CN111808803B - 一种无血清的脂肪间充质干细胞的培养基及细胞培养方法 - Google Patents

一种无血清的脂肪间充质干细胞的培养基及细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无血清的脂肪间充质干细胞的培养基及细胞培养方法，属于细胞培养的技术领域，解决了传统培养基中的血清的引用带来的微生物污染、实验结果稳定性差的问题。培养基中的血清替代物的添加量为3.5~4.5%，包括以下组分：人血清蛋白、转铁蛋白、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、维生素B2、辅酶A、维生素B12、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子2型受体、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、促红细胞生成素、胰岛素样生长因子、胰岛素、重组人生长激素、蛋白酶抑制剂、L‑谷氨酰胺、转化生长因子、白细胞介素21、造血细胞生长因子等。本发明的培养基具有无微生物污染、实验过程稳定的优点。

Description

一种无血清的脂肪间充质干细胞的培养基及细胞培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养的技术领域，更具体地说，它涉及一种无血清的脂肪间充质干细胞的培养基及细胞培养方法。
背景技术
间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。间充质干细胞来源于多种组织：如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等。
2001年，研究者首次从人体脂肪组织的提取物中分离出具有多向分化潜能的细胞，将其命名为脂肪组织提取细胞(processde lipoaspirate cells，PLA细胞)，后称之为脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)。ADMSCs具有自我更新及多向分化潜能，同时具有横向的跨胚层分化能力。由于ADMSCs不仅具有来源广泛、取材容易等特点，而且不涉及伦理道德问题，因此可以作为组织工程的种子细胞。目前ADMSCs的研究已经成为近年来干细胞研究的热点之一。很多研究也已经证实ADMSCs具有向心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞等多谱系分化的潜能。这些研究结果对心肌、骨、软骨、神经等方面的再生具有重要意义。
目前对于脂肪来源的间充质干细胞的培养所采用的传统培养基是基础培养基加以胎牛血清后混合而成的，授权公告号为CN 101314766 B的发明专利公开了一种分离培养人脂肪间充质干细胞的方法及其专用培养基，该人脂肪间充质干细胞的分离培养用培养基，包括动物细胞基础培养基、胎牛血清、表皮生长因子和血小板衍生生长因子，其中胎牛血清的终浓度为1-200mL/L。授权公告号为CN 103857789 B的发明专利公开了一种制备间充质干细胞基础培养基和利用间充质干细胞基础培养基制备细胞治疗产品的方法及用该培养基得到的分化产品，其中L，间充质干细胞基础培养基包括选自胎牛、马或人的血清中的一种，且胎牛血清的添加量为10-20％。授权公告号为CN 104263697 B的发明专利公开了一种诱导培养基及诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的方法，其中该诱导培养基包括溶剂DMEM-高糖培养基和10％胎牛血清。
但是，虽然胎牛血清富含细胞体外培养所需要的生长因子，同时却也存在以下的不足：胎牛血清的具体成分不确定，不适合重复性实验；具有微生物污染(病毒，细菌，内毒素等)；伦理问题(胎牛的不正常死亡可获取胎牛血清)。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种无血清的脂肪间充质干细胞的培养基，其具有使得细胞培养过程安全无污染且培养得到的脂肪间充质干细胞纯度高，质量好的优点。
本发明的第二个目的在于提供一种利用无血清的脂肪间充质干细胞的培养基的细胞培养方法。
