SE432778B - Sett att adaptera normalt forankringsberoende etablerade cellinjer till suspensionskultur - Google Patents

Description

7712376-s 10 15 20 25 30 35 2 _ tillfredsställande ersätta kontakt mellan cell och substrat, varigenom det blir möjligt med vätskesuspensionstillväxt av normalt förankringsberoende celler.

Cellerna fortsätter att delas med samma fördubblingstid som vid substratbundna kulturer med föga eller ingen erforderlig adaptationsperiod.

Den långa adaptationsprocess, 'som tidigare vanligen erfordrats för omvandling från substratförankringsberoende till encellsuspensionskultur , inbe- griper selektering av celler med skilda egenskaper och potentiell förlust av den önskade produkten. Den snabba omvandlingen till aggregatsuspension, enligt definitionen häri kräver inte sådan selektion och undviker generellt förlust av cellegenskaper. Celler kan förökas under långa perioder som aggregatsus- pensioner eller kan ofta omvandlas från substratbundna kulturer, 'om fortsatt suspensionsförökning innebär selektion mot några önskade egenskaper. Celler kan även hållas frusna under långa tidsperioder, tinas upp och ympas i den substratbundna kulturen och snabbt omvandlas till aggregatsuspension enligt uppfinningen.

Den önskade cellinjen odlas först i en substratbunden kultur. Under den substratbundna tillväxtpedrioden skall cellinjen adapteras för snabb tillväxt i samma medium, som därefter skall användas i suspensionskulturen.

En mångfald normalt förankringsberoende etablerade däggdjurscellinjer har snabbt adapterats till tillväxt i agiterad vätskesuspensionskultur medelst sättet enligt uppfinningen. Dessa cellinjer, som är exempel och illustration av uppfinningenmen inte utgör någon begränsning av denna, är följande: Den SV-ll0 transformerade humana lungcellinjen betecknas Wi 38, VAl3: ATCC nr CCL 75.1. ' _ ' Den SV-ll-O transformerade humana lungcellinjen betecknas 1V126, VA4: ATCC nr CCL 95.1.

Den SV-llO transformerade musnjurcellinjen betecknad TCMK-1: ATCC nr 139.

Den renala adenocoarcinoma muscellinjen betecknad RAG: ATCC nr CCL M2.

Den Kirstenvirus-transformerade musembryoceliinjen betecknad KNlH.

Den SV-ßfitransformerade musembryocellinjen betecknad SV3T3.

Kulturer av sistnämnda tvâ cellinjer för användning vid uppfinningen har erhållits från Dr. Judah Folkman vid Harvard Medical School, medan kulturer av de andra erhölls från American TypeiCulture Collection, Rockland, Maryland.

KNll-l-cellinjen är härledd från NIH musembryofibroblaster, ursprungligen odlade av Jainchill m.fl. J. Virology, 14-, 549-53 (1969), vilka transformerats genom Kirstenvirus, ett murinsarkomvirus isolerat av Kirsten m.fl., J. Nat. . Cancer.

Inst. 39, 311-35 (1967). 10 15 -20 25 30 35 7712376-8 3 Andra lämpliga etablerade cellirxjer för adaptation till agiterad vätske- suspensionskultur enligt sättet enligt uppfinningen är uppenbara för fackmannen.

För uppfinningens ändamål menas med uttrycket "etablerad" cellinje en cellinje, som demonstrerar potentialen att obegränsat kunna subkultiveras in vitro. Detta är i enlighet med den användning av djurvävnadskulturtermer som föreslagits, av S. Federoff och accepterats av Tissue Culture Association vid dess årsmöte den 3 juni 1966 i San Francisco. _ Lämpliga odlingsmedier för cellväxten innehåller assimilerbara källor för kväve, kol och oorganiska salter. Dessa kan vara något av de välkända vävnadskulturmedierna, exempelvis Basal Medium Eagle's (BME), Eagle's Mini- mum Essential Medium (MED), Dulbeccds Modified Eagle Medium, Medium 199 och balanserade saltlösningar (B55) såsom de från Earle och Hanks förstärkta med olika näringsämnen. Dessa är kommersiellt tillgängliga vävnadskulturmedier och beskrivs i detalj av HJ. Morton i ln Vitro, 6, 89-108 (1970). Dessa kulturmedier innehåller kända essentiella aminosyror, mineralsalter, vitaminer och kolhydrater. De är även ofta förstärkta med däggdjurssera såsom fetalt kalvserum.

Före suspensionsodlingen skall den etablerade cellinjen odlas i det önskade kulturmediet till ett stadium förbi det för vanlig enkelskikttillväxt i en substratbunden kultur, varigenom flerskikt av celler bildas och cell-till- cellkontakter upprättas i tre dimensioner. Detta kan genomföras genom att man ofta återympar de substratbundna cellerna utan subkultivering. Denna tillväxt kan genomföras i vanliga odlingsflaskor såsom Falconflaskor om 75 cmz.

