ES2248920T3

ES2248920T3 - Lineas celulares de encapsidacion en suspension para vectores retrovirales.

Info

Publication number: ES2248920T3
Application number: ES98955512T
Authority: ES
Inventors: Stefan Seeber; Stefan Koch; Thorsten Gutjahr; Ulrich Steegmans; Rudiger Ruger
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1997-10-25
Filing date: 1998-10-22
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2018-10-22
Also published as: JP2001520879A; CA2306634A1; JP3517399B2; NO20002013D0; TR200001125T2; DE59813048D1; CN1277631A; KR100359542B1; CA2306634C; BR9812960A; AU729986B2; EP1025207A1; EP1025207B1; IL135541A0; IL135541A; HUP0004240A2; NZ503827A; AU1231399A; WO1999021967A1; ATE304048T1

Abstract

Procedimiento para la obtención de una línea celular de encapsidación que crece completamente en suspensión, caracterizada porque una línea celular de encapsidación que crece de forma adherente, la cual es transfectada con ácidos nucleicos, los cuales codifican las secuencias auxiliares, y con un plásmido vector de retrovirus, o es transducida con un vector de retrovirus, y es cultivada en un medio que contiene suero, se convierte en una línea celular que crece en suspensión, mediante, reducción continuada del contenido de suero en el medio hasta ausencia de suero, tratamiento repetido de las células con tripsina y/o ADNasa para separar las células del soporte, en donde la densidad de las células en suspensión se mantiene en un margen entre 5 x 104 y 1 x 106 células/ml.

Description

Lineas celulares de encapsidación en suspensión para vectores retrovirales.

Son objeto de la presente invención procedimientos para la obtención de líneas celulares de encapsidación en suspensión que crecen exentas de suero, para vectores retrovirales.

Los virus constan de un genoma que codifica genes virales, así como de una cápsida vírica, la cual como en el caso de los retrovirus puede estar rodeada de una cubierta en forma de membrana.

En el caso de los retrovirus se diferencia los elementos cis 5'-LTR, 3'-LTR, la secuencia de encapsidación Psi, el lugar + y - de unión del cebador a la cadena, de los trans-elementos gag (proteína de la cápsida), pol (transcriptasa inversa) y env (proteína de la cubierta). Los trans-elementos pueden estar substituidos en el genoma vírico con genes extraños; en este caso el virus no puede prescindir de los llamados virus auxiliares, los cuales pueden ser o bien, virus infecciosos completos o bien virus no infecciosos, p. ej., virus sin secuencias de encapsidación. Las células que contienen dichos virus auxiliares no infecciosos y/o genes auxiliares de uno o también de diferentes virus auxiliares, transientes, episomales o integrados en el episoma o en el genoma, reciben el nombre de líneas celulares de encapsidación. Las líneas celulares de encapsidación no liberan por ello ninguna partícula vírica infecciosa competente para la replicación. Si los genes auxiliares proceden de diferentes virus auxiliares, se designan los vectores aparecidos como vectores de retrovirus quiméricos; este proceso se designa como falsa tipificación. Se emplean habitualmente estos sistemas de encapsidación quiméricos p. ej., el GP+env Am 12 (Markowitz D.G. et al. en Trans Assoc. Am. Physicians 101 (1988) 212-218) lleva el gen gag-pol del ecotropeno MoMuLV y el gen env del anfótropo 4070 ampho-virus. En las líneas celulares de encapsidación pueden estar mezclados incluso genes env de varios virus (también con genes env genéticamente modificados).

Las líneas celulares de encapsidación pueden contener también los genomas auxiliares virales incompletos fragmentados, por lo cual se habla entonces de líneas celulares de encapsidación con genomas de virus divididos, y los cuales representan una variante elevada de seguridad frente a la liberación no deseada de virus infecciosos, competentes para la replicación mediante episodios de recombinación. En caso de que sin embargo sean transfectados o transducidos con un vector de retrovirus, el cual junto a los elementos cis todavía pueden llevar genes extraños, entonces estos genomas víricos se encapsidan y se liberan como infecciosos, pero no se liberan vectores de retrovirus competentes para la replicación. En este caso, se habla de una línea celular productora de retrovirus.