为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一种无血清的脂肪间充质干细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和血清替代物，所述血清替代物的添加量为基础培养基质量的3.5～4.5％，所述血清替代物包括以下组分，各组分的终浓度分别为：
人血清蛋白1～1.5g/L；白蛋白153～208mg/L；转铁蛋白8～12mg/L；纤粘连蛋白4～7mg/L；层粘连蛋白2～9mg/L；雌二醇2～4μg/L；维生素B2 256～261mg/L；辅酶A 150～167mg/L；维生素B12 187～249mg/L；牛磺酸1.8～3mg/L；丙酮酸7.23～29.42mg/L；西那卡塞35.74～71.48ng/L；血管内皮生长因子4～12μg/L；血管内皮生长因子2型受体5～14μg/L；表皮生长因子5～12μg/L；血小板衍生生长因子120～150μg/L；碱性成纤维细胞生长因子5～14μg/L；促红细胞生成素0.5～0.8μg/L；胰岛素样生长因子5～8μg/L；胰岛素2～4.5mg/L；重组人生长激素21～34mg；蛋白酶抑制剂2～3.6μg/L；胰酶抑制剂0.3～0.8mg/L；L-谷氨酰胺321～436mg/L；转化生长因子-α1～4μg/L；转化生长因子-β1～4μg/L；白细胞介素211.5～3.5μg/L；造血细胞生长因子1～2.5μg/L。
通过采用上述技术方案，其中纤粘蛋白(Fibronectin)，是一种高分子糖蛋白，分子量约为450KD，具有多种生物活性。大量国内外的研究结果证明，FN分子在进化过程中保守性很强，各种动物体液中的FN具有非常相近的结构、性质和生物学功能，因而不同来源的FN可以相互替代使用。其可以促进细胞的黏连生长，而细胞的黏连是机体结构得以维持、细胞生长完成的必要条件。因此，FN是细胞培养基的重要成分之一。
层粘连蛋白又称板层素其分子量为805kD，由一个400kD的α链和两条200kD左右的β链组成。它是构成细胞间质的一种非胶原糖，在肝内主要由内皮细胞及贮脂细胞合成，与胶原一起构成基底膜的成分。其生物功能是细胞黏着于基质的介质，并与多种基底膜成分结合，调节细胞生长和分化。
核黄素又称维生素B2，是组成生物呼吸链递氢体FMN和FAD的重要组分。
维生素B12又叫钴胺素，是唯一含金属元素的维生素。自然界中的维生素B12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B12。维生素B12是唯一的一种需要一种肠道分泌物(内源因子)帮助才能被吸收的维生素。有的人由于肠胃异常，缺乏这种内源因子，即使膳食中来源充足也会患恶性贫血。
辅酶A(简称CoA、CoASH或HSCoA)是一种辅酶，值得注意的是其在合成和氧化脂肪酸的角色，和在三羧酸循环中氧化丙酮酸。在人类中，辅酶A生物合成需要半胱氨酸、泛酸和三磷酸腺苷(ATP)。主要参与脂肪酸以及丙酮酸的代谢。
牛磺酸(Taurine，Tau)是动物体内一种结构简单的含硫氨基酸，化学名称为2-氨基乙磺酸，分子式为HO3S-CH2-CH2-NH2，分子量为125，对热稳定。牛磺酸是人体的条件必需氨基酸，对胎儿、婴儿神经系统的发育有重要作用。
丙酮酸在空气中颜色变暗。加热时缓慢聚合，富有反应性，容易与氮化物、醛、卤化物、磷化物等反应，参与生物体的糖代谢、胶质、氨基酸、蛋白质等的生化合成、代谢、醇的发酵等。当用力时，在肌肉中被还原为乳酸，休息时再次氧化并部分转变为糖原。大鼠经口LD502100mg/kg。丙酮酸是人体的一种成分，在人体内主要参与糖、脂肪等的代谢，也是碳水化合物代谢的中间产物之一。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，又称血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。
血管内皮生长因子2型受体(vascular endothelial growth factor receptor2，VEGFR2)。
表皮生长因子(EGF)是一种由53个氨基酸残基组成的耐热单链低分子多肽。EGF与靶细胞上的EGF受体特异性识别结合后，发生一系列生化反应，最终可促进靶细胞的DNA合成及有丝分裂。
