JP3517399B2 - レトロウイルスベクターのための浮遊パッケージング細胞株 - Google Patents
レトロウイルスベクターのための浮遊パッケージング細胞株Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
【０００１】本発明は、レトロウイルスベクターのため
の浮遊パッケージング細胞株、および感染性の複製不能
レトロウイルスベクターを製造するための該細胞株の使
用に関する。
の浮遊パッケージング細胞株、および感染性の複製不能
レトロウイルスベクターを製造するための該細胞株の使
用に関する。
【０００２】ウイルスはウイルス遺伝子をコードするゲ
ノム、およびレトロウイルスの場合のように膜エンベロ
ープによって取り囲まれたウイルスカプシドで構成され
る。
ノム、およびレトロウイルスの場合のように膜エンベロ
ープによって取り囲まれたウイルスカプシドで構成され
る。
【０００３】レトロウイルスに関しては、シスエレメン
トである5'-LTR、3'-LTR、パッケージング配列Psi、＋
および−鎖プライマー結合部位と、トランスエレメント
gag（カプシド蛋白質）、pol（逆転写酵素）およびenv
（膜蛋白質）とを識別することができる。トランスエレ
メントはウイルスゲノム上の外来遺伝子に置き換えるこ
とができる；しかし、この場合ウイルスは、完全な感染
性ウイルスまたは非感染性ウイルス、例えばパッケージ
ング配列を持たないウイルスのいずれともなりうるいわ
ゆるヘルパーウイルスに依存する。そのような非感染性
ヘルパーウイルスおよび／またはゲノムに一過性に、エ
ピソームとして存在する、または組み入れられる１つも
しくは様々なヘルパーウイルスのヘルパー遺伝子を含む
細胞をパッケージング細胞株と呼ぶ。したがって、パッ
ケージング細胞株は感染性の複製可能ウイルス粒子を放
出しない。ヘルパー遺伝子が異なるヘルパーウイルスに
由来する場合、形成されるベクターはキメラレトロウイ
ルスベクターと呼ばれる；このプロセスは偽タイピング
（pseudotyping）と呼ばれる。通常、そのようなキメラ
パッケージングシステムが用いられ、例えばGP+env Am1
2（マルコヴィッツ（Markowitz, D. G.）ら、Trans. As
soc. Am. Physicians 101（1988）212〜218）は、異所M
oMuLVのgag-pol遺伝子および両栄養性の4070 Amphoウイ
ルスのenv遺伝子を有する。さらに、いくつかのウイル
ス（遺伝的に改変されたenv遺伝子を有するウイルスで
さえも）に由来するenv遺伝子の混合物がパッケージン
グ細胞株に存在することもなお可能である。
トである5'-LTR、3'-LTR、パッケージング配列Psi、＋
および−鎖プライマー結合部位と、トランスエレメント
gag（カプシド蛋白質）、pol（逆転写酵素）およびenv
（膜蛋白質）とを識別することができる。トランスエレ
メントはウイルスゲノム上の外来遺伝子に置き換えるこ
とができる；しかし、この場合ウイルスは、完全な感染
性ウイルスまたは非感染性ウイルス、例えばパッケージ
ング配列を持たないウイルスのいずれともなりうるいわ
ゆるヘルパーウイルスに依存する。そのような非感染性
ヘルパーウイルスおよび／またはゲノムに一過性に、エ
ピソームとして存在する、または組み入れられる１つも
しくは様々なヘルパーウイルスのヘルパー遺伝子を含む
細胞をパッケージング細胞株と呼ぶ。したがって、パッ
ケージング細胞株は感染性の複製可能ウイルス粒子を放
出しない。ヘルパー遺伝子が異なるヘルパーウイルスに
由来する場合、形成されるベクターはキメラレトロウイ
ルスベクターと呼ばれる；このプロセスは偽タイピング
（pseudotyping）と呼ばれる。通常、そのようなキメラ
パッケージングシステムが用いられ、例えばGP+env Am1
2（マルコヴィッツ（Markowitz, D. G.）ら、Trans. As
soc. Am. Physicians 101（1988）212〜218）は、異所M
oMuLVのgag-pol遺伝子および両栄養性の4070 Amphoウイ
ルスのenv遺伝子を有する。さらに、いくつかのウイル
ス（遺伝的に改変されたenv遺伝子を有するウイルスで
さえも）に由来するenv遺伝子の混合物がパッケージン
グ細胞株に存在することもなお可能である。
【０００４】パッケージング細胞株はまた、断片化した
形でインコンピテントウイルスヘルパーゲノムを含むこ
とができ、この場合それらは分割ウイルスゲノムを有す
るパッケージング細胞株と呼ばれ、これらは、組換えイ
ベントによる感染性の複製可能ウイルスの望ましくない
放出に対する安全性が比較的大きい変種である。
形でインコンピテントウイルスヘルパーゲノムを含むこ
とができ、この場合それらは分割ウイルスゲノムを有す
るパッケージング細胞株と呼ばれ、これらは、組換えイ
ベントによる感染性の複製可能ウイルスの望ましくない
放出に対する安全性が比較的大きい変種である。
【０００５】しかし、シスエレメントのほかに、外来遺
伝子も保有することができるレトロウイルスベクターを
トランスフェクトまたは形質導入すると、これらのウイ
ルスゲノムはパッケージングされて、感染性であるが複
製可能でないレトロウイルスベクターとして放出され
る。これをレトロウイルス産生細胞株と呼ぶ。
伝子も保有することができるレトロウイルスベクターを
トランスフェクトまたは形質導入すると、これらのウイ
ルスゲノムはパッケージングされて、感染性であるが複
製可能でないレトロウイルスベクターとして放出され
る。これをレトロウイルス産生細胞株と呼ぶ。
【０００６】これまでに産生されたレトロウイルスパッ
ケージング細胞株は全て、接着細胞、すなわち表面に接
着して増殖する細胞に基づいている。
ケージング細胞株は全て、接着細胞、すなわち表面に接
着して増殖する細胞に基づいている。
【０００７】接着性のNIH 3T3細胞に基づくパッケージ
ング細胞株GP＋E86およびGP＋envAm12は、マルコヴィッ
ツ（Markowitz, D. G.）らのTrans. Assoc. Am. Physic