Todas las líneas celulares de encapsidación de retrovirus obtenidas hasta la fecha se basan en células adherentes, es decir, células que se mantienen en crecimiento sobre una superficie:

Markowitz, D.G. et al., describe en Trans. Assoc. Am. Physicians 101 (1988) 212-218, las líneas de encapsidación GP+E86 y GP+envAM12, basadas en células adherentes NIH3T3. Miller, A.D. et al., describe en Mol. and Cell. Biol. 6 (1986) 2895-2902, la línea celular de encapsidación PA317, basada en células adherentes NIH3T3. Miller A.D. et al., en J. Virol. 65 (1991) 2220-2224, describe la línea celular de encapsidación GALV PG13 basada en células NIH3T3. Danos O, et al., describe en PNAS USA 85 (1988) 6460-6464 las líneas celulares de encapsidación \Psi Cre y \Psi Crip, basadas en células NIH3T3.

Rigg, R.J. et al., describe en Virology 218 (1996) 290-295 la línea celular de encapsidación Propack A, la cual se basa sobre una línea celular humana. Cosset, F.-L. et al. describe en J. Virol. 69 (1995) 7430-7436 las líneas celulares de encapsidación FLY A13 y FLY RD18, las cuales se basan sobre una línea de sarcoma fibroso humano (HT10 80). En la patente WO 92/05266 se describen líneas celulares de encapsidación basadas sobre D 17 y otras líneas celulares cobertoras, adherentes.

También la mayoría de las líneas generales descritas se desarrollan de forma adherente. Las líneas celulares adherentes tienen la ventaja de que son fáciles de manejar. Así, p. ej., se puede clonar o respectivamente trabajar con virus, en particular, retrovirus con relativa facilidad en células adherentes, es decir, es directamente posible una selección clónica de las células por transfección o respectivamente, transducción, pueden reconocerse fácilmente colonias aisladas, contar y aislar por picadura, las células muertas se pueden separar fácilmente y por lo tanto no pueden cambiarse por las vivas, para el cambio de medio debe sencillamente sacarse pipeteando fuera y añadir un nuevo medio. La siembra y mantenimiento de las células no es crítico por regla general puesto que las colonias de células adherentes forman células que se estimulan recíprocamente como en la unión de tejidos. Unicamente en la transformación de las células es necesario efectuar en las células adherentes un tratamiento adicional con tripsina para separarlas del recipiente, lo cual por regla general no es crítico.

Las células en suspensión en desarrollo, necesitan para la clonación y para los experimentos de transducción otro espectro de métodos. Así, una selección clónica necesita el trabajo con adiciones inmovilizantes como Asoft-Agar, una serie de dilución de las células a la que se llama "limited dilution" ("dilución limitada") hasta llegar teóricamente a no más de 1 célula por recipiente, o el empleo de un marcador de superficie o de un marcador de fluorescencia (como el GFP), el cual hace posible la selección directa de células recombinantes mediante un seleccionador FAC. Las células vivas y muertas se pueden diferenciar solamente mediante una tinción coloreada. Un cambio de medio requiere siempre un paso de centrifugación.

Líneas celulares que crezcan en suspensión como líneas celulares de encapsidación de retrovirus, no son conocidas hasta el momento. No se han descrito tampoco hasta ahora ensayos, en los cuales se hayan convertido líneas celulares de encapsidación que crecen adherentes, en líneas que se desarrollan en suspensión.

Sorprendentemente se ha demostrado que es totalmente posible una rehabituación para lograr el crecimiento en suspensiones de líneas celulares de encapsidación establecidas que crecen adherentes, y que las líneas celulares de encapsidación en suspensión resultantes de las mismas están en situación de producir virus con altos títulos. Además pudo demostrarse que es igualmente posible obtener líneas celulares que producen retrovirus en desarrollo a partir de líneas celulares clásicas en suspensión como p. ej., de la línea celular de eritoleucemia humana K562, la línea de hepatoma de rata N1-S1 y la línea de linfoma de ratas C58 mediante cotransfección retroviral de plásmidos génicos de encapsidación con plásmidos de vectores retrovirales en líneas productoras de retrovirus que crecen en suspensión, es decir, que estas células liberan partículas de vectores de retrovirus, las cuales están en situación de transducir otras células.

La obtención de líneas celulares de encapsidación en suspensión se efectúa técnicamente de manera análoga a los procedimientos a menudo descritos para las células adherentes, mediante la aplicación de secuencias auxiliares (enteras, o de preferencia divididas) las cuales por si solas no están en situación de formar ningún virus infeccioso, o con la ya citada diferencia, de que las células en suspensión requieren otras técnicas de clonación y cultivo.