VEGF(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其2型受体(vascularendothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)在血管再生过程中的作用已经逐渐被证实。研究表明，神经干细胞移植，能促进痴呆模型大鼠内血管的新生，且其血管新生过程由VEGF介导。VEGF与VEGFR2结合，可激活相应的下游蛋白(包括Raf1、ERK1/2)，进而促进血管再生。EPO可激活一系列信号通路，包括ERK1/2通路；创伤性脑损伤模型研究发现，外源性的EPO应用能够促使神经祖细胞分泌VEGF及VEGFR的表达，最终促进血管再生。
促红细胞生成素(EPO)又称红细胞刺激因子、促红素，是一种人体内源性糖蛋白激素，可刺激红细胞生成。
胰岛素样生长因子(insulin like growth factor，IGF)是一组具有促生长作用的多肽类物质，其分泌细胞广泛分布在人体肝、肾、肺、心、脑和肠等组织中。IGF族有IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ两种。IGF-Ⅰ的产生更依赖于生长激素(growth hormone，GH)，其促生长作用强，是儿童期的重要生长因子。各组织中合成的IGF-Ⅰ多以自分泌或旁分泌方式发挥其促生长的作用，而肝脏所合成的IGFⅠ则进入血循环，以内分泌方式作用于靶细胞。体内IGF-Ⅰ水平受GH的调控，IGF-Ⅰ对GH的分泌亦具有负反馈调节作用，IGF-Ⅱ的类胰岛素作用更强，对胎儿生长起重要作用。因此胰岛素样生长因子和重组人生长激素的添加促进其调节过程。
蛋白酶抑制剂和胰酶抑制剂的添加抑制细胞培养中剩余胰酶对细胞的伤害。
血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)是贮存于血小板α颗粒中的一种碱性蛋白质。是低分子量促细胞分裂素(100ng/ml)。
甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)是甲状旁腺主细胞分泌的碱性单链多肽类激素。它的主要功能是调节脊椎动物体内钙和磷的代谢，促使血钙水平升高，血磷水平下降。PTH促使血浆钙离子浓度升高，其作用的主要靶器官是骨和肾脏。它动员骨钙入血，促进肾小管对钙离子的重吸收和磷酸盐的排泄，使血钙浓度增加和血磷浓度下降。此外，PTH还间接促进肠道对钙离子的吸收。PTH的分泌主要受血浆钙离子浓度的调节。
L-谷氨酰胺：谷氨酰胺，学名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸，英文Glutamine(Gln)。是谷氨酸的酰胺。L-谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物非必需氨基酸，在体内可以由葡萄糖转变而来。谷氨酰胺是二十种非基本氨基酸中的一种。说它非基本并不意味着谷氨酰胺不重要，而是因为人体可以自己产生这种物质。
转化生长因子-α和转化生长因子-β是指两类多肽类生长因子。转化生长因子-α是由巨噬细胞，脑细胞和表皮细胞产生，可诱导上皮发育。
转化生长因子-β(Transforming growth factor beta，TGF-β)是一多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。
白细胞介素，是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。造血细胞生长因子是指一类促使造血干细胞分化的生长因子。上述的添加物之间相互影响，促进彼此的调节过程。
进一步地，所述血清替代物还包括抗炎抗敏物质，所述抗炎抗敏物质包括：地塞米松0.36～1.09mg/L；重组人TSG-6蛋白2～5mg/L。
通过采用上述技术方案，地塞米松是一种人工合成的皮质类固醇，抗炎、抗毒、抗过敏等。
重组人TSG-6蛋白：分泌抗炎蛋白TSG-6：是人工合成也是天然存在的糖皮质激素，抗炎作用为可的松的1.25倍，也具有免疫抑制作用、抗毒作用、抗休克及一定的盐皮质激素活性等，并有留水、留钠及排钾作用。
重组人TSG-6蛋白(hFc tag)为重组人TSG-6(Tumor necrosis factor-induciblegene 6protein)和人IgG1 Fc融合蛋白。人体内的TSG-6蛋白可能参与炎症及肿瘤生成中细胞-细胞、细胞-基质的相互作用，可结合透明质酸。
