CN110106145A - 一种未成熟树突状细胞培养液及其未成熟树突状细胞的制备方法 - Google Patents

一种未成熟树突状细胞培养液及其未成熟树突状细胞的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种未成熟树突状细胞培养液及其未成熟树突状细胞的制备方法，属于细胞培养技术领域。细胞制备包括以下步骤：1)将血浆处理后收集白细胞；2)准备DC培养瓶，进行PBMCs培养；3)培养后，向瓶中加入DC培养液，培养3天；4)收获DC细胞。上述一种未成熟树突状细胞培养液及其未成熟树突状细胞的制备方法，其细胞培养液加入IL‑13白细胞介素，可诱导单核细胞分化，增强其MHC Ⅱ类分子的表达；加入抗CD83抗体，可以有效提高未成熟DC细胞的纯度；DC细胞收获时使用EDTA，解除细胞贴壁状态，提高细胞存活率；使用该方法DC细胞培养成熟时间快，只用3天即可成熟，且细胞数量以及纯度高。

Description

一种未成熟树突状细胞培养液及其未成熟树突状细胞的制备 方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体为一种未成熟树突状细胞培养液及其未成熟树突状细胞的制备方法。
背景技术
树突状细胞(Dendritic Cells，以下简称DC)，是一种巨噬细胞，同时也是功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)。DC细胞在人体内主要通过吞噬抗原体并将其一部分表达在DC细胞表面的MHC II分子上以激活辅助性T细胞以及B细胞。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(T cells)增殖的APC。现有DC细胞培养方法很多，但是一般存在DC细胞培养成熟时间慢，要4天左右才成熟，细胞数量以及纯度低等问题。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种未成熟树突状细胞培养液及其未成熟树突状细胞的制备方法的技术方案，其DC细胞培养时加入IL-13白细胞介素，可诱导单核细胞分化，增强其MHCⅡ类分子的表达；加入抗CD83抗体，可以有效提高未成熟DC细胞的纯度；DC细胞收获时使用EDTA，解除细胞贴壁状态，提高细胞存活率；使用该方法DC细胞培养成熟时间快，只用3天即可成熟，且细胞数量以及纯度高。
所述的一种未成熟树突状细胞培养液，其特征在于采用以下方法制备：在室温下向15ml的CELL GRO DC培养液里加入10.5-11.2ul浓度为800U/ml的GM-CSF，7.3-7.8ul浓度为500U/ml的IL-4，7.3-7.8ul浓度为500U/ml的IL-13，3.8-4.2ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体，0.13-0.17ml浓度为1％的自体血清。
所述的一种未成熟树突状细胞培养液，其特征在于：在室温下向每15ml的CELLGRO DC培养液里加入10.9ul浓度为800U/ml的GM-CSF，7.5ul浓度为500U/ml的IL-4，7.5ul浓度为500U/ml的IL-13，4ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体，0.15ml浓度为1％的自体血清。
所述的一种未成熟树突状细胞培养液的树突状细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将血浆处理后收集白细胞，将白细胞移入50ml细胞试管中；
2)准备DC培养瓶，加10ml室温下的ALyS505N-0培养液到每个DC培养瓶中，用10ml移液器向细胞试管中加入10ml ALyS505N-0，重新使细胞悬浮，加入0.9-1.1ml青链霉素双混合液，48-52ul的200mM L-谷氨酰胺；向每个DC培养瓶里转移5ml细胞悬浊液，扣上DC培养瓶盖子，慢慢的摇晃瓶子使细胞悬液均匀，放进培养箱培养1.8-2.2小时，37℃，5％CO2，当培养快要结束前，制备DC培养液；
3)在PBMCs培养结束后，用显微镜确保细胞黏附在培养瓶的底部；温柔的前后摇晃培养瓶10次使非贴壁的细胞悬浮，转移非贴壁细胞悬液到50ml试管中；迅速的向每个DC培养瓶中加入14-16ml DC培养液，放入培养箱培养3天，36-38℃，4.5-5.5％CO2；培育期间如果DC培养瓶的培养液变成橘黄色，则加入7.3-7.7ml/F的DC培养液；