Den behandling, som används för att frigöra cellerna från substratet, är kritisk. Den måste vara sådan, att den ger aggregat eller klumpar av celler, som går från cirka 20p till cirka 500 p i diameter. Inom detta omrâde är det föredraget att cirka 75% av cellerna är i aggregat om cirka sex till cirka 100 celler per aggregat. Det inses att en liten andel enkelceller kan vara närvarande på grund av att de misslyckats att klumpa samman eller som resultat av separation från cellaggregaten under hanteringen av cellerna. Det är föredraget att undvika överföring av ett otillbörligt antal sådana enkelceller till den agiterade vätskesuspensionskulturen, eftersom de tenderar att dö. Då cellaggre- gaten är alltför stora, t.ex. större än cirka 500 p i diameter, när otillräckligt med näringsämnen de celler som befinner sig i mitten och toxiska material bildas, vilka inhiberar tillväxten eller förstör livsdugligheten hos cellerna.

Den önskade frigöringen av cellerna från substratet underlättas genom enzymatisk dissociation såsom trypsinisering och liknande vid rumstemperatur (generellt cirka 20-2500, följt av noggrann observation under mikroskop.

Enzymbehandlingen kan resultera i tre olika fysikaliska arrangemang av celler, 7712376-8 10 15 20 25 30 35 4 nämligen som enkelceller, som aggregat eller klumpar av celler eller som stora cellsjok. Då cellerna frigörs i aggregat av den önskade storleken, är ingen ytterligare behandling nödvändig. Om cellerna emellertid frigörs övervägande en och en eller i stora sjok måste ytterligare åtgärder vidtagas. Vid frigöring en och en får kulturflaskorna stå vid rumstemperatur tills de önskade klumparna bildas.

De cellerna, som frigjorts genom den enzymatiska behandlingen, är klibbiga och kommer att efter en tid bilda aggregat, om de inte agiteras. När stora cellsjok bildas, skall dessa uppdelas eller sönderbrytas till den önskade aggregatstorleken genom försiktig agitering såsom skakning eller genom passage genom en liten öppning, t.ex. en pipettspets eller nål med den önskade diametern. _ Enzymer lämpliga för användning vid ovanstående frigöring av celler från substratet är, som exempel men ingen begränsning trypsin, pronas, collagenas och hyaluronidas. Trypsin är det föredragna enzymet, och det är lätt tillgängligt kommersiellt från sådana enzymtillverkare som Miles Laboratories, lnc. och Worthington Biochemical Corp. För bakgrundsinformation beträffande använd- ningen av dessa enzymer i primär vävnadsdissociation hänvisas till Kruse och Patterson, Tissue Culture Methods and Applications, Academic Press, 1973 sektion l, sid. 3-36. ' Efter lämplig frigöring från substratet överförs cellaggregaten till ett snabbt omrört spinnerkärl, som innehåller färskt kulturmedium. Dessa kärl kan - vara tillverkade exempelvis av glas, plast eller metall. En rostfri stålmantel- fermentor av den typ, som tillverkas av New Brunswick Scientific Co. Inc., är i allmänhet lämplig när den modifieras genom att bafflarna tas bort, och likaledes är glasspinnflaskor av den typ, som tillverkas av Bellco Glass Inc. lämpliga.

Illustrativa exempel på sådana fermentorer är de anordningar, som beskrivs i US- A-3.445.34l och 3. 445.342. Exempel på omrörda spinnflaskor är sådana, som beskrivs i US-A-2.958.5l7 och 3.622.129. En annan sådan apparat för agiterad vätskesuspensionsodling i stor skala beskrivs i US-A-3.039.932. Omrörningshas- tigheten vid användning av dessa spinnkärl är företrädesvis från cirka 200 till cirka 300 varv/min. _ För att säkerställa tillfredsställande förökning av cellerna i suspensions- kulturen bör koncentrationen av celler som överförs från det vídhäftade substratet till spinnkärlet vara minst 106 celler/ml av suspensionen.

Under suspensionskulturens tillväxtperiod bör pH hållas vid cirka 6,7 till cirka 7,7 och företrädesvis vid cirka 7,0 till cirka 7,4. Detta pH kan lämpligen' bibehâllas genom användning av en lämplig buffert som t.ex. fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) eller andra välkända buffertar som har angivet pH.