En caso de obtener una línea celular de encapsidación en suspensión, ésta puede por transducción con un vector de retrovirus compatible (p. ej., una línea celular de encapsidación anfótropa con un vector procedente de una línea celular de encapsidación), o de preferencia por transfección con un plásmido vector de retrovirus, convertirse en una línea celular que produce suspensiones de encapsidación en suspensión, la cual libera vectores de retrovirus infecciosos pero no libera vectores de retrovirus incompetentes para la replicación.

Hasta el momento no se conocen líneas celulares de mamíferos desarrolladas completamente en suspensión, como líneas celulares de encapsidación de retrovirus. Tampoco se conoce hasta ahora ningún procedimiento en el cual líneas celulares de encapsidación establecidas adherentes en desarrollo, se conviertan por completo en suspensión.

Es objetivo de la presente invención poner a punto un procedimiento para la obtención de líneas celulares de encapsidación, exentas de suero, que crezcan en suspensión para vectores retrovirales así como un procedimiento para su obtención y empleo.

Objeto de la invención es un procedimiento para la obtención de una línea celular de encapsidación, exenta de suero, que se desarrolla en suspensión, la cual se transduce con un vector de retrovirus.

Con el nombre de línea celular de encapsidación, se entiende una línea celular de mamífero, la cual contiene para la producción de partículas víricas los necesarios genes gag, pol y env (genes auxiliares) pero sin embargo, no contiene secuencias de encapsidación funcionales activas (\Psi). Una tal línea celular no puede formar a partir de sí misma ninguna partícula vírica con ARN genómico.

Con el nombre de secuencia funcional de encapsidación activa se entiende la región de un genoma de retrovirus, el cual activa funcionalmente la encapsidación del genoma de ARN. Su función puede desactivarse mediante una deleción completa o parcial, o por mutación.

De preferencia se obtiene según la invención una línea celular de encapsidación de retrovirus que crece completamente en suspensión (para el crecimiento - también durante largo tiempo, p. ej., días - no es necesaria ninguna matriz insoluble (pared del recipiente o microsoporte sobre la cual se mantienen las células), a partir de una línea celular de encapsidación de retrovirus que crece en adherencia, de manera que una tal línea celular de encapsidación adherente, durante un período de tiempo de por lo menos tres meses, se adapta paso a paso al crecimiento en suspensión. Los pasos mantienen una reducción contínua del contenido del FKS en el medio hasta la ausencia de suero, tratamiento repetido de las células con tripsina y/o ADNasa, el empleo del medio para las líneas celulares en suspensión (por ejemplo DMF024A), de preferencia en frascos de cultivo de tejidos para células en suspensión e hibridomas (Sarstedt), oscilación contínua de los frascos de cultivo en el agitador así como una densidad de células entre 5 x 10^{4} a 1 x 10^{6} células/ml (con este fin es necesario una división esencialmente más repetida que en las células del cultivo adherente comparativo).

De preferencia, la línea celular según la invención que crece completamente en suspensión, la cual está transfectada con un plásmido vector de retrovirus o está transducida con un vector de retrovirus, se obtiene de forma que una línea celular en suspensión es transfectada con un plásmido vector de retrovirus o es transducida con un vector de retrovirus, las células transfectadas o transducidas son seleccionadas mediante un marcador de superficie co-transfectado o co-transducido, mediante dilución limitada y/o adición de aditivos inmovilizados y se aislan las células en suspensión según la invención, así seleccionadas. De preferencia la línea celular en suspensión es una línea celular de encapsidación de retrovirus. Para la obtención de una línea celular de encapsidación de retrovirus que crece en suspensión se convierte de preferencia una línea celular de encapsidación de retrovirus que crece en adherencia, la cual está transfectada con ácidos nucleicos, los cuales codifican secuencias auxiliares y con un plásmido vector de retrovirus, o está transducida con un vector de retrovirus, y está cultivada en un medio que contiene suero, se convierte en una línea celular que crece en suspensión, mediante la reducción continuada del contenido de suero en el medio hasta la ausencia esencialmente completa de suero, tratamiento repetido de las células con tripsina y ADNasa para la separación de las células del soporte, manteniendo la densidad de células en suspensión un valor en el margen de 5 x 10^{4} a 1 x 10^{6} células/ml. Se prefiere particularmente efectuar este procedimiento en un tiempo más prolongado, de preferencia por lo menos tres meses. En otra versión preferida, las células transfectadas o transducidas mediante un marcador de superficie co-transfectado o co-transducido, se seleccionan mediante dilución limitada y/o adición de aditivos inmovilizados.