上述抗炎抗敏物质的添加使得制备得到的脂肪间进一步地，所述基础培养基为DMEM/F12。
为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：
一种利用上述无血清的脂肪间充质干细胞的培养基的细胞培养方法，所述方法包括以下步骤：
S1将血清替代物加入基础培养基中，制成含质量分数为3.5～4.5％的无血清的脂肪间充质干细胞的培养基；
S2将消化人脂肪组织后得到的收集细胞接种在所述无血清的脂肪间充质干细胞的培养基中培养72h即可。
进一步地，所述收集细胞的细胞密度为(1～2)×106个/mL。
进一步地，所述人脂肪组织的消化步骤包括：
取20mL的质量分数为0.25％的胰酶液加入到30mL的生理盐水中并混匀，得到消化液；
于细胞汇合度达到80％以上的脂肪组织中加入所述消化液，使得消化液充分浸润细胞液；
待镜下观察细胞变圆后，再加入所述消化液，均匀浸润细胞面后终止消化；
将细胞悬液离心，随后弃上清液，震散细胞沉淀即可。
综上所述，本发明具有以下有益效果：由于本发明采用血清替代物替代传统细胞培养基中血清，使得细胞培养过程中避免因引入血清而带来的微生物污染的问题；同时避免了因为血清的引入使得培养基中成分不确定而带来的细胞培养结果不稳定的问题。而本发明的脂肪间充质干细胞的培养基的血清替代物中以血管内皮生长因子、血管内皮生长因子2型受体和促红细胞生成素的组合促进其细胞分化中形成血管相关细胞；以表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和促红细胞生成素的组合促进生成表皮相关的细胞和组织，通过本发明的脂肪间充质干细胞的培养基培养得到的脂肪间充质干细胞纯度高，质量好。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明的原料为普通市售。
实施例
实施例1
本发明提供了一种无血清的脂肪间充质干细胞的培养基，该培养基包括基础培养基和血清替代物，血清替代物的添加量为基础培养基质量的4％，血清替代物包括以下组分，各组分的终浓度分别为：
人血清蛋白1.3g/L；白蛋白180mg/L；转铁蛋白10mg/L；纤粘连蛋白5.5mg/L；层粘连蛋白5.5mg/L；雌二醇3μg/L；维生素B2为259mg/L；辅酶A为159mg/L；维生素B12为214mg/L；牛磺酸2.4mg/L；丙酮酸18.33mg/L；西那卡塞53.61ng/L；血管内皮生长因子8μg/L；血管内皮生长因子2型受体9.5μg/L；表皮生长因子8.5μg/L；血小板衍生生长因子135μg/L；碱性成纤维细胞生长因子9.5μg/L；促红细胞生成素0.6μg/L；胰岛素样生长因子6.5μg/L；胰岛素3.3mg/L；重组人生长激素28mg；蛋白酶抑制剂2.8μg/L；胰酶抑制剂0.55mg/L；L-谷氨酰胺381mg/L；转化生长因子-α为2.5μg/L；转化生长因子-β为2.5μg/L；白细胞介素21为2.5μg/L；造血细胞生长因子1.8μg/L。
其中，基础培养基为DMEM/F12。
一种利用无血清的脂肪间充质干细胞的培养基的细胞培养方法，包括以下步骤：S1将上述的血清替代物按照上述比例加入DMEM/F12基础培养基中，制成含质量分数为4％的无血清的脂肪间充质干细胞的培养基；
S2将消化人脂肪组织后得到的收集细胞接种在所述无血清的脂肪间充质干细胞的培养基中培养72h即可。
进一步具体的操作为：
(一)人脂肪组织细胞的获取-细胞消化
取20mL的质量分数为0.25％的胰酶液加入到30mL的生理盐水中并混匀，得到消化液A；
将放置于T-175培养瓶中并按照常规要求存放的人脂肪组织细胞经细胞复苏换液之后72h，此时细胞汇合度达到80％以上，细胞复苏的培养过程在CO2培养箱中进行且其复苏过程为本领域技术人员公知。
随后打开CO2培养箱，T-175培养瓶转移至生物安全柜，平稳叠放，旋开瓶盖，用25mL移液管将培养瓶中的上清液移；
用10mL移液管吸取生理盐水，加入到T-175培养瓶，即生理盐水的添加量为10mL/瓶，随后晃动瓶身，润洗瓶底，吸弃洗液；
用25mL移液管吸取消化液A，按照5mL/瓶量沿T-175培养瓶非细胞面内壁加入，迅速晃动瓶身，充分浸润细胞面后，平放瓶身；
