CN112662623A

CN112662623A - 无血清干细胞培养基及其应用

Info

Publication number: CN112662623A
Application number: CN202110096731.0A
Authority: CN
Inventors: 关方霞; 冯娟; 崔南征; 郭军辉
Original assignee: Zhongke Bosheng Bioengineering Co ltd
Current assignee: Zhongke Bosheng Bioengineering Co ltd
Priority date: 2021-01-25
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及无血清干细胞培养基，在基础培养中添加12‑25mg/mL聚乳酸营养微球、1‑10μg/mL谷胱甘肽、1‑4mM L‑谷氨酰胺、浓度40‑60μMβ‑巯基乙醇、0.01‑1mmol/L维A酸和1‑10v/v％非必需氨基酸。本发明还将将上述无血清干细胞培养基用于培养干细胞。本发明提供的无血清干细胞培养基不含动物来源血清，批次间稳定无干扰，有利于产物的分离纯化，缩短适应期，具有更好的细胞增殖速率，使细胞的干性、增殖能力和生理代谢活动能维持更好对抗细胞衰老和凋亡。

Description

无血清干细胞培养基及其应用

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及无血清干细胞培养基及其应用。

背景技术

干细胞及其代表的再生医学领域研究近二十年来不断取得重大技术突破，引发了人们对干细胞技术产业化及临床应用的高度重视。截止到2019年，全球已有16款干细胞产品上市，其中间充干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)由于具有多种优点而成为产品最多，发展最为迅猛的干细胞类型。间充质干细胞来源于发育早期的中胚层，是一类非造血干细胞，其广泛存在于骨髓、皮下脂肪、骨外膜、肌肉、滑膜、滑液、肝脏、外周组织、脐带、脐带血及胎盘等组织。干细胞培养使用有血清培养基或无血清培养基。血清培养基大都含有动物血清，血清的成分复杂如最为常见的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，血清批间差异、成本高等问题，越来越多的科学家通过研究手段确定配细胞生长所需的营养物质成分，并通过试验确定了可以促进细胞生长时这些营养物质在培养基中的最低含量，从而丰富了人们对无血清培养基的认识。无血清培养基一般由基础培养基和替代血清的添加剂两部分组成。基础培养基通常由葡萄糖、氨基酸、无机盐和维生素等按一定比例的组合而成；而添加剂替代了传统培养基中的血清，既能有效避免血清带来的诸多问题，也能满足动物细胞培养的要求。现有技术中的无血清培养基细胞增殖率低，且极易分化或、易引起成体干细胞衰老和凋亡，严重影响了干细胞的数量和质量。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了无血清干细胞培养基，目的是为了解决现有技术中的无血清培养基细胞增殖率低，且极易分化或、易引起成体干细胞衰老和凋亡，严重影响了干细胞的数量和质量的技术问题。

本发明提供的无血清干细胞培养基，具体技术方案如下：

无血清干细胞培养基，在基础培养中添加12-25mg/mL聚乳酸营养微球、1-10μg/mL谷胱甘肽、1-4mM L-谷氨酰胺、浓度40-60μMβ-巯基乙醇、0.01-1mmol/L维A酸和1-10v/v％非必需氨基酸。

某些实施方式中，所述聚乳酸营养微球的制备方法如下：

将聚乳酸溶于二氯甲烷形成聚乳酸溶液；并将胰岛素、转铁蛋白、BMP-4、FGF-2和细胞生长因子添加进入聚乳酸溶液中形成复合营养液，将所述复合营养液喷雾至60-70℃的水中后进行干燥处理，获得聚乳酸营养微球。

某些实施方式中，胰岛素、转铁蛋白、BMP-4、FGF-2、细胞生长因子和聚乳酸的质量比为0.1-0.5)：(0.01-0.05)：(0.01-0.05)：(0.01-0.05)：(0.3-0.7)：1。

某些实施方式中，所述基础培养基为DEME培养基。

某些实施方式中，所述非必须氨基酸由谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸组成。

无血清干细胞培养基的应用，将上述无血清干细胞培养基用于培养干细胞。

某些实施方式中，所述干细胞的培养的条件为5％CO₂、37℃，密度接种为(0.1-10)×10⁵个/mL。

本发明具有以下有益效果：与传统的含血清培养基相比，本发明提供的无血清干细胞培养基不含动物来源血清，批次间稳定无干扰，有利于产物的分离纯化；并且能够更快的贴壁，缩短适应期，具有更好的细胞增殖速率。聚乳酸具有优良的生物可降解性，其降解的最终产物是二氧化碳和水，不会对环境造成污染，是一种完全自然循环型的可生物降解材料，可以替代血清白蛋白在培养基的载体作用，有效提高干细胞的增殖能力；此外，聚乳酸形成纳米微球对营养物质进行包裹，使营养物质在培养过程中更加稳定，其中各中成分的独特效果和协同作用，使细胞的干性、增殖能力和生理代谢活动能维持更好对抗细胞衰老和凋亡。并且本发明采用维A酸，显著提高了干细胞的增殖能力。