Se ha demostrado sorprendentemente que las líneas celulares de encapsidación que crecen completamente en suspensión, tratadas de esta forma, a pesar de la masiva manipulación a largo plazo de varios meses, están siempre en situación de producir retrovirus después de que han sido transfectados con plásmidos vectores de retrovirus o respectivamente transducidos con vectores de retrovirus.

Es igualmente sorprendente que esta clase de líneas celulares de encapsidación que crecen completamente en suspensión, mediante transfección con plásmidos vectores de retrovirus o respectivamente transducción con vectores de retrovirus mediante pasos de aislamiento, como la dilución limitada, en la cual las células se diluyen hasta tal punto que prácticamente existen solamente células aisladas en suspensión por cada recipiente, o mediante el empleo de aditivos inmovilizados como un Overlay-Agar o respectivamente metilcelulosas (Metho Cult H4100/Stem Cell Technologies) o de una selección de células frente a un marcador de superficie celular pueden ser clonadas, a consecuencia de lo cual aparecen a continuación líneas celulares productoras de retrovirus que crecen completamente en suspensión, las cuales están en situación en la misma medida, de producir vectores de retrovirus como las líneas celulares adherentes productoras de retrovirus.

Esta clase de líneas celulares obtenidas, productoras de retrovirus, permite en comparación con las líneas celulares adherentes productoras de retrovirus, un cultivo a gran escala esencialmente más fácil en procedimientos de cultivo con fermentos en agitación o mediante High-Density Diálisis.

Además, existen diferencias entre los métodos de obtención de los virus de vectores. Mientras que en las líneas celulares adherentes productoras de retrovirus, deben solamente apartarse los sobrenadantes del cultivo que contienen los retrovirus, en los que se realiza siempre un paso de filtración estéril, aunque no es obligatoriamente necesario, por razones de seguridad, en las líneas celulares productoras de retrovirus que crecen completamente en suspensión, deben separarse las partículas mucho más pequeñas, más ligeras de los vectores de retrovirus de las más grandes y más pesadas líneas celulares productoras, mediante un paso de filtración y de centrifugación o por lo menos 2 pasos de filtración.

Como plásmidos vectores de retrovirus o vectores de retrovirus se emplean aquellos vectores de retrovirus que contienen un gen terapéutico. Estos vectores no contienen ninguna secuencia de encapsidación como gag, pol, env, para evitar que se liberen los vectores de retrovirus competentes para la replicación en la obtención en la línea celular productora en suspensión.

Habitualmente el gen terapéuticamente relevante se inserta entre 5'-LTR y 3'-LTR, en el que están convenientemente contenidos los genes de selección como el gen resistente a la neomicina ó a la higromicina.

Con el nombre de vector de replicación competente (defectos de replicación) se entiende un vector que no contiene ninguna función génica retroviral (gag, env, pol) y por lo tanto no puede formar partículas de virus por si mismo. Sin embargo, el vector contiene habitualmente una función de encapsidación (psi). Para la formación de partículas retrovirales infecciosas, se transduce una línea celular de encapsidación (línea celular de encapsidación), la cual contiene las funciones génicas gag, env y pol de forma estable (como episoma o integrado en el genoma), con un vector de ADN con defecto de replicación, transducido. Se forman transcriptos de ARN, los cuales se encapsidan en partículas víricas debido a las funciones gag y env. Estas partículas víricas son deficientes de replicación puesto que el genoma de ARN contenido en los mismos no lleva ninguna función génica retroviral.

Abreviaturas

MoMuLV: Virus Moloney de leucemia de ratón

FKS: Suero fetal de ternera

\DeltaLNGFR: Receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad, en el que está suprimido el dominio intracelular (ver WO 95/06723)

SV40-P/E: Unidad promotor/potenciador de SV40

neoR: Gen de resistencia a la neomicina

pBR 322: Plásmido del vector de base de E. coli

T 25: Tamaño del frasco de cultivo de células

CMV-P/E: Unidad promotor/potenciador de CMV (ver p. ej., EP-B 0 173 177)

TK-P: Promotor timidinquinasa del Herpes Simplex

poli-A: Posición de la poliadenilación

hygR: Gen de resistencia a la higromicina

gpt: Gen de selección gpt

pUC19: Vector de base

pUC20: Vector de base

5'LTR MoMuLV: 5'LTR de MoMuLV

cfu: Unidades formadoras de colonias

Los siguientes ejemplos y publicaciones aclaran más la invención, cuyo ámbito de protección resulta de las reivindicaciones de la patente. Los procedimientos descritos deben entenderse como ejemplos, los cuales describen aún después de modificaciones el objeto de la invención.