ians101（1988）212〜218に記載されている。ミラー（M
iller, A. D.）らはMol. and Cell Biol. 6（1986）289
5〜2902において、接着性のNIH 3T3細胞に基づくパッケ
ージング細胞株PA317について記述している。ミラー（M
Iller, A. D.）らは、J. Virol. 65（1991）2220〜2224
において、NIH 3T3細胞に基づくGALVパッケージング細
胞株PG13について記述している。ダノス（Danos, O.）
らは、PNAS USA 85（1988）6460〜6464において、NIH 3
T3細胞に基づくパッケージング細胞株ψCreおよびψCri
pについて記述している。
ング細胞株GP＋E86およびGP＋envAm12は、マルコヴィッ
ツ（Markowitz, D. G.）らのTrans. Assoc. Am. Physic
ians101（1988）212〜218に記載されている。ミラー（M
iller, A. D.）らはMol. and Cell Biol. 6（1986）289
5〜2902において、接着性のNIH 3T3細胞に基づくパッケ
ージング細胞株PA317について記述している。ミラー（M
Iller, A. D.）らは、J. Virol. 65（1991）2220〜2224
において、NIH 3T3細胞に基づくGALVパッケージング細
胞株PG13について記述している。ダノス（Danos, O.）
らは、PNAS USA 85（1988）6460〜6464において、NIH 3
T3細胞に基づくパッケージング細胞株ψCreおよびψCri
pについて記述している。
【０００８】リグ（Rigg, R. J.）らは、Virology 218
（1996）290〜295において、ヒト細胞株に基づくパッケ
ージング細胞株Propack-Aについて記述している。コセ
ット（Cosset, F. L.）らはJ. Viol. 69（1995）7430〜
7436において、ヒト繊維肉腫株（HT10 80）に基づくパ
ッケージング細胞株FLY A13およびFLY RD18について記
述している。D17に基づくパッケージング細胞株および
その他の接着性のイヌ細胞株は国際公開公報第92/05266
号に記載されている。
（1996）290〜295において、ヒト細胞株に基づくパッケ
ージング細胞株Propack-Aについて記述している。コセ
ット（Cosset, F. L.）らはJ. Viol. 69（1995）7430〜
7436において、ヒト繊維肉腫株（HT10 80）に基づくパ
ッケージング細胞株FLY A13およびFLY RD18について記
述している。D17に基づくパッケージング細胞株および
その他の接着性のイヌ細胞株は国際公開公報第92/05266
号に記載されている。
【０００９】一般に記述されている細胞株の大部分が接
着して増殖する。接着細胞株の利点はそれらの取り扱い
が容易であるという点である。したがって接着細胞は、
比較的容易にクローニングして、ウイルス、特にレトロ
ウイルスを用いることができる、すなわちトランスフェ
クションまたは形質導入後に細胞クローンの直接的な選
択が可能であり、個々のコロニーを容易に認識して計数
し、選び取ることによって単離することができ、死細胞
は単に剥離するため生存細胞と間違うことはあり得ず、
培地を交換するためには単に上清をピペットで除去して
新しい培地を加えるだけでよい。接着細胞は組織単位で
互いに刺激する細胞のコロニーを形成することから、細
胞の播種および維持は通常重要ではない。細胞を移す際
には、それらを剥離させるために接着細胞にさらにトリ
プシン処理を行うことが必要であるが、これらは通常重
大な問題ではない。
着して増殖する。接着細胞株の利点はそれらの取り扱い
が容易であるという点である。したがって接着細胞は、
比較的容易にクローニングして、ウイルス、特にレトロ
ウイルスを用いることができる、すなわちトランスフェ
クションまたは形質導入後に細胞クローンの直接的な選
択が可能であり、個々のコロニーを容易に認識して計数
し、選び取ることによって単離することができ、死細胞
は単に剥離するため生存細胞と間違うことはあり得ず、
培地を交換するためには単に上清をピペットで除去して
新しい培地を加えるだけでよい。接着細胞は組織単位で
互いに刺激する細胞のコロニーを形成することから、細
胞の播種および維持は通常重要ではない。細胞を移す際
には、それらを剥離させるために接着細胞にさらにトリ
プシン処理を行うことが必要であるが、これらは通常重
大な問題ではない。
【００１０】浮遊して増殖する細胞は、クローニングお
よび形質導入実験のために様々なスペクトルの方法を必
要とする。したがって、クローンの選択には、軟寒天の
ような固定化添加物を使用すること、理論的に容器１個
あたりに存在する細胞が１個のみとなるまで希釈する限
界希釈と呼ばれる細胞の一連の希釈、またはFACソータ
ーによる組換え細胞の直接選択が可能となる表面マーカ
ーもしくは蛍光マーカー（GFPのような）を使用するこ
とを必要とする。生細胞および死細胞は、染色した場合
に限って識別することができる。培地交換には常に遠心
分離工程を必要とする。
よび形質導入実験のために様々なスペクトルの方法を必
要とする。したがって、クローンの選択には、軟寒天の
ような固定化添加物を使用すること、理論的に容器１個
あたりに存在する細胞が１個のみとなるまで希釈する限
界希釈と呼ばれる細胞の一連の希釈、またはFACソータ
ーによる組換え細胞の直接選択が可能となる表面マーカ
ーもしくは蛍光マーカー（GFPのような）を使用するこ
とを必要とする。生細胞および死細胞は、染色した場合
に限って識別することができる。培地交換には常に遠心
分離工程を必要とする。
【００１１】レトロウイルスパッケージング細胞株とし
て浮遊状で増殖する細胞はこれまで知られていない。同
様に接着して増殖する確立されたパッケージング細胞株
を浮遊細胞にする実験もこれまでに記述されていない。
て浮遊状で増殖する細胞はこれまで知られていない。同
様に接着して増殖する確立されたパッケージング細胞株
を浮遊細胞にする実験もこれまでに記述されていない。