4)确认收获的细胞培养瓶，确保内毒素检测为阴性，准备一个冰盒暂存细胞，准备冰冷的RPMI1640，准备0.1-0.15mM EDTA的hanks溶液，用显微镜检查所有要收获的DC培养瓶；
5)用10ml移液器上下转移DC培养瓶中的液体5次来使黏附的细胞悬浮，转移细胞悬浮液到一个新的50ml试管中，向DC培养瓶中加入10ml RPMI1640，并用用10ml移液器上下转移DC培养瓶中的液体5次来使黏附的细胞悬浮，转移细胞悬浮液到上述50ml试管中，将试管放在冰上暂存；
6)用倾倒的方法向每个DC培养瓶中倒入14-16ml的0.1-0.15mM EDTA的hanks溶液，36-38℃培育28-32分钟，培育结束后，用10ml移液器上下转移DC培养瓶中的液体20次使细胞悬浮，转移细胞悬液到50ml试管中；用10ml移液器转移10ml RPMI到DC培养瓶中，清洗DC培养瓶5次，转移细胞悬液到50ml试管中，放在冰上暂存；
7)当所有细胞都被收获到试管中以后，离心试管4-5分钟，400g，4℃；离心结束后，吸取移除上层液体，用2-5ml的RPMI 1640使50ml试管内细胞悬浮；转移所有试管中的细胞悬液到其中一个试管中，加入RPMI 1640直到50ml，取样本用于FACS检测，计算DC细胞的数量以及存活率；离心试管4-5分钟，1500rpm，4℃；准备冷冻管，制备细胞冷冻液，细胞冷冻液由CELL GRO DC培养液、20％自体血清、10％DMSO组成，暂存在冰上；离心细胞试管5分钟，400g，4℃；离心结束后，倒出弃用上层液体到一个无菌的试管中；执行无菌检测，暂存细胞在冰上，向细胞试管中加入冷冻液，用移液器混匀，冷冻保存。
所述的一种未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于步骤1)中：确认血浆袋的吸取管密封，用两张不同的浸泡在70％乙醇的无菌室专用清洁纸擦拭吸取管和剪刀；用镊子夹住吸取管，剪开管道前端并用镊子控制流速以转移血浆到50ml试管内，记录转移的血浆容量；离心试管，400g，4℃，30分钟以移除血小板；把上层液体倒入一个新的50ml试管，把试管放入56℃恒温水槽内，培养30分钟；离心式管，400g，4℃，60分钟以移除沉淀的纤维蛋白；
把上层自体血清倒入一个新的50ml试管，4℃冷藏；确认PBMC袋的吸取管密封，悬挂好PBMC袋，用两张不同的侵泡在70％乙醇的无菌室专用清洁纸擦拭吸取管和剪刀；转移细胞到50ml试管中，记录转移的容量；计算所需的50ml试管的数量，向所有试管中加入15ml淋巴细胞分离液1077；准备足够的新50ml试管用以2倍稀释样本，向准备的所有50ml试管中倒入25ml hanks缓冲液，用10ml移液器转移25ml细胞悬浊液到各个试管中，向所有试管中各移入30ml稀释过的细胞悬液；离心所有试管，400g，室温，40分钟；吸取，弃用上层液体直到液面到底层白细胞的距离为1cm；准备新的50ml试管，小心翼翼地用10ml移液器收集白细胞；将每两个试管中的白细胞收集，移入一个新的50ml试管中。
所述的一种未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于步骤3)中：向每个DC培养瓶中加入15ml DC培养液，放入培养箱培养，37℃，5％CO2；培育期间如果DC培养瓶的培养液变成橘黄色，则加入7.5ml/F的DC培养液。
所述的一种未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于步骤4)中：准备0.12-0.13mM EDTA的hanks溶液。
所述的一种未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于步骤6)中：向每个DC培养瓶中倒入15ml的0.14mM EDTA的hanks溶液，37℃培育30分钟。
本发明使用的试剂均可以从市场上直接购得。
所述的GM-CSF是一种DC细胞刺激因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。
所述的IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将有可能分化为其他巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC。
