KR20140061263A - 인간 간엽 줄기세포용 배지 - Google Patents
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Abstract
인간 간엽 줄기세포용 배양 배지. 본 발명은 인간 간엽 줄기세포 (hMSC)용 새로운 배양 배지에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 이 타입의 세포들에 통상적으로 사용된 배양 배지에서 성장하지 않는 세포들을 포함하는, hMSC 주가 성장할 수 있는 배양 배지에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인간 간엽 줄기세포 (human mesenchymal stem cells (hMSC))용 새로운 배양 배지 (culture medium)에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은, 세포들이 특별한 배양 매체에 적용되기 때문에, 이 타입의 세포들에 통상적으로 사용된 배양 매체 (culture media)에서 성장하지 않는 세포들을 포함하는, hMSC 주 (lines)가 성장할 수 있는 배양 배지에 관한 것이다.
MSC는 많은 것들 가운데, 뼈, 연골, 힘줄, 근육과 지방 조직과 같은 다양한 간엽 조직으로 분화할 수 있는 이들의 능력을 기본적으로 특징으로 하는 다분화능 세포 (multipotent cell)이다. hMSC는 골수, 지방 조직 (adipose tissue) 및 탯줄 (umbilical cord) 의 혈액에서 발견될 수 있는 조직을 포함하는, 성체의 다양한 조직으로부터 분리될 수 있다.
hMSC의 항-증식 (anti-proliferative), 면역 조절 (immunomodulating) 및 항-염증 효과는 이식편 대 숙주 질환, 고형 장기 및 자가 면역 질환의 이식 후 거부를 포함하는, 면역계에 의해 유발된 질환에 잠재적 치료제로서, 이들 세포가 관심의 중심에 있다.
hMSC의 생체 외 배양에 대해 이들의 다잠재적 (pluripotential) 능력을 보존하는 것이 필수적이고, 이를 위해 정상 배양 매체에, 예를 들어, 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor (bFGF)), 상피세포 성장인자 (epidermal growth factor (EGF)) 및 형질전환 성장인자 (transforming growth factor) (TGFβ-1)와 같은 외인성 인자 (exogenous factor)의 첨가가 요구된다는 것이 알려져 있다. 그러나 대부분 hMSC는 특별한 배양 배지에 의존하고, 또한 간엽 줄기세포 (MSCQ)에 대해 적합한 우태아 혈청 (bovine foetal serum)으로 보충된 DMEM/F12 배지와 같은 간엽 줄기세포의 배양을 위해 종래에 사용되어왔던 매체 상에서는 배양할 수 없다.
이러한 문제점들을 극복하기 위하여, 본 발명은 다른 배양 배지 제제에서 성장되지 않는 hMSC가 성장할 수 있는 hMSC용 새로운 배양 배지에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 배양 배지는:
a) 간엽 줄기세포의 배양을 위해 일반적으로 사용된 기본 배지;
b) 인간 백혈구/혈소판 코트 용해물 (coat lysate) (연막 (buffy coat); LBC);
c) 인슐린;
d) 아셀렌산 나트륨 (sodium selenite);
e) 에탄올아민;
f) 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF)을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같은, 용어 "배양 배지"는 세포의 배양, 성장 또는 증식을 위한 영양 용액 (nutrient solution)을 의미한다. 상기 용어 "세포 배양"은 인공적 생체 외 환경에서 유지된, 배양된 또는 성장된 세포를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "기본 매체" 또는 "기본 배지"는 인간 간엽 세포가 다른 첨가물로 보충된 경우 성장할 수 있는 어떤 배지를 의미하고, 이것은 혈청을 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 기본 매체는 비타민, 글루코오스, 버퍼 시스템 및 필수 아미노산과 함께, 아연, 철, 마그네슘, 칼슘 및 칼륨과 같은 표준 무기 염을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 배양 배지에서 간엽 세포의 배양을 위해 일반적으로 사용된 바람직한 기본 배지는 Harry Eagle에 의해 개발된 최소 필수 배지, 및 CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포의 성장을 위해 Ham에 의해 개발된, Ham's F12 배지의 변형이고, DMEM/F12 배지가 Dubelcco's Modified Eagle Medium (DMEM)의 동등 부분의 혼합물인, DMEM/F12 + 피루브산염 (pyruvate), 인간 세포의 성장을 위해 감소된 혈청 첨가물을 갖는 배지로서 Knedler 및 Ham에 개발된 배지인, Ham's F10, Ham's F12, MCDB 131, 또는 Roswell Park Memorial Institute의 첫 글자로부터 유도된 이름이고, 비록 세포의 다른 세포 타입을 성장시킬 수 있게 적절히 보충될지라도, 정상 및 신생물 림프구 (neoplastic lymphocyte)의 배양을 위해 Moore 및 공동-연구자에 의해 개발된, RPMI 1640이다. 이들 매체의 제제 및 조성은 널리 알려져 있고, 예를 들어, Gibco (Life Technologies)와 같은, 어떤 생산자 또는 공급자로부터 얻어질 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 배지는 DMEM/F12 + 피루브산염이다.