Ejemplo 1

Adaptación de líneas celulares adherentes de encapsidación de retrovirus, al crecimiento en suspensión

Las líneas celulares adherentes de encapsidación FLY A13 (anfótropos env de MoMuLV) y FLY RD 18 (env de cat del virus endógeno RD114)(Cosset, F.-L. et al., J.Virol. 69 (1995) 7430-7436), basadas ambas sobre la línea de fibrosarcoma humano HT 1080, se adaptaron al crecimiento en suspensión mediante los siguientes pasos de procedimiento:

a) Adaptación de las líneas celulares adherentes de encapsidación al crecimiento en suspensión

I. Continuada y lenta reducción del FKS en el medio: Dauerca durante aproximadamente 5 meses; 10% de FKS \rightarrow 5% \rightarrow 2,5% \rightarrow 2% \rightarrow 1% \rightarrow 0,5% \rightarrow sin suero.

II. Empleo de un medio para las líneas celulares en suspensión

III. Empleo de frascos de cultivo para las líneas celulares en suspensión (Sarstedt).

IV. Continuadas, ligeras oscilaciones de los frascos de cultivo en el agitador

V. El mantenimiento requiere una separación más frecuente de los grumos de células que aparecen mediante tratamiento con tripsina y ADNasa y más frecuente división, para que permanezcan en suspensión.

La densidad de las células es siempre un factor crítico (5.10^{4} - 1.10^{6} células/ml), es decir no debe ser demasiado alto ni tampoco demasiado bajo.

b) Determinación del título de retrovirus de los cultivos transientes

Las líneas celulares de encapsidación que crecen en suspensión se compararon con respecto al comportamiento a la producción de vectores de retrovirus con las correspondientes líneas celulares de encapsidación que crecen adherentes.

Para ello se transfectaron todas las líneas celulares con el plásmido vector de retrovirus y se determinó el título en retrovirus de los cultivos transientes.

Material

\text{*}: Vector retroviral pL\DeltaNSN (6853 bp)

: [- componente plásmido 5'LTR MoMuLV - \Psi - \DeltaLNGFR - SV40-P/E - neoR - 3'LTR MoMuLV - pBR322 -]

\text{*}: Reactivo de transfección: DOSPER; cada vez 20 \mug de preparación DOSPER

: (fabricante: Boehringer Mannheim GmbH, DE)

\text{*}: Concentración del ADN del plásmido: 5 \mug ADN/preparación/plásmido

Métodos

: 1^{er} día: Siembra de células para la transfección:

: Células adherentes: en cápsulas de Petri de 60 mm con 6 x 10^{5} células por cada cápsula

: Células en suspensión: en frascos de cultivo para células en suspensión; (T25, Sarstedt) elevado a 3 x 10^{5} células por ml en cada uno; en total 2 ml.

: Incubación ü.N. a 37ºC, 5% de CO_{2}, con las células en suspensión agitándose ligeramente.

: 2º día: Cambio de medio (en las células en suspensión por centrifugación y resuspensión), mezcla ADN/ DOSPER preparada y añadida gota a gota sobre las células (cada vez 100 \mul de mezcla ADN/DOSPER).

: Incubación: 5-6 horas a 37ºC, 5% de CO_{2}. A continuación, adición del medio.

: 3^{er} día: 24 horas después de la transfección, separar el sobrenadante, centrifugar (solamente en las líneas celulares en suspensión), se filtra (filtro de 0,45 \mum) y se titulan las células con NIH3T3 (selección G418).

: Resultado de la titración: aproximadamente 10 - 14 días más tarde.

Título

Líneas celulares adherentes	FLY A13	8 x 105 cfu/ml
		2 x 105 cfu/ml
Líneas celulares puestas en suspensión	FLY RD18	no determinado hasta el momento
	FLY A13	2,4 x 103 cfu/ml
	FLY RD18	1 x 102 cfu/ml

Resultado

Las líneas celulares de encapsidación puestas en suspensión están en principio en situación de producir retrovirus recombinantes.

Pueden encontrarse diferencias en el título al trabajar con diferentes condiciones del ensayo en la transfección y en la determinación del título, p. ej., diferentes eficiencias de transfección en las células en suspensión y células adherentes y diferente estabilidad o respectivamente infecciosidad de los retrovirus en el medio exento de FSK y el medio conteniendo FSK.

