BR102013027139A2 - Meio de cultura de células mesenquimais humanas - Google Patents
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Abstract
Meio de cultura de células mesenquimais humanas. A presente invenção refere-se a um novo meio de cultura de células tronco mesenquimais humanas (hmsc). Mais em particular, a presente invenção se refere a um meio de cultura no qual linhagens de hmsc podem crescer inclusive as que não crescem em meios de cultura habitualmente utilizados para este tipo de células.
Description
“MEIO DE CULTURA DE CÉLULAS MESENQUIMAIS HUMANAS” A presente invenção refere-se a um novo meio de cultura de células tronco mesenquimais humanas (hMSC), Mais em particular a presente invenção se refere a um meio de cultura no qual linhagens de hMSC podem crescer, inclusive aquelas que não crescem em meios de cultura habitualmente utilizados para este tipo e células, devido a que se adaptaram a meios de cultura específicos.
As hMSC são células multipotentes que se caracterizam fundamentalmente por sua capacidade de se diferenciar em vários tecidos mesenquimais, tais como osso, cartilagem, tendão, músculo, tecido adiposo entre outros. As hMSC podem ser isoladas de vários tecidos de adultos entre os quais se encontram a medula óssea, tecido adiposo e sangue do cordão umbilical. O efeito antiproliferativo, imunomodulador e anti-inflamatório das hMSC centralizou a atenção nestas células como potenciais agentes terapêuticos em doenças causadas pelo sistema imune que incluem a doença do enxerto contra hospedeiro, rejeição em seguida ao transplante de órgãos sólidos e as doenças autoimunes. É conhecido que o para cultura in vitro das hMSC é imperativa preservar sua capacidade pluripotencial e, para isso, requer-se a adição de fatores exógenos tais como, por exemplo, fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento de transformação (TGFp=l) aos meios de cultura habituais. No entanto, a maioria das hMSC é dependente de um meio de cultura específico e inclusive não pode ser cultivada em meios que tradicionalmente se tem utilizado para a cultura de células tronco mesenquimais tais como o meio DMEM/F12 suplementado com soro fetal bovino qualificado para células tronco mesenquimais (MSCQ).
Para superar estes problemas, a presente invenção dá a conhecer um novo meio de cultura de hMSC, que permite o crescimento de hMSC, que não crescem em outras formulações de meios de cultura. O meio de cultura da presente invenção compreende: a) meio basal, habitualmente utilizado para a cultura de células tronco mesenquimais b) lisado de revestimento de leucócito/plaqueta humano(a) (revestimento leucocitário; LBC) c) insulina d) selenito de sódio e) etanolamina f) fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) Tal como se utiliza no presente documento, a expressão “meio de cultura” se refere a uma solução nutritiva para a cultura, crescimento ou proliferação das células. A expressão “cultura celular” se refere a células que são mantidas, cultivadas ou crescidas em um ambiente in vitro artificial. A expressão “meio basal” utilizada no presente documento, se refere a qualquer meio no qual as células mesenquimais humanas são capazes de crescer quando são suplementadas com diferentes suplementos que podem ou não conter soro. Os meios basais administram sais inorgânicos padrões, tais como de zinco, ferro, magnésio, cálcio e potássio assim como vitaminas, glicose, um sistema tampão e aminoácidos essenciais.
Preferentemente, o meio basal habitualmente utilizado para a cultura de células mesenquimais no meio de cultura da presente invenção é DMEM/F12 + piruvato, sendo o meio DEM/F12 uma mistura em partes iguais do meio Dubelcco’s Modified Eagle Médium (DMEM) que é uma modificação do meio mínimo essencial desenvolvido por Harry Eagle e do meio Ham’s F12, desenvolvido por Ham para o crescimento das células CHO (Chinese Hamster Ovary); Ham’s FIO; Ham’s F12; MCDB 131, meio desenvolvido por Knedler e Ham, como um meio de suplementação reduzida de soro para o crescimento de células humanas; ou RPMI 1640, cuja denominação deriva das iniciais de Roswell Park Memorial Institute onde foi desenvolvido por Moore e colaboradores para a cultura de linfócitos normais e neoplásicos ainda que, com a suplementação adequada, possam crescer outros tipos celulares distintos. A formulação e a composição destes meios são amplamente conhecidas e eles podem ser obtidos a partir de qualquer produtor ou provedor como por exemplo Glbco (Life Technologies). Mais preferentemente o meio é DMEM/F12 + piruvato.
