JP6084548B2 - ヒト間葉系幹細胞のための培養培地 - Google Patents

Description

本発明は、ヒト間葉系幹細胞(hMSC)のための新しい培養培地に関する。より詳細には、本発明は、それらが特定の培養培地に適応しているためにこの種の細胞のために通常用いられる培養培地で成長しないものを含む、hMSC系が成長することができる培養培地に関する。

hMSCは、中でも、骨、軟骨、腱、筋肉および脂肪組織などの様々な間葉組織に分化するそれらの能力を基本的に特徴とする多分化能細胞である。hMSCは、骨髄、脂肪組織および臍帯血で見出されるものを含む、成人の様々な組織から単離することができる。

hMSCの増殖抑制性、免疫調節性および抗炎症性効果は、移植片対宿主病、実質臓器の移植後の拒絶反応、および自己免疫性疾患を含む、免疫系に起因する疾患での潜在的な治療薬としてこれらの細胞で注目されてきた。

米国特許第8,252,590 B2号

Cartwright, T. & Shah, G.P Culture media。Basic cell culture、第2版、Davis, J.M.編。2002年。Oxford University Press、New York、USA Sato, J.ら、Specific cell types and their requirements。Basic cell culture、第2版、Davis, J.M.編。2002年。Oxford University Press、New York、USA

hMSCのin vitro培養のために、それらの多能性能を保存することが不可避であることが知られており、このために、例えば塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、上皮成長因子(EGF)および形質転換成長因子(TGFβ-1)などの外部因子の通常の培養培地への添加が必要とされる。しかし、ほとんどのhMSCは特定の培養培地に依存し、間葉系幹細胞(MSCQ)のために適するウシ胎児血清を加えたDMEM/F12培地などの間葉系幹細胞の培養のために従来用いられている培地で培養することもできない。

これらの問題点を克服するために、本発明は、他の培養培地処方では成長しないhMSCが成長することができるhMSCのための新規培養培地に関する。本発明による培養培地は、以下を含む:
a)間葉系幹細胞の培養のために通常用いられる基礎培地
b)ヒト白血球/血小板コート溶解物(バフィーコート;LBC)
c)インスリン
d)亜セレン酸ナトリウム
e)エタノールアミン
f)塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)。

この文書で用いられるように、用語「培養培地」は、細胞の培養、成長または増殖のための栄養液に関する。用語「細胞培養物」は、人工のin vitro環境で維持される、培養されるまたは成長する細胞を指す。

この文書で用いられる用語「基礎培地」は、血清を含有してもしなくてもよい異なる添加物を追加したときにヒト間葉系細胞が成長することが可能である、任意の培地を指す。基礎培地は、ビタミン、グルコース、緩衝系および必須アミノ酸と一緒に、亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウムおよびカリウムなどの標準の無機塩を提供する。

好ましくは、本発明による培養培地での間葉系細胞の培養のために通常用いられる基礎培地は、DMEM/F12+ピルビン酸塩(DMEM/F12培地は、ハリー・イーグル(Harry Eagle)によって開発された最少必須培地の改変であるダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)、およびCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞の成長のためにハム(Ham)によって開発されたハムのF12培地の同等部の混合物である)、ハムのF10、ハムのF12、MCDB131(ヒト細胞の成長のための血清添加を減らした培地としてネドラー(Knedler)およびハムによって開発された培地)、またはRPMI1640(その名前は、正常および新生物のリンパ球の培養のためにムーアおよび共同研究者らによってそれが開発されたRoswell Park Memorial Instituteのイニシャルに由来するが、十分に追加されるとそれは他の異なる種類の細胞を成長させることができる)である。これらの培地の処方および組成は公知であり、例えばGibco(Life Technologies)のように、任意の生産者または供給業者から得ることができる。より好ましくは、培地はDMEM/F12+ピルビン酸塩である。