附图说明

图1是本发明提供的聚乳酸营养微球流程图；

图2是干细胞生长曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图1-2，对本发明进一步详细说明。

实施例1

将1g聚乳酸溶于100ml的二氯甲烷形成聚乳酸溶液；并将0.1g的胰岛素、10mg的转铁蛋白、10mg的BMP-4、10mg的FGF-2和0.3g的细胞生长因子添加进入上述聚乳酸溶液中形成复合营养液，将所述复合营养液喷雾至60℃的水中后进行干燥处理，获得聚乳酸营养微球。

在DMEM基础培养基中加入25mg/ml的配置好的上述聚乳酸营养微球、1μg/mL谷胱甘肽、1mM L-谷氨酰胺、浓度40μMβ-巯基乙醇、0.01mmol/L维A酸和1v/v％非必需氨基酸(由谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸组成)，获得无血清干细胞培养基。

实施例2

将1g聚乳酸溶于100ml的二氯甲烷形成聚乳酸溶液；并将0.2g的胰岛素、25mg的转铁蛋白、25mg的BMP-4、25mg的FGF-2和0.5g的细胞生长因子添加进入上述聚乳酸溶液中形成复合营养液，将所述复合营养液喷雾至65℃的水中后进行干燥处理，获得聚乳酸营养微球。

在DMEM基础培养基中加入18mg/ml的配置好的上述聚乳酸营养微球、8μg/mL谷胱甘肽、2mM L-谷氨酰胺、浓度50μMβ-巯基乙醇、0.5mmol/L维A酸和4v/v％非必需氨基酸(由谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸组成)，获得无血清干细胞培养基。

实施例3

将1g聚乳酸溶于100ml的二氯甲烷形成聚乳酸溶液；并将0.5g的胰岛素、50mg的转铁蛋白、50mg的BMP-4、150mg的FGF-2和0.7g的细胞生长因子添加进入上述聚乳酸溶液中形成复合营养液，将所述复合营养液喷雾至70℃的水中后进行干燥处理，获得聚乳酸营养微球。

在DMEM基础培养基中加入12mg/ml的配置好的上述聚乳酸营养微球、10μg/mL谷胱甘肽、4mM L-谷氨酰胺、浓度60μMβ-巯基乙醇、1mmol/L维A酸和10v/v％非必需氨基酸(由谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸组成)，获得无血清干细胞培养基。

实施例4

取生长良好的第三代干细胞，分别接种到实施例1、实施例2、实施例3和对照例的培养基(含10％FBS的完全培养基)中吹打均匀，细胞接种密度在1×10⁵个/mL，置细胞培养箱(5％CO₂、37℃)中培养两周。通过MTT发检测细胞存活率。如图2所示，相比于对照例，实施例组中的细胞增殖效率显著提高。比较同期培养获得活细胞数量，实施例组显著高于对比例组，本发明提供的干细胞无血清培养基的培养效率明显高于对比例提供的有血清干细胞培养基。

上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.无血清干细胞培养基，其特征在于，在基础培养中添加12-25mg/mL聚乳酸营养微球、1-10μg/mL谷胱甘肽、1-4mM L-谷氨酰胺、浓度40-60μMβ-巯基乙醇、0.01-1mmol/L维A酸和1-10v/v％非必需氨基酸。

2.根据权利要求1所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，所述聚乳酸营养微球的制备方法如下：

3.根据权利要求2所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，胰岛素、转铁蛋白、BMP-4、FGF-2、细胞生长因子和聚乳酸的质量比为(0.1-0.5)：(0.01-0.05)：(0.01-0.05)：(0.01-0.05)：(0.3-0.7)：1。

4.根据权利要求1所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为DEME培养基。

5.根据权利要求1所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，所述非必须氨基酸由谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸组成。

6.无血清干细胞培养基的应用，其特征在于，将权利要求1-5中任一项所述无血清干细胞培养基用于培养干细胞。

7.根据权利要求6所述的无血清干细胞培养基的应用，其特征在于，所述干细胞的培养的条件为5％CO₂、37℃，密度接种为(0.1-10)×10 ⁵个/mL。