的基础上，添加1.5~2g/l NaHCO3，20~30mM 葡萄糖，2~3% FAF-BSA，100~200nM LDN193189，1:200~1:100 ITS-X，1~2μM T3 sodium，10~12μM ALK5 inhibitor II，100~200nM γ secretaseinhibitor XX和中药小分子组合物；分化培养基VII在MCDB131培养基的基础上，添加1.5~2g/l NaHCO3，20~30mM 葡萄糖，2~3% FAF-BSA，100~200nM LDN193189，1:200~1:100 ITS-X，1~2μM T3 sodium，10~12μM ALK5 inhibitor II和中药小分子组合物；
其中，分化培养基V中中药小分子组合物包括葛根素0.5～5μM、甘草酸2～6μM、芦丁3～8μM、黄芩苷5～15μM、黄连素0.2～1μM；
分化培养基VI中中药小分子组合物包括葛根素0.1～2μM、甘草酸2～6μM、芦丁1～3μM、黄芩苷15～25μM、黄连素0.2～1μM；
分化培养基VII中中药小分子组合物包括葛根素0.1～2μM、甘草酸2～6μM、芦丁1～3μM、黄芩苷15～25μM、黄连素0.2～1μM。
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| CN116987660A (zh) | 2023-11-03 |
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| PB01 | Publication | ||
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