본 발명에 따른 인간 간엽 세포용 배양 배지의 성분 중 하나는 백혈구/혈소판 코트 용해물이다. 상기 백혈구/혈소판 코트는, 또한 "연막 (buffy coat)"으로 알려져 있고, 전혈의 원심분리 또는 침전 후 혈장 및 적혈구 사이에 관찰된 코트이다. 이것은 기본적으로 백혈구 및 혈소판을 포함한다. 상기 백혈구/혈소판 코트 용해물 (연막)은 5 및 20% (v/v) 사이, 더욱 바람직하게는 7 및 15% (v/v) 사이, 가장 바람직하게는 10% (v/v)의 양으로 본 발명에 따른 배양 배지에 존재한다.
본 발명에 따른 배양 배지의 성분 중 또 하나는 인슐린이다. 세포 성장에 인슐린의 이로운 효과는 알려져 있다 (Cartwright, T. y Shah, G.P Culture media. Basic cell culture, 2nd edition, Davis, J.M. ed. 2002. Oxford University Press, New York, USA). 본 발명에 따른 배양 배지에 있어서, 인슐린은 바람직하게는 2 및 20 mg/L 사이, 더욱 바람직하게는 5 및 15 mg/L 사이, 가장 바람직하게는 10 mg/L의 양으로 존재한다.
본 발명에 따른 또 다른 성분은 아셀렌산 나트륨의 형태의 셀레늄이다. 셀레늄은 혈청에 의해 배양 배지에 일반적으로 제공되는 미량원소이고, 이에 대해 필수적일 수 있다. 아셀렌산 나트륨은 0.005 및 1.730 mg/L 사이의 양으로 상기 배양 배지에 존재한다.
더구나, 본 발명에 따른 인간 간엽 세포에 대한 배양 배지는 에탄올아민을 포함한다. 에탄올아민은 세포막의 구조를 촉진한다고 알려져 있다. 본 발명에 따른 배양 배지에서 에탄올아민은 1 및 8 mg/L 사이, 바람직하게는 2 및 5 mg/L 사이의 양으로 존재한다.
최종적으로 본 발명에 따른 간엽 세포를 위한 배양 배지는 또한 bFGF를 포함한다. 상기 bFGF는 간엽 세포를 배양하는데 권장되는 것으로 알려져 있다 (Sato, J. et al. Specific cell types and their requirements. Basic cell culture, 2nd edition, Davis, J.M. ed. 2002. Oxford University Press, New York, USA). 상기 bFGF는 5 및 25 ng/mL 사이의 양으로 본 발명에 따른 상기 배양 배지에 존재한다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 상기 배양 배지에서 성분의 조합으로, 이것은 일반적으로 상업적으로 시판되고 있는 다른 배양 매체에 적용된 것을 포함하는, 예를 들어, Lonza 또는 PromoCell에 의해 제공된 인간 간엽 세포와 같은, 이러한 타입의 세포에 대해 일반적으로 사용된 배양 매체에서 성장하지 않는, 인간 간엽 세포주를 배양하는 것이 가능하다.
