CN105112363A - 一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分：L-谷氨酰胺、谷胱甘肽、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖。本发明属于干细胞技术领域，本发明提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，能促进细胞的快速贴壁和快速增殖，保持良好的干细胞幼稚形态和干细胞特性。

Description

一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，涉及一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

人脂肪间充质干细胞（adipose-derivedstemcells，ADSCs）是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖，同时具有来源丰富，体内储备量大，取材比骨髓等容易，少量组织即可获取大量干细胞，衰亡率低等优点。成体脂肪组织来源的间充质干细胞在临床上具有很高的应用价值，广泛应用于组织工程及再生医学领域。

1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-Pentagalloylglucose，PGG）是从药用植物余甘子中提取得到的化合物，CAS登录号为14937-32-7。中国专利申请200910040157.6公开了1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖的抗流感病毒方面的用途。

传统的含动物血清的干细胞培养基给干细胞的生产与科研带来多种不利因素。血清能为干细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸多缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。

无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，既能满足干细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因此，发展无血清培养基是干细胞走向临床应用的重要条件。目前已有一些市售干细胞无血清培养基，但是现有市售无血清培养基存在细胞增殖不够理想、价格昂贵等缺陷。

中国专利申请201210197360.6公开了一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基，该培养基以高糖型DMEM为基础培养基，添加了牛磺酸、还原型谷胱甘肽和铜蓝蛋白等组分，但存在细胞贴壁性差、增殖缓慢、组分较复杂的缺陷。

中国专利申请201310134502.9公开了一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基，该培养基以低糖型DMEM为基础培养基，虽然添加了碱性成纤维生长因子、肝素和谷氨酰胺等组分，但脂肪间充质干细胞的生长增殖效果不够理想。

因此，现有技术存在细胞贴壁性差，组分复杂，细胞增殖速率不够理想等问题。

发明内容

为解决现有技术中存在的细胞贴壁性差，组分复杂，细胞增殖速率不够理想等问题，发明人通过大量试验筛选，得到一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，该培养基的使用无需培养瓶进行包被，细胞贴壁性良好，细胞增殖速率高，保持良好的干细胞幼稚形态和干细胞特性，降低了成本。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。

本发明提供一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺1~6mM、谷胱甘肽1~20μg/mL、重组人胰岛素1~10μg/mL、人血清白蛋白0.01~1mg/mL、转铁蛋白0.15~10μg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖0.04~20μM。

上述组分及其浓度是发明人经大量试验筛选确定的。上述组分中，L-谷氨酰胺作为一种必需氨基酸，在细胞培养过程中起到重要作用，可作为细胞新陈代谢的二次能量来源；谷胱甘肽具有抗氧化作用，有利于维持细胞生物功能；重组人胰岛素可提高合成代谢能力，刺激细胞生长；人血清白蛋白能提供细胞生长所需的营养物质，还可调节渗透压，保护细胞免受机械损伤；转铁蛋白是血浆中主要的铁传递蛋白，为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁；1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-Pentagalloylglucose，PGG）促进了人脂肪间充质干细胞的快速贴壁和快速增殖，并能够维持脂肪干细胞的干细胞幼稚形态和干细胞特性。

优选地，本发明提供的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺2~6mM、谷胱甘肽10~20μg/mL、重组人胰岛素5~10μg/mL、人血清白蛋白0.5~1mg/mL、转铁蛋白3~5μg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖5~15μM。

优选地，本发明提供的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺4mM、谷胱甘肽12μg/mL、重组人胰岛素8μg/mL、人血清白蛋白1mg/mL、转铁蛋白3.5μg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖10μM。

优选地，所述DMEM基础培养基为高糖型DMEM基础培养基或低糖型DMEM基础培养基。

优选地，本发明提供的无血清培养基，还包括链霉素，链霉素的浓度为100μg/mL。

优选地，所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽。

相应地，本发明还提供人脂肪间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入L-谷氨酰胺、谷胱甘肽、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖，混匀，过膜除菌即得。

此外，本发明还提供人脂肪间充质干细胞的无血清培养基在人脂肪间充质干细胞培养中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，与传统的含血清培养基相比，本发明提供的培养基促进了人脂肪间充质干细胞的快速贴壁，培养的人脂肪间充质干细胞能够保持较好的干细胞幼稚形态，具有更好的细胞增殖速率和细胞干性，降低了成本。本发明提供的制备方法简单，制得的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基用于人脂肪间充质干细胞的培养，培养获得的细胞表现出优异的细胞性能。

附图说明

图1含不同浓度PGG的培养基对人脂肪间充质干细胞增殖的影响。

图2人脂肪间充质干细胞在不同培养基中的增殖曲线。

图3培养基1和培养基2培养P10代人脂肪间充质干细胞的形态图。

图4人脂肪间充质干细胞的干性基因NanogmRNA相对表达量结果图。

图5人脂肪间充质干细胞的干性基因Oct-4mRNA相对表达量结果图。

图6人脂肪间充质干细胞的干性基因Sox-2mRNA相对表达量结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明中的各组分均为常规市售产品，例如1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖购自成都普瑞法科技开发有限公司，货号BP0001。本发明中，培养基1：本发明实施例二提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基；培养基2：高糖型DMEM基础培养基+10%体积百分比的胎牛血清。