所述的IL-13可诱导单核细胞分化，增强其MHCⅡ类分子的表达。
所述的抗CD83抗体，CD83被认为是成熟DC细胞的特有表面标志，加入抗CD83抗体可以有效提高未成熟DC细胞的纯度。
所述的EDTA主要用于螯合二价阳离子，解除细胞贴壁状态，提高细胞存活率。
所述的Hanks缓冲液，平衡盐溶液，含有无机盐和葡萄糖的浓度接近人体细胞的水平，可有效提高细胞存活率。
所述的20％人类白蛋白溶液，人类白蛋白可使细胞分离，防止细胞聚集。
所述的200mM L-谷氨酰胺，L-谷氨酰胺能将大量将氮元素运送到细胞内，提高细胞活率，促进生长。
上述一种未成熟树突状细胞培养液及其树突状细胞的制备方法，其细胞培养液加入IL-13白细胞介素，可诱导单核细胞分化，增强其MHCⅡ类分子的表达；加入抗CD83抗体，可以有效提高未成熟DC细胞的纯度；DC细胞收获时使用EDTA，解除细胞贴壁状态，提高细胞存活率；使用该方法DC细胞培养成熟时间快，只用3天即可成熟，且细胞数量以及纯度高。该方法通过改变细胞因子浓度，细胞因子种类以及改善收获方式极大的提高未成熟DC细胞的增值倍数及浓度。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
DC培养步骤
1.确认血浆袋的吸取管密封。用两张不同的浸泡在70％乙醇的无菌室专用清洁纸擦拭吸取管和剪刀。
2.用镊子夹住吸取管，剪开管道前端并用镊子控制流速以转移血浆到50ml试管内。记录转移的血浆容量。
3.离心试管(400g，4℃)30分钟以移除血小板。
4.把上层液体倒入一个新的50ml试管。
5.把试管放入恒温水槽内(56℃)，培养30分钟。
6.离心式管(400g，4℃)60分钟以移除沉淀的纤维蛋白。
7.把上层液体(自体血清)倒入一个新的50ml试管。再试管上标记病人名字，制备日期，并冷藏(4℃)。
8.确认PBMC袋的吸取管密封。悬挂好PBMC袋。用两张不同的侵泡在70％乙醇的无菌室专用清洁纸擦拭吸取管和剪刀。
9.转移细胞到50ml试管中。记录转移的容量。
10.计算所需的50ml试管的数量，向所有试管中加入15ml淋巴细胞分离液1077
11.准备足够的新50ml试管用以2倍稀释样本。向准备的所有50ml试管中倒入25mlhanks缓冲液。用10ml移液器转移25ml细胞悬浊液到各个试管中。向第11步的所有试管中各移入30ml稀释过的细胞悬液。
12.离心所有试管(400g，室温)40分钟。
13.吸取，弃用上层液体直到液面到底层白细胞的距离为1cm。
14.准备新的50ml试管。小心翼翼地用10ml移液器收集白细胞。
15.将每两个试管中的白细胞收集，移入一个新的50ml试管中。
16.准备T75细胞培养瓶(DC培养瓶)。标注日期。加10ml室温下的ALyS505N-0培养液到每个培养瓶中。
17.用10ml移液器向细胞试管中加入10ml ALyS505N-0。重新使细胞悬浮。加入1ml青链霉素双混合液，50ul的200mM L-谷氨酰胺。
18.向每个DC培养瓶里转移5ml细胞悬浊液。
19.扣上培养瓶盖子。慢慢的摇晃瓶子以使细胞悬液均匀。放进培养箱培养2小时(37℃，5％CO2)。
20.当2小时培养快要结束前，制备DC培养液。制备方法如下：
在室温下向每15ml的CELL GRO DC培养液里加入10.9ul GM-CSF(800U/ml)，7.5ulIL-4(500U/ml)，7.5ul IL-13(500U/ml)，4ul抗CD83抗体(500U/ml)，和0.15ml的自体血清(1％)。
21.PBMCs的两个小时培养结束后，用显微镜确保细胞黏附在培养瓶的底部。
22.温柔的前后摇晃培养瓶10次使非贴壁的细胞悬浮，转移非贴壁细胞悬液到50ml试管中。
23.迅速的向每个DC培养瓶中加入15ml DC培养液，放入培养箱培养3天(37℃，5％CO2)。
24.培育期间如果DC培养瓶的培养液变成橘黄色，则加入7.5ml/F的DC培养液
DC细胞的收获
1.确认收获的细胞培养瓶。
2.确保内毒素检测为阴性。
3.准备一个冰盒来暂存细胞，准备冰冷的RPMI1640。
4.准备0.1-0.15mM EDTA的hanks溶液。
5.用显微镜检查所有要收获的DC培养瓶。