Kulturtemperaturen skall gå från cirka 30°C till cirka 38°C och före- trädesvis från cirka 35°C till cirka 37°C. 10 20 25 30 .40 7712376-8 5 Under suspensionskulturtillväxtperioden kan successiva överföringar av de växande cellerna till färska media föras med .förutbestämda periodiska intervall. Dessa överföringar kan göras till allt större odlingskärl innehållande färska näringsmedier såsom förut för att underlätta snabb förökning av cellerna i stor skala. _ Efter lämplig celltillväxt, exempelvis efter en tvåveckors cellodlings- period vid 35-37°C, kan cellerna skördas från suspensionen, t.ex. genom sedimentering eller centrifugering vid 200-1000 g. De packade cellerna tvättas sedan omsorgsfullt, t.ex. i koksaltlösning, lakterad Ringers lösning, PBS eller andra sådana vattenlösningar, som har ett pl-l från cirka 6,7 till cirka 7,7 och företrädesvis från cirka 7,0 till cirka 7,l+. De tvättade cellerna kan behållas för ytterligare användning efter behov eller extraheras med avseende på önskade produkter, t.ex. enzymer, hormoner, antikroppar och cellmetaboliter.

Följande detaljerade Exempel illustrerar uppfinningen ytterligare, men uppfinningen är inte begränsad till dessa specifika Exempel.

Exempel 1.

En kultur av den SV-ll0 transformerade humana lungcellinjen, betecknad Wl26, VAÅL, erhölls från American Type Culture Collection under depositionsnum- mer CCI. 95.1. Kulturen hölls under 60 dagar substratbunden i en 75 cmz Falconkolv av plast. Under denna period adapterades cellerna till det medium, som skulle användas för efterföljande suspensionskultur, nämligen Dulbecco's Modified Minimum Essential Medium med 4,5 g/ml glukos och med tillsats av 10% fetalt kalvserum. Cellerna subkultiverades med veckointervall och mediet tillfördes färskt medium varannan dag. Under de sista två veckorna subkultivera- des inte cellerna, men underhölls med daglig mediumpåfyllning.

Efter de 60 dagarna skördades sex 75 cm kolvar med tätt packade flerskiktceller enligt följande: Det förbrukade mediet hälldes av. Fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) vid pH 7,2 med 0,02% dinatrium-etylendiamintetraacetat (EDTA) användes för att skölja de vidhäftade cellerna. Sköljningen upprepades. Därefter tillsattes 5 ml 0,296 trypsin i PBS med 0,02% EDTA och fick stå över cellerna i rumstemperatur.

Kolvarna observerades noggrant i ett omvänt mikroskop. Efter tre minuters hâlltid gav lätt agitering av kolvarna cellaggregat i det önskade området av 20 p till 50011 diameter. Denna agitering åstadkoms genom att man höll kolven upprätt i en hand med cellerna fästa vid ytan under vätskan och sakta slog den i den andra handflatan. Sålunda åstadkoms en rörelse, som gick från långsamma vågor till turbulent tvättning av cellerna i vätskan. Cellerna utsattes därigenom för en skjuvningskraft mellan den rörliga vätskan och den relativt stationära kolven.

Den resulterande 5 ml cellaggregatsuspensionen överfördes till en 500 ml 7712576-8 l0 15 20 25 30 35 6 Bellco spinnerkolv innehållande 200 ml medium. Kulturen inkuberades i ett varmt rum vid 37°C med en omrörningshastighet av cirka 250 varv/min. Cellerna fortsatte att växa utan att minskad eller fördröjd hastighet observerades.

Medium tillfördes med periodiska intervall och kulturen överfördes tillfstörre kärl enligt följande: Efter 4-8 timmar tillsattes ytterligare medium för att bringa den totala suspensionsvolymen till 500 ml.

Efter totalt 144 timmar användes 400 ml av suspensionen för att inokulera en 3 liters Bellco spinnerbehâllare innehållande 21 medium. 400 rnl färskt medium sattes till den ursprungliga 500 ml spinnerflaskan. 3 liters i luft. Båda flaskorna omrördes fortsättningsvis vid 250 varv/min i det 37°C varma rummet. spinnerflaskan överskiktades med en liter per minut av 5% C02 Volymen av suspensionen i 3 liters spinnerflaskan ökades till 4 liter (en liter över den nominella kapaciteten) med färskt medium efter totalt 240 timmars aggregatsuspensionsodling. 500 ml spinnerflaskan skördades sedan och cellerna frystes i flytande kväve vid denna tidpunkt.

Efter 335 timmar överfördes 3 liter av suspensionen till en 12 liters spinnerbehållare och färskt medium sattes till 3 liters- och l2-litersspinnerflas- korna för att bringa deras volymer till 4 resp. 12 liter. Båda inkuberades med 5% C02 i överstâende luft vid 37°C och 250 varv/min.

Efter totalt 480 timmar efter initieringen av aggregatsuspensionskultur- en skördades 16 liters suspensionen genom centrifugering för att ge 30 ml packade celler. DNA-bestämning (140 l' 2,5 mg DNA) indikerade ett utbyte av cirka 1,0 t 0,03 x 1010 celler.