在显微镜下观察细胞变圆，竖立瓶身，用25mL移液管吸取上述制备得到的脂肪间充质干细胞的培养基，按照5mL/瓶量沿T-175培养瓶细胞面内壁加入，晃动瓶身，均匀浸润细胞面，即可终止消化。
(二)细胞传代培养：
用25mL移液管将T-175培养瓶中的细胞悬液吸出汇集至50mL离心管，随后旋紧管盖，在300g的条件下离心5min，取出离心管，倒弃上清液，震散细胞沉淀。然后将细胞沉淀倒入DMEM/F12基础培养基，定容至50ml，拧紧管盖，颠倒混匀，300g的条件下离心5min，取出离心管，倒弃上清液，震散细胞沉淀。
并管：取其中一管，用25mL移液管加入20mL的DMEM/F12基础培养基，晃动管身，重悬细胞沉淀后，转移至另一离心管，重复转移，直至将所有细胞并入1个50mL或250mL离心管中，记为离心管A。
随后重复上述的并管操作，将清洗液汇集至上述的离心管A中。
向离心管A中倒入制备得到的脂肪间充质干细胞的培养基，定容到适量体积：每个T-175加入制备得到的脂肪间充质干细胞的培养基的量为5mL，拧紧管盖，颠倒混匀。然后旋开管盖，用1mL移液管取出0.5mL细胞悬液进行细胞计数；向离心管中倒入制备得到的脂肪间充质干细胞的培养基，调整细胞密度为1×106个/mL，得到细胞悬液。
用25mL移液管吸取制备得到的脂肪间充质干细胞的培养基，按照28mL/瓶量加入新T-175培养瓶中，记为T-175培养瓶A，平稳叠放待用。
用5mL移液管吸取上述制备得到的细胞悬液，按照1.5mL/瓶量接种至T-175培养瓶A中，使得细胞密度为1.5×106个/瓶，将该培养瓶放入CO2培养箱中培养72h即可。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例的血清替代物的组分和各组分的浓度不同，各组分的具体终浓度分别为：
人血清蛋白1g/L；白蛋白153mg/L；转铁蛋白8mg/L；纤粘连蛋白4mg/L；层粘连蛋白2mg/L；雌二醇2μg/L；维生素B2为256mg/L；辅酶A为150mg/L；维生素B12为187mg/L；牛磺酸1.8mg/L；丙酮酸7.23mg/L；西那卡塞35.74ng/L；血管内皮生长因子4μg/L；血管内皮生长因子2型受体5μg/L；表皮生长因子5μg/L；血小板衍生生长因子120μg/L；碱性成纤维细胞生长因子5μg/L；促红细胞生成素0.5μg/L；胰岛素样生长因子5μg/L；胰岛素2mg/L；重组人生长激素21mg；蛋白酶抑制剂2μg/L；胰酶抑制剂0.3mg/L；L-谷氨酰胺321mg/L；转化生长因子-α为1μg/L；转化生长因子-β为1μg/L；白细胞介素21为1.5μg/L；造血细胞生长因子1μg/L。
其它同实施例1。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例的血清替代物的组分和各组分的浓度不同，各组分的具体终浓度分别为：
人血清蛋白1.5g/L；白蛋白208mg/L；转铁蛋白12mg/L；纤粘连蛋白7mg/L；层粘连蛋白9mg/L；雌二醇4μg/L；维生素B2为261mg/L；辅酶A为167mg/L；维生素B12为249mg/L；牛磺酸3mg/L；丙酮酸29.42mg/L；西那卡塞71.48ng/L；血管内皮生长因子12μg/L；血管内皮生长因子2型受体14μg/L；表皮生长因子12μg/L；血小板衍生生长因子150μg/L；碱性成纤维细胞生长因子14μg/L；促红细胞生成素0.8μg/L；胰岛素样生长因子8μg/L；胰岛素4.5mg/L；重组人生长激素34mg；蛋白酶抑制剂3.6μg/L；胰酶抑制剂0.8mg/L；L-谷氨酰胺436mg/L；转化生长因子-α为4μg/L；转化生长因子-β为4μg/L；白细胞介素21为3.5μg/L；造血细胞生长因子2.5μg/L。
其它同实施例1。
对比例1
本对比例和实施例4的区别在于，本对比例的血清替代物中不添加血管内皮生长因子2型受体。
对比例2
本对比例和实施例4的区别在于，本对比例的血清替代物中不添加重组人生长激素。
对比例3
本对比例和实施例4的区别在于，本对比例的血清替代物中不添加重组人TSG-6蛋白。
对比例4
本对比例与实施例4的区别在于，本对比例的血清替代物中的血管内皮生长因子、血管内皮生长因子2型受体和促红细胞生成素的终浓度不同，其终浓度分别为：血管内皮生长因子15μg/L；血管内皮生长因子2型受体17μg/L；促红细胞生成素1μg/L。
对比例5