本発明によるヒト間葉系細胞のための培養培地の構成成分の1つは、白血球/血小板コート溶解物である。白血球/血小板コートは「バフィーコート」としても知られ、全血の遠心分離または沈降の後に血漿と赤血球の間に観察されるコートである。それは、白血球および血小板を基本的に含む。白血球/血小板コート溶解物(バフィーコート)は、本発明による培養培地に、5から20%(v/v)の間、より好ましくは7から15%(v/v)の間、最も好ましくは10%(v/v)の量で存在する。

本発明による培養培地の構成成分の別のものは、インスリンである。細胞成長に及ぼすインスリンの有益な効果は公知である(Cartwright, T. & Shah, G.P Culture media。Basic cell culture、第2版、Davis, J.M.編。2002年。Oxford University Press、New York、USA)。本発明による培養培地中には、インスリンは好ましくは2から20mg/Lの間、より好ましくは5から15mg/Lの間、最も好ましくは10mg/Lの量で存在する。

さらに、本発明による培養培地の別の構成成分は、亜セレン酸ナトリウムの形態のセレニウムである。セレニウムは、血清によって培養培地に通常供給され、それにとって必須である可能性がある微量元素である。亜セレン酸ナトリウムは、培養培地中に0.005から1.730mg/Lの間の量で存在する。

さらに、本発明によるヒト間葉系細胞のための培養培地は、エタノールアミンを含む。エタノールアミンは細胞膜の構築を助長することが知られている。本発明による培養培地中のエタノールアミンは、1から8mg/Lの間、好ましくは2から5mg/Lの間の量で存在する。

最後に、本発明による間葉系細胞のための培養培地は、bFGFも含む。bFGFは間葉系細胞の培養に推奨されていることが知られている(Sato, J.ら、Specific cell types and their requirements。Basic cell culture、第2版、Davis, J.M.編。2002年。Oxford University Press、New York、USA)。bFGFは、本発明による培養培地中に5から25ng/mLの間の量で存在する。

驚くべきことに、本発明による培養培地での構成成分の組合せにより、一般に市販されている他の培養培地に適合するものを含む、この種の細胞、例えばLonzaまたはPromoCellによって提供されるヒト間葉系細胞のために通常用いられる培養培地で成長しないヒト間葉系細胞系を培養することが可能である。

任意選択で、本発明による培養培地は、抗生物質を含む。この種の細胞の培養で通常用いられる任意の抗生物質を用いることができる。好ましくは、この抗生物質は、ゲンタマイシン-アンホテリシン混合物である。培養培地で用いなければならない抗生物質の量は、当業者が容易に決定することができる。

間葉系幹細胞の成長のために、本発明による培養培地に、例えばウシ胎児血清(FBS)または、例えば米国特許第8,252,590 B2号に記載のように得られるヒト血漿に由来する細胞培養添加物(CCS)が追加されることが必須である。FBSが用いられる場合は、10から20%(v/v)の間の量が十分であるとみなされる。他方、本発明による培養培地に追加するためにCCSが用いられる場合は、10から40%(v/v)の間の量が十分とみなすことができる。

本発明によるヒト間葉系幹細胞のための培養培地は、乾燥形態または液体形態であってよい。乾燥形態で用いるために、その構成成分を間葉系細胞の培養に適する液体に溶解してよい。本発明による培養培地の構成成分が溶解されてよい液体の種類は、例えば滅菌蒸留水など当業者に公知である。

本発明は、いくつかの実施形態に関して下でさらに詳細に記載される。しかし、これらの実施例は、本発明の範囲を限定することを意図しない。

(実施例)
(実施例1)
基礎培地としてDMEM/F12+ピルビン酸塩、10%(v/v)ヒト白血球/血小板コート溶解物(バフィーコート)、10mg/Lのインスリン、0.0067mg/Lの亜セレン酸ナトリウム、2mg/Lのエタノールアミンおよび20ng/mLのbFGFを含有する、本発明による培養培地を調製した。この培地をLV2と称した。培地LV2は単独で用いたか、間葉系幹細胞(MSCQ)に適する10%(v/v)のウシ胎児血清(FBS)、またはヒト血漿に由来する15%(v/v)の細胞培養添加物(CCS)を追加した。Lonza(Basel、Switzerland)またはPromoCell(Heidelberg、Germany)から市販されているhMSCを培養した。製造業者によって推奨される培養培地を、陽性対照として用いた。1つの市販基礎培地だけを、陰性対照として用いた。結果をTable 1(表1)に示す。

