CN102703385A - 一种间充质干细胞培养液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种配方简单、成本低且安全性高的无血清间充质干细胞培养液，包含有无血清动物细胞培养基、B27无血清添加剂、bFGF和EGF,所述培养液还包含有胎球蛋白以及抗生素。本发明的培养液中不含有动物血清，具有较高的安全性，且配方成分确定，适合临床治疗之用；同时，可以让人类脂肪干细胞正常的附于培养器皿的表面生长,配方成分中可加入抗生素,相比一般的无血清培养液的配方简单；相对于现有配方培养脂肪干细胞,细胞于两代后便开始分化而生长减慢，而采用本发明配方培养的脂肪干细胞经测试未发现分化和生长减慢的现象，十分适合脂肪干细胞及牙龈干细胞之生长。
Description
技术领域
本发明涉及间充质干细胞的培养技术。
背景技术
间充质干细胞是一种具有高分化潜能的细胞与一般的体细胞不同,拥有分化成多种身体组织,如骨骼,皮肤,心脏,神经,等等,的能力。它在再生医学上的应用个案在近年不断上升,细胞来源主要从人类组织提取并经过体外培植而获得所需数目的干细胞供治疗时使用，但由于细胞体外增植时所用的传统培养液也含有5%至20%的动物血清,如果所用血清含有不能治愈的病毒或病原体(如疯牛症的朊毒体(prion)),接受细胞治疗的病人便会因而染病,后果十分严重。由于培养液中主要刺激细胞生长的成份是血清，科学家便尝试用人类血清代替动物血清(Patent US 7,951,593 B2)。另外由于血清中刺激细胞生长的物质是一些生长因子(cytokine),亦有研究小组将不同的生长因子组合加入现有的培养基(如DMEM,RPMI)中以取代传统的细胞培养液(Jung SH et al.,2011)。
现有技术中的间充质干细胞培养液主要有以下技术方案:利用人类血清加上胰岛素及bFGF去代替动物血清以培养牙龈干细胞(Patent US 7,951,593B2)；利用5%血小板裂解物(plateletlysate)加上2IU/ml heparin代替10%牛血清去培养骨髓干细胞(Doucet C et al.,2005)；利用DMEM:F-12培养基加上L-glutamine,lipid concentrate, sodium biocardonate, HEPES, insulin,transferring, putrescine, progesterone, fetuin,hydrocortisone,L-ascorbic acid-2-phosphate,human serumalbumin,b-FGF,TGF-bate 1,但该配方不能加入抗生素培养人类骨髓干细胞(Jung SH et al.,2011);利用GMEM培养基加上L-glutamine,non essential amino acids,human bFGF,human EGF,human thrombin,B27,N2.Glucose,ARAC,培养人类脂肪干细胞以悬浮性的方式生长(Dromard C et al.,2011)；等等。
上述现有方案的缺点是：
1、含有血清的配方方案中，会用到来源自动物的血清,但血清的内含有各种未确定的物质及蛋白,细胞容易受被科学界确定的动物病毒和细菌所污染；
2、现有的无血清培养液是用成份未能完全确定的血制品代替血清,细胞受污染的风险也不比利用血清的低；
3、现有用于间充质干细胞生长的培养液,在培养数代后干细胞便开始分化而失去干细胞之可塑性及医疗效能；
4、现有的无血清培养液配方十分复杂,所需材料成本比起用动物血清为高,令其普及性十分低。
发明内容
本发明为克服上述现有技术的缺点，提供一种配方简单、成本低且安全性高的无血清间充质干细胞培养液。
本发明实现发明目的采用的技术方案是，一种间充质干细胞培养液，包含有无血清动物细胞培养基、B27无血清添加剂、bFGF和EGF,所述培养液还包含有0.5-2mg/ml的胎球蛋白以及抗生素。
优选地，所述抗生素由青霉素和链霉素组成，青霉素的含量为50-150units/ml,链霉素的含量为50-150units/ml。
优选地，所述无血清动物细胞培养基为alpha-MEM培养基。
优选地，所述B27无血清添加剂的添加量为所述间充质干细胞培养液体积的1-3%。
优选地，所述bFGF的含量为10-50ng/ml。
优选地，所述EGF的含量为10-50ng/ml。
本发明的有益效果是：
1、本发明的培养液中不含有动物血清，具有较高的安全性，且配方成分确定，适合临床治疗之用；
2、相对于利用GMEM培养基为基础的无血清培养液(Dromard Cet al.,2011),脂肪干细胞会在培养瓶中以悬浮性的方式生长,有别于一般间充质干细胞附底生长的特性而令其生长速度较慢;而一些无血清的配方则不能加入抗生素,但此举会增加培养时细胞受细菌的污染机会(Jung SH et al.,2011);本发明可以让人类脂肪干细胞正常的附于培养器皿的表面生长,配方成分中可加入抗生素,相比一般的无血清培养液的配方简单；