【００１２】意外にも、接着したパッケージング細胞株
を浮遊状で増殖するように適応させることは実際に可能
であること、そして得られた浮遊パッケージング細胞株
は高力価でウイルスを産生できることが判明した。その
上、レトロウイルスパッケージング遺伝子プラスミドと
レトロウイルスベクタープラスミドとの同時トランスフ
ェクションによって、K562ヒト赤白血病細胞株K562、ラ
ット肝腫株N1-S1およびラットリンパ腫株C58のような古
典的な浮遊細胞株から、レトロウイルスを産生する浮遊
状で増殖する細胞株を製造することも可能であること、
すなわちこれらの細胞株はその他の細胞を形質導入する
ことができるレトロウイルスベクター粒子を放出するこ
とが証明された。
を浮遊状で増殖するように適応させることは実際に可能
であること、そして得られた浮遊パッケージング細胞株
は高力価でウイルスを産生できることが判明した。その
上、レトロウイルスパッケージング遺伝子プラスミドと
レトロウイルスベクタープラスミドとの同時トランスフ
ェクションによって、K562ヒト赤白血病細胞株K562、ラ
ット肝腫株N1-S1およびラットリンパ腫株C58のような古
典的な浮遊細胞株から、レトロウイルスを産生する浮遊
状で増殖する細胞株を製造することも可能であること、
すなわちこれらの細胞株はその他の細胞を形質導入する
ことができるレトロウイルスベクター粒子を放出するこ
とが証明された。
【００１３】浮遊パッケージング細胞株を製造するため
の技術的方法は、浮遊細胞ではその他のクローニングお
よび培養技法を必要とする、という先に言及した違いを
除いて、単独では感染性ウイルスを形成することができ
ないヘルパー配列（１片または好ましくは分割して）を
導入すれば、接着細胞に関して何回も記述されてきた方
法と同様となる。
の技術的方法は、浮遊細胞ではその他のクローニングお
よび培養技法を必要とする、という先に言及した違いを
除いて、単独では感染性ウイルスを形成することができ
ないヘルパー配列（１片または好ましくは分割して）を
導入すれば、接着細胞に関して何回も記述されてきた方
法と同様となる。
【００１４】浮遊パッケージング細胞株が産生されれ
ば、これは、適合性レトロウイルスベクター（例えば、
異所パッケージング細胞株に由来するベクターを含む両
栄養性パッケージング細胞株）を形質導入することによ
って、好ましくはレトロウイルスベクタープラスミドの
トランスフェクションによって、感染性であるが複製不
能であるレトロウイルスベクターを放出する浮遊産生細
胞株に変換することができる。
ば、これは、適合性レトロウイルスベクター（例えば、
異所パッケージング細胞株に由来するベクターを含む両
栄養性パッケージング細胞株）を形質導入することによ
って、好ましくはレトロウイルスベクタープラスミドの
トランスフェクションによって、感染性であるが複製不
能であるレトロウイルスベクターを放出する浮遊産生細
胞株に変換することができる。
【００１５】レトロウイルスパッケージング細胞株とし
て完全に浮遊状で増殖する哺乳類細胞株はこれまで知ら
れていなかった。同様に接着して増殖する確立されたパ
ッケージング細胞株を完全に浮遊状にすることができる
方法もこれまで知られていなかった。
て完全に浮遊状で増殖する哺乳類細胞株はこれまで知ら
れていなかった。同様に接着して増殖する確立されたパ
ッケージング細胞株を完全に浮遊状にすることができる
方法もこれまで知られていなかった。
【００１６】本発明の目的は、浮遊状で増殖するレトロ
ウイルスベクターのパッケージング細胞株ならびにその
製造法および使用法を提供することである。
ウイルスベクターのパッケージング細胞株ならびにその
製造法および使用法を提供することである。
【００１７】本発明は好ましくはレトロウイルスベクタ
ーによって形質導入された、完全に浮遊状で増殖するレ
トロウイルスのパッケージング細胞株に関する。
ーによって形質導入された、完全に浮遊状で増殖するレ
トロウイルスのパッケージング細胞株に関する。
【００１８】本発明のさらなる主題は、ベクターによっ
て形質導入された浮遊状で増殖するパッケージング細胞
株を浮遊培養し、細胞を細胞上清から分離し、ベクター
を上清から単離することを特徴とするレトロウイルスベ
クターの製造方法である。
て形質導入された浮遊状で増殖するパッケージング細胞
株を浮遊培養し、細胞を細胞上清から分離し、ベクター
を上清から単離することを特徴とするレトロウイルスベ
クターの製造方法である。
【００１９】パッケージング細胞株は、ウイルス粒子の
産生に必要な遺伝子gag、pol、およびenv（ヘルパー遺
伝子）を含むが、機能的に活性なパッケージング配列
（ψ）を含まない哺乳類細胞株として理解される。その
ような細胞株はゲノムRNAを含むウイルス粒子を単独で
形成することができない。
産生に必要な遺伝子gag、pol、およびenv（ヘルパー遺
伝子）を含むが、機能的に活性なパッケージング配列
（ψ）を含まない哺乳類細胞株として理解される。その
ような細胞株はゲノムRNAを含むウイルス粒子を単独で
形成することができない。
【００２０】機能的に活性なパッケージング配列は、RN
Aゲノムのパッケージングを機能的に引き起こすレトロ
ウイルスゲノムの一領域であると理解される。その機能
は完全もしくは部分的な欠失または変異によって不活化
することができる。
Aゲノムのパッケージングを機能的に引き起こすレトロ
ウイルスゲノムの一領域であると理解される。その機能
は完全もしくは部分的な欠失または変異によって不活化
することができる。
【００２１】本発明に従って、完全に浮遊状で増殖する
レトロウイルスパッケージング細胞株（不溶性マトリク
ス（細胞が接着する容器の壁または微小担体）を長期
間、例えば数日間の増殖にも必要としない）は、好まし
くはそのような接着パッケージング細胞株を少なくとも
３ヶ月間にわたって浮遊状での増殖に段階的に慣らすこ
とによって、接着して増殖するレトロウイルスパッケー
ジング細胞株から産生される。そのような段階は、培地
中のFCS含有量を血清を全く含まなくなるまで連続的に
減少させること、細胞をトリプシンおよび／またはDNア