6.用10ml移液器上下转移培养瓶中的液体5次来使黏附的细胞悬浮。转移细胞悬浮液到一个新的50ml试管中。向培养瓶中加入10ml RPMI1640，并用用10ml移液器上下转移培养瓶中的液体5次来使黏附的细胞悬浮。转移细胞悬浮液到上述50ml试管中。将试管放在冰上暂存。
7.用倾倒的方法向每个培养瓶中倒入大约15ml的0.1-0.15mM EDTA的hanks溶液。培育30分钟37℃。
8.30分钟后，用10ml移液器上下转移培养瓶中的液体20次使细胞悬浮。转移细胞悬液到50ml试管中。用10ml移液器转移10ml RPMI到培养瓶中，清洗培养瓶5次。转移细胞悬液到50ml试管中，放在冰上暂存。
9.当所有细胞都被收获到试管中以后，离心试管5分钟(400g，4℃)。离心结束后，吸取移除上层液体。用少量的RPMI 1640使50ml试管内细胞悬浮。转移所有试管中的细胞悬液到其中一个试管中，加入RPMI 1640直到50ml。取样本用于FACS检测。
10.计算DC细胞的数量以及存活率。
11.离心试管5分钟(1500rpm，4℃)
12.准备冷冻管在所有冷冻管上标记患者姓名，细胞名(DC)，细胞数量以及日期。
13.制备细胞冷冻液(CELL GRO DC培养液，20％自体血清，10％DMSO)暂存在冰上。
14.离心细胞试管5分钟(400g，4℃)离心结束后，倒出弃用上层液体到一个无菌的试管中。
15.执行无菌检测
16.暂存细胞在冰上。
17.向细胞试管中加入冷冻液，用移液器混匀。
18.冷冻保存
以下结合相应的试验数据进一步说明本发明的有益效果。
试验一：采用实施例1所述方法的两袋不同病人血浆的细胞数量，分别采用实施例1-A、实施例1-B表示，见表1。
表1细胞数量检测表
组别 细胞数
实施例1-A 1.42x10^7/ml
实施例1-B 1.48x10^7/ml
表1表明：实施例1-A的细胞数为1.42x10^7/ml，实施例1-B的细胞数为1.48x10^7/ml，采用常规方法的细胞数一般为0.96-0.11x10^7/ml，采用本发明所述方法其细胞数量以及纯度比常规方法明显要高很多。
试验二：FACS流式细胞仪鉴定，采用实施例1所述方法的两袋不同病人血浆，分别采用实施例1-A、实施例1-B表示，见表2。
表2FACS流式细胞仪鉴定结果
表2表明：实施例1-A、实施例1-B的CD11c分别为87.22、86.42，常规方法测定结果一般为61-63左右；CD14分别为36.71、34.95，常规方法测定结果一般为25-26左右；HLA-DR分别为70.30、68.94，常规方法测定结果一般为57-60左右；CD86分别为65.37/72.86，常规方法测定结果一般为54-58。采用本发明所述方法，效果明显高于常规方法。

Claims (7)

1.一种未成熟树突状细胞培养液，其特征在于采用以下方法制备：在室温下向15ml的CELL GRO DC培养液里加入10.5-11.2ul浓度为800U/ml的GM-CSF，7.3-7.8ul浓度为500U/ml的IL-4，7.3-7.8ul浓度为500U/ml的IL-13，3.8-4.2ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体，0.13-0.17ml浓度为1％的自体血清。
2.如权利要求1所述的一种未成熟树突状细胞培养液，其特征在于：在室温下向每15ml的CELL GRO DC培养液里加入10.9ul浓度为800U/ml的GM-CSF，7.5ul浓度为500U/ml的IL-4，7.5ul浓度为500U/ml的IL-13，4ul浓度为500U/ml的抗CD83抗体，0.15ml浓度为1％的自体血清。
3.采用权利要求1所述的一种未成熟树突状细胞培养液的未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将血浆处理后收集白细胞，将白细胞移入50ml细胞试管中；
2)准备DC培养瓶，加10ml室温下的ALyS505N-0培养液到每个DC培养瓶中，用10ml移液器向细胞试管中加入10ml ALyS505N-0，重新使细胞悬浮，加入0.9-1.1ml青链霉素双混合液，48-52ul的200mM L-谷氨酰胺；向每个DC培养瓶里转移5ml细胞悬浊液，扣上DC培养瓶盖子，慢慢的摇晃瓶子使细胞悬液均匀，放进培养箱培养1.8-2.2小时，37℃，5％CO2，当培养快要结束前，制备DC培养液；