Ejemplo 2

Producción de retrovirus después de la transfección triple transiente de los dos plásmidos auxiliares y del plásmido del vector de retrovirus en líneas celulares en suspensión

Se compararon una línea celular creciente adherente y varias crecientes en suspensión en preparaciones de transfección triple transiente, con respecto a la capacidad de formar vectores de retrovirus infecciosos.

Líneas celulares utilizadas

Línea celular adherente (control):: NIH3T3 (fibrosarcoma de ratón)

Líneas celulares en suspensión:: K562 (línea de células de eritroleucemia humana)

\quad: N1-S1 (hepatoma de rata)

\quad: C58 (linfoma de rata)

\newpage

\global\parskip0.960000\baselineskip

Material a) Plásmidos auxiliares

\text{*}: Plásmido de expresión gag-pol pGAPOGPT (10202 bp)

: [-componente plásmido CMV-P/E-gag-pol-polyA-SV40-P/E-gpt-polyA-pUC19-]

\text{*}: Plásmido de expresión ENV pENVCHT (7933 bp)

: [-componente plásmido TK-P-hygR-polyA-CMV-P/E- env (anfótropo) - I poly A-pUC20-]

b) Plásmido de vector retroviral

\text{*}: Vector retroviral pL\DeltaNSN (6853 bp)

: [-componente plásmido 5'LTR MoMuLV- \Psi-\DeltaLNGFR - SV40-P/E - neoR - 3'LTR MoMuLV - pBR322 -]

\text{*}: Reactivo de transfección: DOSPER (BM); cada vez 20 \mug de preparación DOSPER

\text{*}: Concentración del ADN del plásmido: 5 \mug de ADN/preparación/plásmido

Métodos

: 1^{er} día: Sembrar las células para la transfección:

: Células adherentes (NIH3T3): en cápsulas de Petri de 60 mm con 6 x 10^{5} células por cápsula

: Células en suspensión: en frascos de cultivo T25 (para células en suspensión; elevados) con 3 x 10^{5} células por ml en cada uno; en total 2 ml.

: 3^{er} día: 24 horas después de la transfección triple, se separa el sobrenadante, se centrifuga (solamente en las líneas celulares en suspensión), se filtra (filtro de 0,45 \mum) y se titulan las células con NIH3T3 (selección G418).

: Resultado de la titulación: aproximadamente 10 - 14 días más tarde.

Resultado de la titulación con NIH3T3 (número de colonias resistentes a G418)

NIH3T3 (células de control adherentes): 3 colonias por 1,4 ml de sobrenadante de virus (título: 2 cfu/ml)

K562: 6 colonias por 0,8 ml de sobrenadante de virus (título: 7,5 cfu/ml)

N1-S1: 6 colonias por 2 ml de sobrenadante de virus (título: 3 cfu/ml)

C58: 1 colonia por 2 ml de sobrenadante de virus (título: 0,5 cfu/ml)

Listado de referencias

Cosset, F.-L. et al., J. Virol. 69 (1995) 7430 – 7436

Danos, O. et al., PNAS USA 85 (1988) 6460 – 6464

Markowitz, D.G. et al., Trans. Assoc. Am. Physicians 101 (1988) 212 -218

Miller, A.D. et al., J. Virol. 65 (1991) 2220 - 2224

Miller, A.D. et al., Mol. and Cell. Biol. 6 (1986) 2895 – 2902

Rigg, R.J. et al., Virology 218 (1996) 290 – 295

WO 92/05266

Claims

1. Procedimiento para la obtención de una línea celular de encapsidación que crece completamente en suspensión, caracterizada porque

una línea celular de encapsidación que crece de forma adherente, la cual es transfectada con ácidos nucleicos, los cuales codifican las secuencias auxiliares, y con un plásmido vector de retrovirus, o es transducida con un vector de retrovirus, y es cultivada en un medio que contiene suero, se convierte en una línea celular que crece en suspensión, mediante,

reducción continuada del contenido de suero en el medio hasta ausencia de suero, tratamiento repetido de las células con tripsina y/o ADNasa para separar las células del soporte, en donde la densidad de las células en suspensión se mantiene en un margen entre 5 x 10^{4} y 1 x 10^{6} células/ml.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el procedimiento se efectúa en un espacio de tiempo de por lo menos tres meses.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las células transfectadas o transducidas se seleccionan mediante un marcador de superficie co-transfectado o co-transducido mediante dilución limitada y/o adición de aditivos inmovilizados.