ーゼで繰り返し処理すること、浮遊細胞株用の培地（例
えば、DMF024A）を用いること、好ましくは浮遊細胞お
よびハイブリドーマ細胞用の組織培養フラスコ（サール
ステッド）を用いること、培養フラスコを振盪器上で絶
えず振盪すること、および細胞密度５×104〜１×106細
胞/mlを用いること（したがって同等の接着培養の場合
よりはるかに頻繁に細胞を分割する必要がある）を含
む。
レトロウイルスパッケージング細胞株（不溶性マトリク
ス（細胞が接着する容器の壁または微小担体）を長期
間、例えば数日間の増殖にも必要としない）は、好まし
くはそのような接着パッケージング細胞株を少なくとも
３ヶ月間にわたって浮遊状での増殖に段階的に慣らすこ
とによって、接着して増殖するレトロウイルスパッケー
ジング細胞株から産生される。そのような段階は、培地
中のFCS含有量を血清を全く含まなくなるまで連続的に
減少させること、細胞をトリプシンおよび／またはDNア
ーゼで繰り返し処理すること、浮遊細胞株用の培地（例
えば、DMF024A）を用いること、好ましくは浮遊細胞お
よびハイブリドーマ細胞用の組織培養フラスコ（サール
ステッド）を用いること、培養フラスコを振盪器上で絶
えず振盪すること、および細胞密度５×104〜１×106細
胞/mlを用いること（したがって同等の接着培養の場合
よりはるかに頻繁に細胞を分割する必要がある）を含
む。
【００２２】完全に浮遊状で増殖し、且つレトロウイル
スベクタープラスミドをトランスフェクトさせた、また
はレトロウイルスベクターによって形質導入された本発
明の細胞株は、好ましくは、浮遊細胞株にレトロウイル
スベクタープラスミドをトランスフェクトさせる、もし
くはこれにレトロウイルスベクターを形質導入するこ
と、同時トランスフェクトもしくは同時形質導入した表
面マーカーを用いて限界希釈および／もしくは固定化添
加物を加えることによってトランスフェクトもしくは形
質導入された細胞を選択すること、ならびにこのように
選択された本発明の浮遊細胞を単離することによって産
生される。浮遊細胞株は好ましくはレトロウイルスパッ
ケージング細胞株である。浮遊して増殖するレトロウイ
ルスパッケージング細胞株を産生するために、接着して
増殖し、ヘルパー配列をコードする核酸およびレトロウ
イルスベクタープラスミドをトランスフェクトさせた、
またはレトロウイルスベクターによって形質導入され
た、血清含有培地で培養されるレトロウイルスパッケー
ジング細胞株を、好ましくは、細胞浮遊液の密度を５×
104〜１×106細胞/mlに維持しながら、担体から細胞を
剥離させるために、培地中の血清含有量を本質的に無血
清となるまで連続的に減少させ、トリプシンおよびDNア
ーゼで細胞を繰り返し処理することによって、浮遊状で
増殖する細胞株へと変換する。このプロセスは特に好ま
しくは長期間、好ましくは少なくとも３ヶ月間実施す
る。さらに好ましい態様において、トランスフェクトま
たは形質導入された細胞は、限界希釈および／または固
定化添加物を加えることによって、同時トランスフェク
トまたは同時形質導入された表面マーカーを用いて選択
される。
スベクタープラスミドをトランスフェクトさせた、また
はレトロウイルスベクターによって形質導入された本発
明の細胞株は、好ましくは、浮遊細胞株にレトロウイル
スベクタープラスミドをトランスフェクトさせる、もし
くはこれにレトロウイルスベクターを形質導入するこ
と、同時トランスフェクトもしくは同時形質導入した表
面マーカーを用いて限界希釈および／もしくは固定化添
加物を加えることによってトランスフェクトもしくは形
質導入された細胞を選択すること、ならびにこのように
選択された本発明の浮遊細胞を単離することによって産
生される。浮遊細胞株は好ましくはレトロウイルスパッ
ケージング細胞株である。浮遊して増殖するレトロウイ
ルスパッケージング細胞株を産生するために、接着して
増殖し、ヘルパー配列をコードする核酸およびレトロウ
イルスベクタープラスミドをトランスフェクトさせた、
またはレトロウイルスベクターによって形質導入され
た、血清含有培地で培養されるレトロウイルスパッケー
ジング細胞株を、好ましくは、細胞浮遊液の密度を５×
104〜１×106細胞/mlに維持しながら、担体から細胞を
剥離させるために、培地中の血清含有量を本質的に無血
清となるまで連続的に減少させ、トリプシンおよびDNア
ーゼで細胞を繰り返し処理することによって、浮遊状で
増殖する細胞株へと変換する。このプロセスは特に好ま
しくは長期間、好ましくは少なくとも３ヶ月間実施す
る。さらに好ましい態様において、トランスフェクトま
たは形質導入された細胞は、限界希釈および／または固
定化添加物を加えることによって、同時トランスフェク
トまたは同時形質導入された表面マーカーを用いて選択
される。
【００２３】驚くべきことに、このように処理された完
全に浮遊状で増殖するパッケージング細胞株は、それら
にレトロウイルスベクタープラスミドをトランスフェク
トさせた、またはレトロウイルスベクターによって形質
導入した後に数ヶ月間に及ぶ非常に長期間の操作にもか
かわらず、なおもレトロウイルスを産生できることが判
明した。
全に浮遊状で増殖するパッケージング細胞株は、それら
にレトロウイルスベクタープラスミドをトランスフェク
トさせた、またはレトロウイルスベクターによって形質
導入した後に数ヶ月間に及ぶ非常に長期間の操作にもか
かわらず、なおもレトロウイルスを産生できることが判
明した。
【００２４】完全に浮遊状で増殖するそのようなパッケ
ージング細胞株は、レトロウイルスベクタープラスミド
によるトランスフェクションまたはレトロウイルスベク
ターによる形質導入によって、細胞浮遊液に存在する細
胞が容器あたり実質的に１個のみとなるまで希釈する限
界希釈などの単離段階によって、または重層する寒天も
しくはメチルセルロース（Metho Cult H4100/ステムセ
ル・テクノロジーズ）のような固定化添加物もしくは細
胞表面マーカーによる細胞ソーティングを用いることに
よってクローニングできること、ならびに完全に浮遊状
で増殖するレトロウイルス産生細胞株がこれから形成さ
れ、接着レトロウイルス産生細胞株と同じ程度にレトロ