Um dos componentes do meio de cultura de células mesenquimais humanas da presente invenção é o lisado de revestimento de leucócito/plaqueta. A revestimento de leucócito/plaqueta também conhecida como “revestimento leucocitário” é o revestimento que se observa depois da centrifugação ou da sedimentação do sangue total entre o plasma e os glóbulos vermelhos. Ela é composta fundamentalmente por leucócitos e plaquetas. O lisado de revestimento de leucócito/plaqueta (revestimento leucocitário) está presente no meio de cultura da presente invenção em uma quantidade compreendida entre 5 e 20% (v/v) mais preferentemente entre 7 e 15% (v/v) sendo a mais preferente 10% (v/v).
Outro dos componentes do meio de cultura da presente invenção é a insulina. É conhecido o efeito benéfico da insulina sobre o crescimento celular (Cartwight, T e Shah G.P Culture media, Basic cell culture 2a edição, Davis, J.M. ed 2002, Oxford University Press, Nova Iorque, EUA). No meio de cultura da presente invenção, a insulina está presente preferentemente em uma quantidade compreendida entre 2 e 20 mg/1, mais preferentemente entre 5 e 15 mg/1 e a mais preferente de 10 mg/1.
Por outro lado, outro componente do meio de cultura da presente invenção é o selênio, em forma de selenito de sódio. O selênio é um elemento de traço que normalmente é trazido pelo soro do meio de cultura e que pode ser imprescindível para o mesmo. O selenito de sódio está presente no meio de cultura em uma quantidade compreendida entre 0,005 e 1,730 mg/1.
Além disso, o meio de cultura de células mesenquimais humanas da presente invenção compreende etanolamina. É conhecido que a etanolamina favorece a construção das membranas celulares. A etanolamina no meio de cultura da presente invenção se encontra em uma quantidade compreendida entre 1 e 8 mg/1, preferentemente entre 2 e 5 mg/1.
Por último, o meio de cultura de células mesenquimais humanas da presente invenção compreende bFGF. É conhecido que o bFGF foi recomendado para a cultura de células mesenquimais (Sato, J. e outros, Specific cell types and their requirements. Basic cell culture, 2a edição, Davis J.M. ed. 2002. Oxford University Press, Nova Iorque (EUA). O bFGF se encontra no meio de cultura da presente invenção em uma quantidade compreendida entre 5 e 25 ng/ml.
Com a combinação dos componentes do meio de cultura da presente invenção consegue-se, de forma surpreendente, cultivar linhagens celulares mesenquimais humanas, inclusive as adaptadas a outros meios de cultura, em geral obtidas comercialmente que não crescem nos meios de cultura habitualmente utilizados para este tipo de células, como por exemplo as células mesenquimais humanas oferecidas por Lonza ou PromoCell.
De forma opcional, o meio de cultura da presente invenção compreende um antibiótico. Pode-se utilizar qualquer antibiótico habitualmente utilizado na cultura deste tipo de células. Preferentemente, dito antibiótico é uma mistura de gentamicina/anfotericina. A quantidade de antibiótico a utilizar no meio de cultura pode ser determinada com facilidade por um perito na matéria.
Para o crescimento das células tronco mesenquimais, é imprescindível suplementar o meio de cultura da presente invenção, por exemplo com soro fetal bovino (FBS) ou suplemento de cultura celular derivado do plasma humano (SCC) obtido, por exemplo, conforme o descrito na patente US 8.252.590 B2. No caso em que se utiliza FBS, considera-se suficiente uma quantidade compreendida entre 10 e 20% (v/v). Por outro lado, se utiliza-se SCC para suplementar o meio de cultura da presente invenção, pode-se considerar suficiente uma quantidade compreendida entre 10 e 40% (v/v). O meio de cultura de células tronco mesenquimais humanas da presente invenção pode estar em forma seca ou em forma líquida. Para seu uso em forma seca, os componentes do mesmo podem ser dissolvidos em um líquido adequado para a cultura das células mesenquimais. O tipo de líquido em que podem ser dissolvidos os componentes do meio de cultura da presente invenção é conhecido de um perito na matéria, como por exemplo água destilada estéril. A presente invenção é descrita a seguir com mais detalhes em referência a vários exemplos de realização. Estes exemplos, entretanto, não são destinados a limitar o alcance da presente invenção. EXEMPLOS Exemplo 1 Preparou-se um meio de cultura, de acordo com a presente invenção, que continha DMEM/F12 + piruvato como meio basal, lisado de revestimento de leucócito/plaqueta humano(a) (revestimento leucocitário) a 10% (v/v), 10 mg/1 de insulina, 0,0067 mg/1 de selenito de sódio, 2 mg/1 de etanolamina e 20 ng/ml de bFGF. Dito meio foi denominado de LV2. O meio LV2 foi utilizado só ou suplementado com soro fetal bovino (FBS) qualificado para células tronco mesenquimais (MSCQ) a 10% (v/v) ou com suplemento de cultura celular derivado do plasma humano (SCC) a 15% (v/v). Cultivou-se hMSC comercialmente disponíveis de Lonza (Basiléia, Suíça) ou de PromoCell (Heidelberg Alemanha). Como controle positivo utilizou-se os meios de cultura recomendados pelo fabricante. Como controle negativo utilizou-se somente um meio basal disponível comercialmente. Os resultados são mostrados na tabela 1.