实施例一含不同浓度PGG的培养基对细胞增殖的影响

发明人进行大量试验筛选得到本发明提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基配方，并进一步对PGG的浓度影响进行了考察。

将PGG粉末用DMSO溶解成100mM母液，分别用高糖型DMEM基础培养基将PGG母液稀释成20μM、15μM、10μM、7.5μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.63μM、0.31μM、0.16μM、0.08μM与0.04μM的PGG溶液。

将P1代人脂肪间充质干细胞以10⁴个/mL的密度接种于96孔板中，分别用含不同浓度PGG的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基（与实施例二提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基的区别在于PGG浓度不同）培养，每孔100μL，以不加PGG的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基为对照组。置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中继续培养，分别于24h、48h与72h之后，用MTT检测方法，测定每孔的吸光值，将加入PGG处理组的吸光值与不加PGG的对照组的吸光值相对比，求算添加不同浓度PGG后的细胞存活率，结果如图1所示。从图1可知，当PGG浓度达到1.25μM时，存活率呈现升高的趋势，并随着浓度的增加而升高；当PGG浓度达到10μM时，存活率达到峰值，并随着浓度的增加而降低。

实施例二人脂肪间充质干细胞的无血清培养基

人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺4mM、还原型谷胱甘肽12μg/mL、重组人胰岛素8μg/mL、人血清白蛋白1mg/mL、转铁蛋白3.5μg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖10μM。

制备方法：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入L-谷氨酰胺、谷胱甘肽、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖，混匀，过膜除菌即得。

实施例三人脂肪间充质干细胞的无血清培养基

人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺2mM、还原型谷胱甘肽10μg/mL、重组人胰岛素5μg/mL、人血清白蛋白0.7mg/mL、转铁蛋白5μg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖5μM。

制备方法与实施例二类似。

实施例四人脂肪间充质干细胞的无血清培养基

人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括低糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺6mM、还原型谷胱甘肽15μg/mL、重组人胰岛素10μg/mL、人血清白蛋白0.5mg/mL、转铁蛋白3μg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖15μM。

制备方法与实施例二类似。

实施例五人脂肪间充质干细胞在不同培养基中的增殖

将P1代人脂肪间充质干细胞以5000个/mL的密度接种到6孔板中，接种2mL，分别用培养基1和培养基2培养，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，每3天将细胞用0.25%胰酶消化，计算细胞量，然后以5000个/mL的密度再次接种培养，直到第5代，根据每个代次的细胞数量，绘制细胞增殖曲线，结果如图2所示。从图2可知，本发明优选的无血清培养基所培养的细胞增殖速率明显大于传统的含血清培养基。

分别用培养基1和培养基2对P1代人脂肪间充质干细胞进行培养，培养至P10代时的细胞形态图如图3所示。从图3可知，经培养基1培养的细胞保持了较好的干细胞幼稚形态，未出现老化迹象，而经培养基2培养的细胞呈现老化迹象。

实施例六人脂肪间充质干细胞在不同培养基中的干性基因表达

将P1代人脂肪间充质干细胞以3×10⁵个人脂肪间充质干细胞的密度接种到6孔板中，接种2mL，分别用培养基1和培养基2培养，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，培养48h之后提取RNA，反转录，采用实时荧光定量q-PCR检测干性相关基因Oct-4、Sox-2、NanogmRNA相对表达量，结果如图4至图6所示。从图4至图6可知，培养基1所培养的人脂肪间充质干细胞的干性基因表达明显优于培养基2培养的人脂肪间充质干细胞。

实施例七人脂肪间充质干细胞的表面抗原分析

使用实施例二提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基培养至P5代人脂肪间充质干细胞时，使用流式细胞仪对人脂肪间充质干细胞进行CD29、CD45、CD105、CD34、CD44、HLA-DR等表面抗原的分析，结果：CD29、CD44、CD105的表达为阳性；CD45、CD34、HLA-DR的表达为阴性。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺1~6mM、谷胱甘肽1~20μg/mL、重组人胰岛素1~10μg/mL、人血清白蛋白0.01~1mg/mL、转铁蛋白0.15~10μg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖2.5~20μM。

2.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺2~6mM、谷胱甘肽10~20μg/mL、重组人胰岛素5~10μg/mL、人血清白蛋白0.5~1mg/mL、转铁蛋白3~5μg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖5~15μM。

3.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺4mM、谷胱甘肽12μg/mL、重组人胰岛素8μg/mL、人血清白蛋白1mg/mL、转铁蛋白3.5μg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖10μM。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：所述DMEM基础培养基为高糖型DMEM基础培养基或低糖型DMEM基础培养基。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：还包括链霉素，链霉素的浓度为100μg/mL。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽。

7.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入L-谷氨酰胺、谷胱甘肽、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖，混匀，过膜除菌即得。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基在人脂肪间充质干细胞培养中的用途。