ウイルスベクターを産生することができることも驚くべ
きことである。
ージング細胞株は、レトロウイルスベクタープラスミド
によるトランスフェクションまたはレトロウイルスベク
ターによる形質導入によって、細胞浮遊液に存在する細
胞が容器あたり実質的に１個のみとなるまで希釈する限
界希釈などの単離段階によって、または重層する寒天も
しくはメチルセルロース（Metho Cult H4100/ステムセ
ル・テクノロジーズ）のような固定化添加物もしくは細
胞表面マーカーによる細胞ソーティングを用いることに
よってクローニングできること、ならびに完全に浮遊状
で増殖するレトロウイルス産生細胞株がこれから形成さ
れ、接着レトロウイルス産生細胞株と同じ程度にレトロ
ウイルスベクターを産生することができることも驚くべ
きことである。
【００２５】このように産生されたレトロウイルス産生
細胞株により、攪拌発酵槽または高密度透析培養法での
接着レトロウイルス産生細胞株と比較してはるかに単純
な大量培養が可能となる。
細胞株により、攪拌発酵槽または高密度透析培養法での
接着レトロウイルス産生細胞株と比較してはるかに単純
な大量培養が可能となる。
【００２６】さらにベクターウイルスを単離する方法も
異なる。接着レトロウイルス産生細胞株の場合、レトロ
ウイルスのみを含む培養上清を除去する必要があり、ま
た濾過滅菌段階が、これは必ずしも必要というわけでは
ないが、にもかかわらず常に常に安全性の理由から行わ
れる。これは完全に浮遊状で増殖するレトロウイルス産
生細胞株の場合、濾過および遠心分離工程、または少な
くとも２回の濾過工程によって、比較的小さく軽いレト
ロウイルスベクター粒子がより大きく重い産生細胞株か
ら分離されるためである。
異なる。接着レトロウイルス産生細胞株の場合、レトロ
ウイルスのみを含む培養上清を除去する必要があり、ま
た濾過滅菌段階が、これは必ずしも必要というわけでは
ないが、にもかかわらず常に常に安全性の理由から行わ
れる。これは完全に浮遊状で増殖するレトロウイルス産
生細胞株の場合、濾過および遠心分離工程、または少な
くとも２回の濾過工程によって、比較的小さく軽いレト
ロウイルスベクター粒子がより大きく重い産生細胞株か
ら分離されるためである。
【００２７】治療的遺伝子を含むレトロウイルスベクタ
ーは、レトロウイルスベクタープラスミドまたはレトロ
ウイルスベクターとして用いられる。これらのベクター
は、浮遊産生細胞株において産生される間の複製不能レ
トロウイルスベクターの放出を防止するために、gag、p
ol、envのようなパッケージング配列を含まない。治療
的に関連した遺伝子は通常5'-LTRと3'-LTRとの間に挿入
され、ネオマイシンまたはヒグロマイシン抵抗性遺伝子
のような選択遺伝子が存在すれば都合がよい。
ーは、レトロウイルスベクタープラスミドまたはレトロ
ウイルスベクターとして用いられる。これらのベクター
は、浮遊産生細胞株において産生される間の複製不能レ
トロウイルスベクターの放出を防止するために、gag、p
ol、envのようなパッケージング配列を含まない。治療
的に関連した遺伝子は通常5'-LTRと3'-LTRとの間に挿入
され、ネオマイシンまたはヒグロマイシン抵抗性遺伝子
のような選択遺伝子が存在すれば都合がよい。
【００２８】複製不能（複製欠損）ベクターは、レトロ
ウイルス遺伝子機能（gag、env、pol）を含まないベク
ターとして理解され、したがって、ウイルス粒子を独立
して形成することができない。しかし、ベクターは通常
パッケージング機能（psi）を含む。感染性のレトロウ
イルス粒子を形成するために、遺伝子機能gag、env、お
よびpolを安定な型（エピソームまたはゲノムに組み込
まれた形）で含むパッケージング細胞株を、複製欠損DN
Aベクターによって形質導入する。gagおよびenv機能の
結果としてウイルス粒子にパッケージングされるRNA転
写物が形成される。これらのウイルス粒子は、それらに
含まれるRNAゲノムがレトロウイルス遺伝子機能を持た
ないため複製欠損性である。
ウイルス遺伝子機能（gag、env、pol）を含まないベク
ターとして理解され、したがって、ウイルス粒子を独立
して形成することができない。しかし、ベクターは通常
パッケージング機能（psi）を含む。感染性のレトロウ
イルス粒子を形成するために、遺伝子機能gag、env、お
よびpolを安定な型（エピソームまたはゲノムに組み込
まれた形）で含むパッケージング細胞株を、複製欠損DN
Aベクターによって形質導入する。gagおよびenv機能の
結果としてウイルス粒子にパッケージングされるRNA転
写物が形成される。これらのウイルス粒子は、それらに
含まれるRNAゲノムがレトロウイルス遺伝子機能を持た
ないため複製欠損性である。
【００２９】省略語
MoMuLV モロニーマウス白血病ウイルス
FCS ウシ胎仔血清
△LNGFR 細胞内ドメインが欠失している低親和
性神経生長因子受容体（国際公開公報第95/06723号を参
照のこと） SV40-P/E SV40のプロモーター／エンハンサーユ
ニット neoR ネオマイシン抵抗性遺伝子 pBR 322 大腸菌ベースベクタープラスミド T 25 細胞培養フラスコの大きさ CMV-P/E CMVのプロモーター／エンハンサーユニ
ット（例えば、EP-B 0 173 177を参照のこと） TK-P 単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモ
ーター poly-A ポリアデニル化部位 hygR ヒグロマイシン抵抗性遺伝子 gpt gpt選択遺伝子 pUC19 ベースベクター pUC20 ベースベクター 5'LTR MoMuLV MoMuLVからの5' LTR cfu コロニー形成単位
性神経生長因子受容体（国際公開公報第95/06723号を参
照のこと） SV40-P/E SV40のプロモーター／エンハンサーユ
ニット neoR ネオマイシン抵抗性遺伝子 pBR 322 大腸菌ベースベクタープラスミド T 25 細胞培養フラスコの大きさ CMV-P/E CMVのプロモーター／エンハンサーユニ