Table 1(表1)で分かるように、その基礎培地にFBSまたはCCSを追加する場合も含めて、DMEM/12基礎培地だけを培養培地として用いる場合は、Lonza hMSCは成長することができない。本発明によるLV2培地が単独で用いられる場合も、それらは成長しない。しかし、それにFBSまたはCCSを追加した場合の本発明による培養培地で、および製造業者によって推奨される培養培地で、それらは成長することが可能だった。

(実施例2)
本発明による培養培地の全ての構成成分を組み合わせることの効果を判定するために、LV2培養培地を実施例1に記載のように調製し、これに加えて、本発明による培養培地の少なくとも1つの構成成分を欠く様々な培地も調製した。調製した培地、および得られた結果をTable 2(表2)に示す。

Table 2(表2)から見られるように、LonzaおよびPromoCell hMSCは、製造業者によって推奨される培養培地、およびCCSを追加した本発明による培養培地だけで成長した。本発明による培養培地の構成成分の少なくとも1つが除外された場合、hMSCはそこで成長することが不可能であった。

本発明は好ましい実施形態の実施例に関して記載されたが、これらは本発明を限定するものとみなしてはならず、本発明は以下の請求項の最も広い解釈によって規定される。

Claims (13)

1. ヒト間葉系細胞のための培養培地であって、
   a)DMEM/F12+ピルビン酸塩である間葉系幹細胞基礎培地、
   b)バフィーコート、
   c)インスリン、
   d)亜セレン酸ナトリウム、
   e)エタノールアミン
   f)塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)および
   g)ウシ胎児血清(FBS)またはヒト血漿に由来する細胞培養添加物(CCS)
   を含むことを特徴とする、培養培地。
2. 前記バフィーコートが培養培地中に5から20%(v/v)の量で存在することを特徴とする、請求項1に記載のヒト間葉系細胞のための培養培地。
3. 前記バフィーコートが培養培地中に7から15%(v/v)の量で存在することを特徴とする、請求項2に記載のヒト間葉系細胞のための培養培地。
4. 前記インスリンが2から20mg/Lの量で存在することを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載のヒト間葉系細胞のための培養培地。
5. 前記インスリンが5から15mg/Lの量で存在することを特徴とする、請求項4に記載のヒト間葉系細胞のための培養培地。
6. 前記亜セレン酸ナトリウムが0.005から1.730mg/Lの量で存在することを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載のヒト間葉系細胞のための培養培地。
7. 前記エタノールアミンが1から8mg/Lの量で存在することを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載のヒト間葉系細胞のための培養培地。
8. 前記エタノールアミンが2から5mg/Lの量で存在することを特徴とする、請求項7に記載のヒト間葉系細胞のための培養培地。
9. 前記bFGFが5から25ng/mLの量で存在することを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載のヒト間葉系細胞のための培養培地。
10. 抗生物質をさらに含むことを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載のヒト間葉系細胞のための培養培地。
11. 前記抗生物質がゲンタマイシン/アンホテリシンの混合物であることを特徴とする、請求項10に記載のヒト間葉系細胞のための培養培地。
12. 10%から20%(v/v)の量でウシ胎児血清(FBS)が存在することを特徴とする、請求項1から11のいずれか一項に記載のヒト間葉系細胞のための培養培地。
13. 10%から40%(v/v)の量でヒト血漿に由来する細胞培養添加物(CCS)が存在することを特徴とする、請求項1から11のいずれか一項に記載のヒト間葉系細胞のための培養培地。