선택적으로 본 발명에 따른 배양 배지는 항생물질 (antibiotic)을 포함한다. 이러한 타입의 세포를 배양하는 데 사용된 일반적인 어떤 항생물질은 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 항생물질은 젠타마이신-암포테리신 (gentamycin-amphotericin)의 혼합물이다. 상기 배양 배지에서 사용되는 항생물질의 양은 기술 분야에서 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
간엽 줄기 세포의 성장을 위하여, 본 발명에 따른 상기 배양 배지는, 예를 들어, 우태아 혈청 (foetal bovine serum (FBS)) 또는, 예를 들어, 미국 특허 8,252,590 B2에서 기재된 바와 같이 얻어진, 인간 혈장 (CCS)으로부터 유도된 세포 배양 첨가물로, 보충되는 것이 필수적이다. 만약 FBS가 사용된다면, 10 및 20% (v/v) 사이의 양은 충분한 것으로 고려된다. 한편, 만약 CCS이 본 발명에 따른 배양 배지에 첨가물로 사용된다면, 10 및 40% (v/v)의 양은 충분한 것으로 고려될 수 있다.
본 발명에 따른 인간 간엽 줄기 세포에 대한 배양 배지는 건조 형태 또는 액체 형태 일 수 있다. 건조 형태의 사용을 위하여, 이의 성분은 간엽 세포의 배양을 위한 적절한 액체에 용해될 수 있다. 본 발명에 따른 배양 배지의 성분이 용해될 수 있는 액체의 타입은, 예를 들어, 멸균 증류수와 같이, 기술 분야에 당업자에게 알려져 있다.
본 발명은 다수의 구현 예를 참조하여 하기에 더욱 상세하게 기재된다. 이들 실시 예들은 그러나 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다.
실시 예
실시 예 1
기본 배지로서 DMEM/F12 + 피루브산염, 10% (v/v) 인간 백혈구/혈소판 코트 용해물 (연막), 10 mg/L의 인슐린, 0.0067 mg/L의 아셀렌산 나트륨, 2 mg/L의 에탄올아민 및 20 ng/mL의 bFGF을 함유하는 본 발명에 따른 배양 배지는 제조된다. 본 배지는 LV2라 한다. 배지 LV2는 단독 또는 간엽 줄기세포 (MSCQ)에 대해 적합한 10% (v/v)의 우태아 혈청 (FBS) 또는 인간 혈장 (CCS)으로부터 유도된 15% (v/v)의 세포 배양 첨가물로 보충되어 사용된다. Lonza (Basel, Switzerland) 또는 PromoCell (Heidelberg, Germany)로부터 시판되는 hMSC은 배양된다. 상기 제조자에 의해 권장된 배양 매체는 양성 대조구로서 사용된다. 단지 하나의 시판되는 기본 배지는 상기 음성 대조구로서 사용된다. 상기 결과는 표 1에 나타내었다.
| Lonza 및 PromoCell hMSC의 배양으로부터의 실험적 결과 | ||
| 배양 배지 | 세포 성장 | |
| Lonza hMSC | PromoCell hMSC | |
| 제조자에 의해 권장된 | (+) | (+) |
| DMEM/F12 | (-) | (-) |
| DMEM/F12 + FBS (MSCQ) | (-) | (-) |
| DMEM/F12 + CCS | (-) | (-) |
| LV2 | (-) | (-) |
| LV2 + FBS (MSCQ) | (+) | (+) |
| LV2 + CCS | (+) | (+) |
표 1에서 알 수 있는 바와 같이, Lonza hMSC는 기본 배지가 FBS 또는 CCS로 보충된 경우를 포함하는, 오직 DMEM/12 기본 배지가 상기 배양 배지로서 사용된 경우 더 이상 성장가능하지 않다. 이들은 또한 본 발명에 따른 LV2 배지가 단독으로 사용된 경우 성장하지 않는다. 그러나, 이들은 FBS 또는 CCS으로 보충된 경우 본 발명에 따른 상기 배양 배지에서, 및 상기 제조자에 의해 제시된 배양 배지에서 성장할 수 있다.