ット（例えば、EP-B 0 173 177を参照のこと） TK-P 単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモ
ーター poly-A ポリアデニル化部位 hygR ヒグロマイシン抵抗性遺伝子 gpt gpt選択遺伝子 pUC19 ベースベクター pUC20 ベースベクター 5'LTR MoMuLV MoMuLVからの5' LTR cfu コロニー形成単位
【００３０】本発明は、その範囲が特許請求の範囲に由
来する以下の実施例および出版物によってさらに明らか
となる。記述の方法は、改変を行った後であっても本発
明の主題をさらに説明する例として理解されるべきであ
る。
来する以下の実施例および出版物によってさらに明らか
となる。記述の方法は、改変を行った後であっても本発
明の主題をさらに説明する例として理解されるべきであ
る。
【００３１】実施例１ 接着レトロウイルスパッケージ
ング細胞株の浮遊増殖への適応 いずれもヒト繊維肉腫株HT1080に基づく接着パッケージ
ング細胞株FLY A13（MoMuLV由来の両栄養性env）および
FLY RD18（ネコ内因性ウイルスRD114由来のenv）（コセ
ット（Cosset, F. L.）ら、J. Virol. 69（1995）7430
〜7436）を以下のプロセス段階によって浮遊増殖に適応
させた。
ング細胞株の浮遊増殖への適応 いずれもヒト繊維肉腫株HT1080に基づく接着パッケージ
ング細胞株FLY A13（MoMuLV由来の両栄養性env）および
FLY RD18（ネコ内因性ウイルスRD114由来のenv）（コセ
ット（Cosset, F. L.）ら、J. Virol. 69（1995）7430
〜7436）を以下のプロセス段階によって浮遊増殖に適応
させた。
【００３２】a) 接着パッケージング細胞株の浮遊増殖
への適応 I． 培養中のFCSの連続的でゆっくりとした減少；約５
ヶ月間； 10％FCS→５％→2.5％→２％→１％→0.5％→無血清 II． 浮遊細胞株の培地の使用 III．浮遊細胞株用の培養フラスコの使用（Sarstedt） IV． 培養フラスコを振盪器上で持続的にゆっくりと振
盪 V． 維持は、細胞が常に浮遊しているように、トリプ
シンおよびDNアーゼ処理および頻繁な分割によって、形
成する細胞塊を頻繁に剥離させることを必要とする。細
胞密度は常に重要な要因（5・104〜1・106細胞/ml）で
あり、すなわち高すぎず、または希釈しすぎないように
しなければならない。
への適応 I． 培養中のFCSの連続的でゆっくりとした減少；約５
ヶ月間； 10％FCS→５％→2.5％→２％→１％→0.5％→無血清 II． 浮遊細胞株の培地の使用 III．浮遊細胞株用の培養フラスコの使用（Sarstedt） IV． 培養フラスコを振盪器上で持続的にゆっくりと振
盪 V． 維持は、細胞が常に浮遊しているように、トリプ
シンおよびDNアーゼ処理および頻繁な分割によって、形
成する細胞塊を頻繁に剥離させることを必要とする。細
胞密度は常に重要な要因（5・104〜1・106細胞/ml）で
あり、すなわち高すぎず、または希釈しすぎないように
しなければならない。
【００３３】b) 一過性培養のレトロウイルス力価の決
定 浮遊して増殖するパッケージング細胞株を接着して増殖
する対応するパッケージング細胞株と産生特性に関して
比較した。
定 浮遊して増殖するパッケージング細胞株を接着して増殖
する対応するパッケージング細胞株と産生特性に関して
比較した。
【００３４】これに関して、全ての細胞株をレトロウイ
ルスベクタープラスミドでトランスフェクトして、一過
性培養のレトロウイルス力価を決定した。
ルスベクタープラスミドでトランスフェクトして、一過
性培養のレトロウイルス力価を決定した。
【００３５】材料：
*レトロウイルスベクターpL△NSN（6853 bp）
[5'LTR MoMuLV−ψ−△LNGFR−SV40-P/E−neoR−3'LTR
MoMuLV−pBR322−プラスミドパート-] *トランスフェクション試薬：DOSPER；それぞれの場合
についてDOSPER/混合物20μg（製造元；ベーリンガー・
マンハイムGmbH、ドイツ） *プラスミドDNA濃縮液：DNA/混合物/プラスミド５μg
MoMuLV−pBR322−プラスミドパート-] *トランスフェクション試薬：DOSPER；それぞれの場合
についてDOSPER/混合物20μg（製造元；ベーリンガー・
マンハイムGmbH、ドイツ） *プラスミドDNA濃縮液：DNA/混合物/プラスミド５μg
【００３６】方法：
１日目：トランスフェクション用に細胞を播種する：
接着細胞：６×105細胞/60 mmペトリ皿
浮遊細胞：３×105細胞/ml；浮遊細胞用培養フラスコ
（T25、Sarstedt、直立）；合計２ ml 37℃、５％CO2中で一晩インキュベーションして、浮遊
細胞を穏やかに振盪する。 ２日目：培地交換（浮遊細胞の場合には遠心および再懸
濁）、DNA/DOSPER混合物を調製して細胞に滴下する（そ
れぞれについてDNA/DOSPER混合物100 μl）。37℃、５
％CO2で５〜６時間インキュベーションして、その後培
地を加える。 ３日目；トランスフェクションの24時間後に上清を除去
して、遠心（浮遊細胞株の場合のみ）、濾過（0.45 μm
フィルター）およびNIH 3T3細胞上で力価測定（G418選
択）を行う。 力価測定結果は約10〜14日後である。
（T25、Sarstedt、直立）；合計２ ml 37℃、５％CO2中で一晩インキュベーションして、浮遊
細胞を穏やかに振盪する。 ２日目：培地交換（浮遊細胞の場合には遠心および再懸
濁）、DNA/DOSPER混合物を調製して細胞に滴下する（そ
れぞれについてDNA/DOSPER混合物100 μl）。37℃、５
％CO2で５〜６時間インキュベーションして、その後培
地を加える。 ３日目；トランスフェクションの24時間後に上清を除去
して、遠心（浮遊細胞株の場合のみ）、濾過（0.45 μm
フィルター）およびNIH 3T3細胞上で力価測定（G418選
択）を行う。 力価測定結果は約10〜14日後である。
【００３７】
力価：