Como se pode observar na tabela 1, hMSC de Lonza não é capaz de crescer quando se utiliza como meio de cultura somente o meio basal DMEM/F12 inclusive nem quando dito meio basal é suplementado com FBS ou SCC. Elas tampouco cresceram quando se utilizou o meio da presente invenção LV2 só. Todavia, elas foram capazes de crescer no meio de cultura da presente invenção quando este era suplementado com FBSD ou SCC assim como no meio de cultura recomendado pelo fabricante.
Exemplo 2 Para determinar o efeito da combinação de todos os componentes do meio de cultura da presente invenção, preparou-se um meio de cultura LV2 tal como se fez no exemplo 1 e além disso, preparou-se vários meios que careciam, como mínimo, de um componente do meio de cultura da presente invenção. Os meios preparados assim como os resultados obtidos, são mostrados na tabela 2.
Tal como se pode observar na tabela 2, a hMSC de Lonza e de Promocell cresceram somente no meio de cultura recomendado pelo fabricante e no meio de cultura da presente invenção suplementado com SCC. Quando se elimina, como mínimo, um dos componentes do meio de cultura da presente invenção, as hMSC não são capazes de crescer no mesmo.
Embora a invenção tenha sido descrita com respeito a exemplos de realizações preferentes, estes não devem ser considerados limitativos da invenção, que será definida pela interpretação mais ampla das seguintes condições.
Claims (14)
1. Meio de cultura de células mesenquimais humanas, caracterizado pelo fato de que compreende: a) meio basal, habitualmente utilizado para a cultura de células tronco mesenquimais b) lisado de revestimento de leucócito/plaqueta humano(a) (revestimento leucocitário) c) insulina d) selenito de sódio e) etanolamina f) fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF).
2. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito meio basal utilizado para a cultura de células tronco mesenquimais é DMEM/F12 + piruvato, Ham’s FIO, Ham’s F12, MCDB 131 ou RPMI 1640.
3. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que dito lisado de revestimento de leucócito/plaqueta humano(a) (revestimento leucocitário) está presente no meio de cultura em uma quantidade compreendida entre 5 e 20% (v/v).
4. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que dito lisado de revestimento de leucócito/plaqueta (revestimento leucocitário) humana está presente no meio de cultura em uma quantidade compreendida entre 7 e 15% (v/v).
5. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que dita insulina está presente em uma quantidade compreendida entre 2 e 20 mg/1.
6. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que dita insulina está presente em uma quantidade compreendida entre 5 e 15 mg/1.
7. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que dito selenito de sódio está presente em uma quantidade compreendida entre 0,005 e 1,730 mg/1.
8. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que dita etanolamina está presente em uma quantidade compreendida entre 1 e 8 mg/1.
9. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que dita etanolamina está presente em uma quantidade compreendida entre 2 e 5 mg/1.
10. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que dito bFGF está presente em uma quantidade compreendida entre 5 e 25 ng/ml.
11. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um antibiótico.
12. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que dito antibiótico é uma mistura de gentamicina/anfotericina.
13. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que dito meio é suplementado com soro fetal bovino (FBS) em uma quantidade compreendida entre 10% e 20% (v/v).
14. Meio de cultura de células mesenquimais humanas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que dito meio é suplementado com suplemento de cultura celular derivado de plasma (SCC) em uma quantidade compreendida entre 10% e 40% (v/v
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