3)在PBMCs培养结束后，用显微镜确保细胞黏附在培养瓶的底部；温柔的前后摇晃培养瓶10次使非贴壁的细胞悬浮，转移非贴壁细胞悬液到50ml试管中；迅速的向每个DC培养瓶中加入14-16ml DC培养液，放入培养箱培养3天，36-38℃，4.5-5.5％CO2；培育期间如果DC培养瓶的培养液变成橘黄色，则加入7.3-7.7ml/F的DC培养液；
4)确认收获的细胞培养瓶，确保内毒素检测为阴性，准备一个冰盒暂存细胞，准备冰冷的RPMI1640，准备0.1-0.15mM EDTA的hanks溶液，用显微镜检查所有要收获的DC培养瓶；
5)用10ml移液器上下转移DC培养瓶中的液体5次来使黏附的细胞悬浮，转移细胞悬浮液到一个新的50ml试管中，向DC培养瓶中加入10ml RPMI1640，并用用10ml移液器上下转移DC培养瓶中的液体5次来使黏附的细胞悬浮，转移细胞悬浮液到上述50ml试管中，将试管放在冰上暂存；
6)用倾倒的方法向每个DC培养瓶中倒入14-16ml的0.1-0.15mM EDTA的hanks溶液，36-38℃培育28-32分钟，培育结束后，用10ml移液器上下转移DC培养瓶中的液体20次使细胞悬浮，转移细胞悬液到50ml试管中；用10ml移液器转移10ml RPMI到DC培养瓶中，清洗DC培养瓶5次，转移细胞悬液到50ml试管中，放在冰上暂存；
7)当所有细胞都被收获到试管中以后，离心试管4-5分钟，400g，4℃；离心结束后，吸取移除上层液体，用2-5ml的RPMI 1640使50ml试管内细胞悬浮；转移所有试管中的细胞悬液到其中一个试管中，加入RPMI 1640直到50ml，取样本用于FACS检测，计算DC细胞的数量以及存活率；离心试管4-5分钟，1500rpm，4℃；准备冷冻管，制备细胞冷冻液，细胞冷冻液由CELL GRO DC培养液、20％自体血清、10％DMSO组成，暂存在冰上；离心细胞试管5分钟，400g，4℃；离心结束后，倒出弃用上层液体到一个无菌的试管中；执行无菌检测，暂存细胞在冰上，向细胞试管中加入冷冻液，用移液器混匀，冷冻保存。
4.如权利要求3所述的一种未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于步骤1)中：确认血浆袋的吸取管密封，用两张不同的浸泡在70％乙醇的无菌室专用清洁纸擦拭吸取管和剪刀；用镊子夹住吸取管，剪开管道前端并用镊子控制流速以转移血浆到50ml试管内，记录转移的血浆容量；离心试管，400g，4℃，30分钟以移除血小板；把上层液体倒入一个新的50ml试管，把试管放入56℃恒温水槽内，培养30分钟；离心式管，400g，4℃，60分钟以移除沉淀的纤维蛋白；把上层自体血清倒入一个新的50ml试管，4℃冷藏；确认PBMC袋的吸取管密封，悬挂好PBMC袋，用两张不同的侵泡在70％乙醇的无菌室专用清洁纸擦拭吸取管和剪刀；转移细胞到50ml试管中，记录转移的容量；计算所需的50ml试管的数量，向所有试管中加入15ml淋巴细胞分离液1077；准备足够的新50ml试管用以2倍稀释样本，向准备的所有50ml试管中倒入25ml hanks缓冲液，用10ml移液器转移25ml细胞悬浊液到各个试管中，向所有试管中各移入30ml稀释过的细胞悬液；离心所有试管，400g，室温，40分钟；吸取，弃用上层液体直到液面到底层白细胞的距离为1cm；准备新的50ml试管，小心翼翼地用10ml移液器收集白细胞；将每两个试管中的白细胞收集，移入一个新的50ml试管中。
5.如权利要求3所述的一种未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于步骤3)中：向每个DC培养瓶中加入15ml DC培养液，放入培养箱培养，37℃，5％CO2；培育期间如果DC培养瓶的培养液变成橘黄色，则加入7.5ml/F的DC培养液。
6.如权利要求3所述的一种未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于步骤4)中：准备0.12-0.13mM EDTA的hanks溶液。
7.如权利要求3所述的一种未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于步骤6)中：向每个DC培养瓶中倒入15ml的0.14mM EDTA的hanks溶液，37℃培育30分钟。
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