接着細胞株 FLY A13：８×105 cfu/ml
２×105 cfu/ml
FLY RD18：予め測定はしなかった
浮遊にした細胞株 FLY A13：2.4×103 cfu/ml
FLY RD18：１×102 cfu/ml
【００３８】結果：
浮遊状にしたパッケージング細胞株は基本的に組換え型
レトロウイルスを産生することができる。力価の差はト
ランスフェクションおよび力価測定における異なる実験
条件、例えば浮遊細胞と接着細胞とにおけるトランスフ
ェクション効率の差ならびにFCSフリー培地とFCS含有培
地におけるレトロウイルスの安定性および感染性の差に
よるものである。
レトロウイルスを産生することができる。力価の差はト
ランスフェクションおよび力価測定における異なる実験
条件、例えば浮遊細胞と接着細胞とにおけるトランスフ
ェクション効率の差ならびにFCSフリー培地とFCS含有培
地におけるレトロウイルスの安定性および感染性の差に
よるものである。
【００３９】実施例２： ２つのヘルパープラスミドお
よびレトロウイルスベクタープラスミドの浮遊細胞株へ
の一過性の３重トランスフェクション後のレトロウイル
ス産生 接着細胞株および浮遊して増殖するいくつかの細胞株
を、一過性の３重トランスフェクション調製物において
その感染性レトロウイルスベクターの形成能に関して比
較した。
よびレトロウイルスベクタープラスミドの浮遊細胞株へ
の一過性の３重トランスフェクション後のレトロウイル
ス産生 接着細胞株および浮遊して増殖するいくつかの細胞株
を、一過性の３重トランスフェクション調製物において
その感染性レトロウイルスベクターの形成能に関して比
較した。
【００４０】
【００４１】材料：
a) ヘルパープラスミド：
* gag-pol発現プラスミドpGAPOGPT（10202 bp）
[-CMV-P/E-gag-pol-polyA-SV40-P/E-gpt-polyA-pUC19-
プラスミドパート-] * ENV発現プラスミドpENVCHT（7933 bp） [-TK-P-hygR-PolyA-CMV-P/E-env（両栄養性）-IpolyA-p
UC20-プラスミドパート-] b) レトロウイルスベクタープラスミド： *レトロウイルスベクターpL△NSN（6853 bp） [5'LTR MoMuLV−ψ−△LNGFR−SV40-P/E−neoR−3'LTR
MoMuLV−pBR322−プラスミドパート-] *トランスフェクション試薬：DOSPER（BM）；それぞれ
の場合についてDOSPER/混合物20 μg *プラスミドDNA濃縮液；DNA/混合物/プラスミド５μg
プラスミドパート-] * ENV発現プラスミドpENVCHT（7933 bp） [-TK-P-hygR-PolyA-CMV-P/E-env（両栄養性）-IpolyA-p
UC20-プラスミドパート-] b) レトロウイルスベクタープラスミド： *レトロウイルスベクターpL△NSN（6853 bp） [5'LTR MoMuLV−ψ−△LNGFR−SV40-P/E−neoR−3'LTR
MoMuLV−pBR322−プラスミドパート-] *トランスフェクション試薬：DOSPER（BM）；それぞれ
の場合についてDOSPER/混合物20 μg *プラスミドDNA濃縮液；DNA/混合物/プラスミド５μg
【００４２】方法：
１日目：トランスフェクション用に細胞を播種する：
接着細胞（NIH3T3）：６×105細胞/60 mmペトリ皿
浮遊細胞：３×105細胞/ml；T25培養フラスコ（浮遊細
胞用、直立）；合計２ml37℃、５％CO2中で一晩インキ
ュベーションして、浮遊細胞を穏やかに振盪する。 ２日目：培地交換（浮遊細胞の場合には遠心および再懸
濁により）、DNA/DOSPER混合物を調製して細胞に滴下す
る（それぞれについてDNA/DOSPER混合物100 μl）。37
℃、５％CO2で５〜６時間インキュベーションして、そ
の後培地を加える。 ３日目；３重トランスフェクションの24時間後に上清を
除去して、遠心（浮遊細胞株の場合のみ）、濾過（0.45
μmフィルター）およびNIH 3T3細胞上で力価測定（G41
8選択）を行う。 力価測定結果は約10〜14日後である。
胞用、直立）；合計２ml37℃、５％CO2中で一晩インキ
ュベーションして、浮遊細胞を穏やかに振盪する。 ２日目：培地交換（浮遊細胞の場合には遠心および再懸
濁により）、DNA/DOSPER混合物を調製して細胞に滴下す
る（それぞれについてDNA/DOSPER混合物100 μl）。37
℃、５％CO2で５〜６時間インキュベーションして、そ
の後培地を加える。 ３日目；３重トランスフェクションの24時間後に上清を
除去して、遠心（浮遊細胞株の場合のみ）、濾過（0.45
μmフィルター）およびNIH 3T3細胞上で力価測定（G41
8選択）を行う。 力価測定結果は約10〜14日後である。
【００４３】NIH 3T3細胞上での滴定結果（G418抵抗性
コロニー数） NIH 3T3細胞（接着対照細胞）：ウイルス上清1.4 mlあ
たりコロニー３個（力価２cfu/ml） K562：ウイルス上清0.8 mlあたりコロニー６個（力価：
7.5 cfu/ml） N1-S1：ウイルス上清２mlあたりコロニー６個（力価：
３cfu/ml） C58：ウイルス上清２mlあたりコロニー１個（力価：0.5
cfu/ml）
コロニー数） NIH 3T3細胞（接着対照細胞）：ウイルス上清1.4 mlあ
たりコロニー３個（力価２cfu/ml） K562：ウイルス上清0.8 mlあたりコロニー６個（力価：
7.5 cfu/ml） N1-S1：ウイルス上清２mlあたりコロニー６個（力価：
３cfu/ml） C58：ウイルス上清２mlあたりコロニー１個（力価：0.5
cfu/ml）
【００４４】参考文献
Cosset, F.-L.ら、J.Virol.69 (1995) 7430-7436
Danos, Oら、PNAS USA 85 (1988) 6460-6464
Markowitz, D.G.ら、Trans.Assoc.Am.Physicians 101
(1988) 212-218 Miller, A.D.ら、J.Virol.65(1991) 2220-2224 Miller, A.D.ら、Mol.and Cell Biol.6 (1986) 2895-29