Exempel 2 En annan normalt förankringsberoende human cellinje, nämligen den SV- 40 transformerade humana lungcellinjen betecknad WI38, VA13 (ATCC nr CCL 75,1), adapterades snabbt till agiterad vätskesuspensionskultur under väsentligen samma procedurer och förhållanden som användes vid Exempel 1. Efter totalt 38 dagar efter initieringen av aggregatsuspensionskulturen skördades 16 liter av suspensionen och gav 1,84 f 0,3 x 1010 celler.

Exempel 3.

En tredje normalt förankringsberoende cellinje, nämligen den SV-40 transformerade musnjurcellinjen betecknad TCMK-l (ATCC nr CCL 139), adapterades till agiterad vätskesuspensionskultur under väsentligen samma procedurer och förhållanden som vid Exempel 1. Efter totalt 19 dagar efter lnitieringen av aggregatsuspensionskulturen skördades 16 liter av suspensionen och gav 2,57 i' 0,05 x 1010 ceuef. l0 15 20 :s 7712376-8 7 Exempelfl _ En annan normalt förankringsberoende muscellinje, nämligen den SV-40 transformerade musembryocellinjen betecknad SV3T3, adapterades snabbt till agiterad vätskesuspensionskultur under väsentligen samma procedurer och förhål- landen som vid Exempel l. Efter totalt l-'L dagar efter initieringen av aggregatsuspensionskulturen skördades 60 liter av suspensionen och gav 8,11' 0,22 x 1010 celler.

Exempel 5.

En annan normalt förankringsberoende musembryocellinje, nämligen den Kirsten-virustransformerade cellinjen, betecknad KNIH, adapterades snabbt till agiterad vätskesuspensionskultur under väsentligen samma procedurer och förhål- landen som i Exempel 1. Efter totalt 15 dagar efter initieringen av aggregatsus- pensionskulturen skördades 60 liter av suspensionen och gav en visuellt observerad, betydande cellmängd, även om ingen faktisk cellräkning gjordes såsom vid Exempel 1.

Exempel 6. Ännu en normalt förankringsberoende muscellinje, nämligen den renala adenocarcinomamuscellinjen betecknad RAG (ATCC nr CCL 142), adapterades snabbt till agiterad vätskesuspensionskultur under väsentligen samma procedurer och förhållanden som i Exempel l. Efter totalt l0 dagar efter initieringelt av aggregatsuspensionskulturen skördades 4 liter av suspensionen och gav en visuellt observerad betydande celimängd, även om ingen faktisk cellräkning genomfördes som i Exempel l.

Många andra exempel är uppenbara för den fackman, som studerat föreliggande beskrivning, och uppfinningen är avsedd .att omfatta alla sådana exempel, som ligger inom ramen för de bifogade patentkraven.

Claims (6)

7712376-3 10 15 20 25 8 PATENTKRAV
1. l. Sätt att snabbt adaptera normalt förankringsberoende etablerade cell- linjer till agiterad vätskesuspensionskultur, k ä n n e t e c k n a t av att man på i och för sig känt sätt odlar ett inokulum av nämnda cellinje på en härför lämpad yta till ett stadium förbi det för vanlig enkelskikttillväxt, varigenom ílerskikt av celler bildas, frigör de ytförankrade 7 cellerna genom enzymatisk dissociation, såsom tryptinisering, följt av försiktig agitering, så att man får cellaggregat från 20 mikron till 500 mikron i diameter, överför dessa oellaggregat till en vätskesuspension av näringskulturmedium av kända essentiella aminosyror, mineralsalter, vitaminer och kolhydrater, inkuberar vid en temperatur från 30 till 38°C, under det att man väsentligen kontinuerligt upprätthåller agitering av mediet, periodiskt överför de växande cellerna till färskt näringsmedium och fortsätter den agiterade inkubationen, varigenom cellerna fortsätter att förökas i aggregat.
2. 2. Sätt enligt krav 1, g k ä n n e t e c k n a t av att inkubationstemperaturen är från 35 till ca 37°C.
3. 3. Sätt enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att näringskulturmediet är förstärkt med däggdjurs- SeFUm.
4. 4. Sätt enligt något av kraven i, 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a t av att cellinjen är enSV-llfl-transformerad cellinje.
5. 5. Sätt enligt något av kraven l-li, k ä n n e t e c k n at av att näringskulturmediet är Dulbecco's Modified Minimum Essential Medium.
6. 6. Sätt enligt något av kraven 1-5, k ä n n e t e c k n a t av att frigöringen av cellerna från den substratfixerade kulturen dessutom åtföljs av omsorgsfull observation med hjälp av ett mikroskop för att säkerställa bildningen av cellaggregat inom nämnda diameteromrâde.