실시 예 2.
본 발명에 따른 상기 배양 배지의 성분 모두를 조합하는 효과를 결정하기 위하여, LV2 배양 배지는 실시 예 1에서 기재된 바와 같이 제조되고, 부가적으로 본 발명에 따른 배양 배지의 적어도 하나의 성분이 결핍된 다양한 매체는 또한 제조된다. 상기 제조된 매체, 및 얻어진 결과는 표 2에 나타내었다.
| Lonza 및 PromoCell hMSC의 성장시 배양 배지로부터 생략된 성분의 효과 | ||
| 배양 배지 | 세포 성장 | |
| Lonza hMSC | PromoCell hMSC | |
| 제조자에 의해 권장된 | (+) | (+) |
| DMEM/F12 | (-) | (-) |
| LV2 + CCS | (+) | (+) |
| 인슐린, 아셀렌산 나트륨 및 에탄올아민없는 LV2 + CCS | (-) | (-) |
| 백혈구/혈소판 용해물(연막) 없는 LV2 + CCS | (-) | (-) |
| bFGF없는 LV2 + CCS | (-) | (-) |
| LBC/bFGF 없는 LV2 + CCS | (-) | (-) |
표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, Lonza 및 PromoCell hMSC는 제조자에 의해 권장된 배양 배지 및 CCS으로 보충된 본 발명에 따른 배양 배지에서만 성장한다. 본 발명에 따른 배양 배지의 성분 중 적어도 하나가 생략된 경우, 상기 hMSC는 배지에서 더 이상 성장할 수 없다.
비록 본 발명이, 본 발명을 제한하지 않는, 바람직한 구현 예의 실시 예와 관련하여 기재되었을 지라도, 본 발명은 하기 청구항의 광범위한 해석에 의해 한정된다.
Claims (14)
- a) 간엽 줄기세포의 배양을 위해 일반적으로 사용된 기본 배지;
b) 인간 백혈구/혈소판 코트 용해물 (연막);
c) 인슐린;
d) 아셀렌산 나트륨;
e) 에탄올아민; 및
f) 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF)를 포함하는 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 청구항 1에 있어서,
상기 간엽 줄기세포 기본 배지는 DMEM/F12 + 피루브산염, Ham's F10, Ham's F12, MCDB 131 또는 RPMI 1640인 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 인간 백혈구/혈소판 코트 용해물 (연막)은 5 내지 20% (v/v)의 양으로 배양 배지에 존재하는 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 청구항 3에 있어서,
상기 인간 백혈구/혈소판 코트 용해물 (연막)은 7 내지 15% (v/v)의 양으로 배양 배지에 존재하는 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인슐린은 2 내지 20 mg/L의 양으로 존재하는 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 청구항 5에 있어서,
상기 인슐린은 5 내지 15 mg/L의 양으로 존재하는 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아셀렌산 나트륨은 0.005 내지 1.730 mg/L의 양으로 존재하는 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에탄올아민은 1 내지 8 mg/L의 양으로 존재하는 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 청구항 8에 있어서,
상기 에탄올아민은 2 내지 5 mg/L의 양으로 존재하는 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 bFGF는 5 내지 25 ng/mL의 양으로 존재하는 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양 배지는 항생물질을 더욱 포함하는 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 청구항 11에 있어서,
상기 항생물질은 젠타마이신/암포테리신의 혼합물인 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배지는 10% 내지 20% (v/v) 양의 우태아 혈청 (FBS)으로 보충되는 인간 간엽 세포용 배양 배지. - 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배지는 10% 내지 40% (v/v) 양의 인간 혈장으로부터 유도된 세포 배양 첨가물 (CCS)로 보충되는 인간 간엽 세포용 배양 배지.
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