02 Rigg, R.J.ら、Virology 218 (1996) 290-295 国際公開公報第92/05266号
(1988) 212-218 Miller, A.D.ら、J.Virol.65(1991) 2220-2224 Miller, A.D.ら、Mol.and Cell Biol.6 (1986) 2895-29
02 Rigg, R.J.ら、Virology 218 (1996) 290-295 国際公開公報第92/05266号
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ギュトヤール ソルシュテン
ドイツ国 ペンツベルグ ハセルベルグ
ストラッセ 21
(72)発明者 ステーグマンズ ウルリヒ
ドイツ国 バド ハイルブルン オシュ
トフェルドストラッセ ２
(72)発明者 リューゲル リュディゲル
ドイツ国 フグルフィンク ビルケンス
トラッセ 11
(56)参考文献 特開 昭53−59091（ＪＰ，Ａ)
国際公開97／37000（ＷＯ，Ａ１)
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ， Ｖｏｌ．69， Ｎｏ．12， ｐ
ｐ．7430−7436 （1995)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00
C12N 5/00
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 ヘルパー配列をコードする核酸およびレ
トロウイルスベクタープラスミドでトランスフェクトさ
れた、またはレトロウイルスベクターによって形質導入
された、無血清培地で培養される接着して増殖するパッ
ケージング細胞株を、以下の工程によって浮遊して増殖
する細胞株へと変換することを特徴とする、完全に浮遊
状で増殖するパッケージング細胞株の製造方法： 浮遊細胞の密度を５×104〜１×106細胞/mlの範囲に維
持しながら、支持体から細胞を剥離させるために、培地
中の血清含有量を血清を含まなくなるまで連続的に減少
させて、細胞をトリプシンおよびDNアーゼで繰り返し処
理する工程。 - 【請求項２】 少なくとも３ヶ月間実行されることを特
徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 限界希釈および／または固定添加物を加
えることによって、同時トランスフェクトまたは同時形
質導入された表面マーカーを用いて、トランスフェクト
または形質導入された細胞を選択することを特徴とす
る、請求項１または２記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97118583 | 1997-10-25 | ||
| EP97118583.0 | 1997-10-25 | ||
| EP97121724 | 1997-12-10 | ||
| EP97121724.5 | 1997-12-10 | ||
| PCT/EP1998/006714 WO1999021967A1 (de) | 1997-10-25 | 1998-10-22 | Suspensions-verpackungszellinien für retrovirusvektoren |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP3517399B2 true JP3517399B2 (ja) | 2004-04-12 |
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ID=26145852
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000518059A Expired - Fee Related JP3517399B2 (ja) | 1997-10-25 | 1998-10-22 | レトロウイルスベクターのための浮遊パッケージング細胞株 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| CN111286517A (zh) * | 2018-12-07 | 2020-06-16 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种复制缺陷型逆转录病毒的包装方法及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
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| RU1347448C (ru) * | 1985-09-27 | 1995-04-10 | Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской АМН | Штамм гетероплоидных клеток почки теленка таурус-1, используемый для культивирования вирусов |
| WO1990005180A1 (en) * | 1988-10-31 | 1990-05-17 | The Regents Of The University Of California | Products and methods for controlling the suppression of the neoplastic phenotype |
| DE19612966B4 (de) * | 1996-04-01 | 2009-12-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg | MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren |
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