3、相对于现有配方培养脂肪干细胞,细胞于两代后便开始分化而生长减慢，而采用本发明配方培养的脂肪干细胞经测试未发现分化和生长减慢的现象，十分适合脂肪干细胞及牙龈干细胞之生长。
具体实施方式
实施例1:
将20cc脂肪组织用磷酸盐缓冲液清洗3次，加入胶原蛋白酶(Type II,50-100U/ml)消化组织一小时,将消化物离心并利用磷酸盐缓冲液清洗所得细胞3次；将细胞混合7ml培养液放入T-75细胞培养瓶中培养，本实施例的培养液组分为：alpha-MEM培养基、体积比1%的B27无血清添加剂、10ng/ml的bFGF、10ng/ml的EGF、0.5mg/ml的胎球蛋白、各100units/ml的青霉素和链霉素，采用以上培养液，每3天更换培养液一次,当细胞生长满一个T-75细胞培养瓶时检测，已培养出了不少于一百万个的脂肪间充质干细胞。
实施例2：
用体积比70%的乙醇溶液给人体消毒口腔,然后利用2mm直径的活检器在人体牙龈中抽取组织样本(不少于2mmx2mmx2mm)，用磷酸盐缓冲液清洗3次，加入胶原蛋白酶(Type II,50-100U/ml)消化组织一小时,将消化物离心并利用磷酸盐缓冲液清洗所得细胞3次；将牙龈组织细胞混合10ml培养液放入T-75细胞培养瓶中培养，本实施例的培养液组分为：DMEM/F12无血清培养基、体积比3%的B27无血清添加剂、50ng/ml的bFGF、50ng/ml的EGF、2mg/ml的胎球蛋白、各150units/ml的青霉素和链霉素，采用以上培养液，每3天更换培养液一次,当细胞生长满一个T-75细胞培养瓶时检测，已培养出了不少于一百万个的牙龈组织间充质干细胞。
本实施例相对于利用专利(US 7,951,593B2)的配方培养牙龈干细胞,专利(US 7,951,593B2)的培养液配方中需要血小板裂解物,但裂解物中的成份是未能完全确定的,安全性低，而本实施例相对而言具有更高的安全性。
实施例3：
将脂肪间充质干细胞(不少于40万个细胞)解冻至37度,利用磷酸盐缓冲液清洗所得细胞2次，将细胞混合20ml培养液放入T-150细胞培养瓶中培养，本实施例的培养液组分为：alpha-MEM培养基、体积比2%的B27无血清添加剂、20ng/ml的bFGF、20ng/ml的EGF、1mg/ml的胎球蛋白、各100units/ml的青霉素和链霉素，采用以上培养液，每3天更换培养液一次,当细胞生长满一个T-75细胞培养瓶时检测，已培养出了不少于三百万个的脂肪间充质干细胞。
相比于利用Dromard C et al.,2011的无血清培养液配方培养脂肪间充质干细胞,细胞会在培养瓶中以悬浮性的方式生长,而本实施例的间充质干细胞可附于培养瓶生长，形成面生长的特性。
应当理解的是，作为本发明上述实施例的扩展，参考专利(US7,109,032B2)的配方培养间充质干细胞,也可以加入以下多种生长因子PDGF,FGF-2,IGF-1,LIF,SCF,EGF中的一种或多种，但为控制培养液的成本，发明只需加入EGF,bFGF,B27三种生长因子,具有较低的成本。同时，相比于Jung SH et al.,2011的无血清培养液配方培养间充质干细胞,本发明能加入抗生素，从而大大减少细胞受细菌感染的机会。
作为具体实施方式，本发明中的B27无血清添加剂可直接购买型号为
Serum-Free Suppl ement(50X)的无血清添加剂。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (6)
1.一种间充质干细胞培养液，包含有无血清动物细胞培养基、B27无血清添加剂、bFGF和EGF,其特征在于：所述培养液还包含有0.5-2mg/ml的胎球蛋白以及抗生素。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养液，其特征在于：所述抗生素由青霉素和链霉素组成，青霉素的含量为50-150units/ml,链霉素的含量为50-150units/ml。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养液，其特征在于：所述无血清动物细胞培养基为alpha-MEM培养基。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养液，其特征在于：所述B27无血清添加剂的添加量为所述间充质干细胞培养液体积的1-3%。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养液，其特征在于：所述bFGF的含量为10-50ng/ml。
6.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养液，其特征在于：所述EGF的含量为10-50ng/ml。
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