本对比例与实施例4的区别在于，本对比例的血清替代物中的重组人生长激素、胰岛素样生长因子和胰岛素的终浓度不同，其终浓度分别为：重组人生长激素37mg；胰岛素样生长因子10μg/L；胰岛素5.5mg/L。
对比例6
本对比例与实施例4的区别在于，本对比例的培养基为于DMEM/F12基础培养基上添加4％的胎牛血清后得到。
将上述实施例1和对比例1-6培养后得到的脂肪间充质干细胞，鉴定其表面标志物，操作过程为常规操作，具体如下：于细胞汇合度达到80％以上的脂肪组织中加入质量分数为0.25％的胰酶液，取1×105个细胞，分别加入CD29、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14、HLA-DR抗体，混匀，避光孵育30min，其检测结果如表1所示。
表1不同培养基的人脂肪间充质干细胞的免疫表型表达
Figure BDA0002535190320000101
从表1可以看出，用本发明的培养基培养的人脂肪间充质干细胞，其检测阳性标志物表达高于传统含血清培养基(对比例6)，而阴性标记物表达低于传统含血清培养基。说明本发明的培养基获得的间充质干细胞纯度高，质量好。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (5)

1.一种无血清的脂肪间充质干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和血清替代物，所述血清替代物的添加量为基础培养基质量的3.5~4.5%，所述血清替代物包括以下组分，各组分的终浓度分别为：
人血清蛋白1~1.5 g/L；白蛋白153~208 mg/L；转铁蛋白8~12 mg/L；纤粘连蛋白4~7mg/L；层粘连蛋白2~9 mg/L；雌二醇2~4 μg/L；维生素B2 256~261 mg/L；辅酶A 150~167mg/L；维生素B12 187~249 mg/L；牛磺酸1.8~3 mg/L；丙酮酸7.23~29.42 mg/L；西那卡塞35.74~71.48 ng/L；血管内皮生长因子4~12 μg/L；血管内皮生长因子2型受体5~14 μg/L；表皮生长因子5~12 μg/L；血小板衍生生长因子120~150 μg/L；碱性成纤维细胞生长因子5~14 μg/L；促红细胞生成素0.5~0.8 μg/L；胰岛素样生长因子5~8 μg/L；胰岛素2~4.5 mg/L；重组人生长激素21~34 mg；蛋白酶抑制剂2~3.6 μg/L；胰酶抑制剂0.3~0.8 mg/L；L-谷氨酰胺321~436 mg/L；转化生长因子-α 1~4 μg/L；转化生长因子-β 1~4 μg/L；白细胞介素211.5~3.5 μg/L；造血细胞生长因子1~2.5 μg/L；
所述血清替代物还包括抗炎抗敏物质，所述抗炎抗敏物质包括：地塞米松0.36~1.09mg/L；重组人TSG-6蛋白2~5 mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种无血清的脂肪间充质干细胞的培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12。
3.一种利用权利要求1-2任一所述的无血清的脂肪间充质干细胞的培养基的细胞培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1将血清替代物加入基础培养基中，制成含质量分数为3.5~4.5%的无血清的脂肪间充质干细胞的培养基；
S2 将消化人脂肪组织后得到的收集细胞接种在所述无血清的脂肪间充质干细胞的培养基中培养72 h即可。
4.根据权利要求3所述的一种利用无血清的脂肪间充质干细胞的培养基的细胞培养方法，其特征在于，所述收集细胞的细胞密度为（1~2）×106个/mL。
5.根据权利要求3所述的一种利用无血清的脂肪间充质干细胞的培养基的细胞培养方法，其特征在于，所述人脂肪组织的消化步骤包括：
取20 mL的质量分数为0.25%的胰酶液加入到30 mL的生理盐水中并混匀，得到消化液；
于细胞汇合度达到80%以上的脂肪组织中加入所述消化液，使得消化液充分浸润细胞液；
待镜下观察细胞变圆后，再加入所述消化液，均匀浸润细胞面后终止消化；
将细胞悬液离心，随后弃上清液，震散细胞沉淀即可。
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