KR100507794B1 - 고농도 레트로 바이러스 현탁액 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 i) 재조합 레트로 바이러스 벡터로 트랜스펙션(transfection)된 세포주의 배양액을 원심분리에 의해 농축시키는 단계; 및 ii) 아미노산 및 당을 포함하는 부형제로 현탁시키는 단계를 포함하는 고농도 레트로 바이러스 현탁액의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법에 의한 제조된 레트로 바이러스는 백신 또는 유전자 치료제 등의 치료적 용도로써 유용하게 이용될 수 있다.

Description

고농도 레트로 바이러스 현탁액 제조 방법{METHOD FOR PREPARING CONCENTRATED RETROVIRAL PARTICLE DISPERSION}
바이러스는 백신 또는 유전자 치료제 등의 치료적 용도로 그 중요성이 점차 커지고 있으며, 바이러스의 활용 범위를 확장시키기 위하여 이를 안정하게 고농도로 농축하는 기술이 필수적으로 요구된다.
레트로 바이러스는 자신의 유전정보를 DNA가 아닌 RNA에 가지며, 자신의 RNA를 DNA로 전환하여야만 숙주 세포의 복제 시스템을 이용할 수 있다. 레트로 바이러스의 대표적인 예로는 백혈병의 원인이 되는 HTLV-I 및 II, 및 AIDS의 원인이 되는 HIV 등이 있다.
레트로 바이러스는 재조합 유전자를 안정적이며 유전이 가능한 상태로 숙주에 전달할 수 있는 도구로서 개발되고 있으며, 각종 질병에 대한 유전자 치료의 중심 도구로서 개발되고 있다. 현재 재조합 유전자를 숙주의 게놈에 삽입하는 기술은 크게 패키징 세포주(재조합 레트로 바이러스 RNA를 감염성은 있으나 복제가 불가능 상태의 입자로 만들어 주는 세포주) 및 발현 벡터의 개발에 맞추어져 있다.
레트로 바이러스의 gag, pol, env 등의 유전자는 패키징 세포주 게놈에 안정적으로 삽입되어야 한다. 레트로 바이러스 벡터는 패키징 신호 유전자인 psi 서열, 전사조절인자 및 목적 유전자 등으로 구성된다. 이러한 재조합 레트로 바이러스 벡터로 트랜스펙션된 패키징 세포주는 고역가의 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 이때 바이러스의 env(envelope; 외피) 유전자는 패키징 세포주에 의해서 발현되며, 이의 외피 단백질에 의하여 바이러스의 숙주 특이성 및 감염 범위가 결정된다.
바이러스의 외피 단백질은 숙주 세포에 침입하기 위해 사용하는 수용체에 따라 구분될 수 있다. 예를 들어 에코트로픽(ecotropic) 바이러스는 마우스와 래트의 수용체만을 통하여 감염되며, 앰포트로픽(amphotropic) 바이러스는 통하여 비교적 넓은 범위의 포유류 세포주를 감염시킨다.
이에 반해 판트로픽(pantropic) 바이러스는 포유류 및 비포유류에 걸쳐서 광범위한 감염성을 가진다.
다른 외피 단백질과는 달리 판트로픽 외피 단백질(VSV-G)은 감염된 숙주 세포의 막 지질 성분에 부착하여 막융합에 의하여 숙주 세포내로 들어가는 작용기전을 지니기 때문에 넓은 감염 범위를 나타내게 된다. 그러나 판트로픽 외피 단백질을 지속적으로 생산하게 되면 패키징 세포주에 독성을 나타내게 되므로, 일시적으로 바이러스를 생산하는 방법이 개발되어 있다.
예를 들어 소포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV)의 광범위한 감염성은 이의 당단백질을 외부 수용체의 스파이크로 이용하기 때문에, 모든 세포주의 지질막에 발현되는 당단백질이 감염의 매개체가 될 수 있다. 이러한 소포성 구내염 바이러스의 외피 단백질은 넓은 감염 범위를 지니기 때문에 유전자 치료에 널리 이용되고 있다.
레트로 바이러스는 다른 바이러스에 비해 염색체에 유전자를 안정적으로 삽입한다는 장점을 가지나, 고농도로 농축하기 어렵고 레트로 바이러스 자체의 불안정성으로 인해 장기간 보관할 수 없다.
특히, 에코트로픽 또는 앰포트로픽 바이러스에 비해 판트로픽 바이러스는 미세한 조작이나 상온에서의 방치 등에 의해서 쉽게 깨어지므로 안정성이 매우 떨어진다. 따라서 그 응용의 가능성과 가치에 비해서 적절하게 이용되지 못하고 있다.
바이러스 입자를 고농도로 농축하기 위하여 통상적으로 사용되는 현탁액은 pH 완충액 및 염을 포함하는데, 이러한 현탁액을 사용하는 경우 바이러스 입자의 외피 단백질이 안정적으로 보존되는 데에 한계가 있다. 외피 단백질이 안정적으로 보존되지 못하면 바이러스의 감염성이 떨어지고 바이러스의 역가도 함께 소실된다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 극복하기 위해 바이러스 입자의 외피 단백질을 안정적으로 유지시키며 바이러스를 고농도로 농축할 수 있는 현탁액을 제조하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 광범용성 유전자 재조합 레트로 바이러스를 고농도로 농축하여 그 이용가능성을 향상시키고, 바이러스의 불안정성을 극복하여 장기간 보관하기 위하여 고농도 레트로 바이러스 현탁액의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 유전자 재조합 레트로 바이러스로 트랜스펙션된 세포주의 배양액을 원심분리에 의해 농축하고, 부형제로 현탁화시킨 레트로 바이러스 현탁액의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 i) 재조합 레트로 바이러스 벡터로 트랜스펙션(transfection)된 세포주의 배양액을 원심분리에 의해 농축시키는 단계; 및 ii) 아미노산 및 당을 포함하는 부형제로 현탁시키는 단계를 포함하는 고농도 레트로 바이러스 현탁액의 제조 방법에 관한 것이다.
레트로 바이러스를 생산하는 패키징 세포주를 제조하기 위해 먼저, 재조합 레트로 바이러스 벡터를 제조해야 한다.
본 발명의 재조합 레트로 바이러스 벡터는 외피 단백질 유전자를 제외한 유전자를 포함하며, 염색 반응을 통해서 바이러스의 역가 등을 쉽게 추적할 수 있도록 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)를 발현하도록 제작한다. 또한, 재조합 레트로 바이러스 벡터는 항생제 저항성 유전자를 포함하도록 하여 항생제를 이용하여 트랜스펙션된 세포주를 선별할 수 있도록 제작한다. 따라서 항생제를 포함하는 배지상에서 트랜스펙션된 세포주를 배양하면 벡터가 도입된 세포주만이 살아남게 된다. 상기의 세포주는 GP2-293, PT-67 등의 세포주를 이용하게 된다.
상기에서 제작된 재조합 레트로 바이러스 벡터를 세포주에 트랜스펙션하는데, 트랜스펙션은 인산칼슘-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란법, 양이온 지질법 등의 방법에 의해 수행되며, 양이온 지질법이 바람직하다. 양이온 지질법은 양이온 지질막 내부에 DNA를 밀봉하여 세포막의 지질 성분과 융합하여 세포 내부로 외래 유전자를 도입하는 방법이다.
본 발명에서는 양이온 지질법에 의한 트랜스펙션에 있어서, DNA 및 양이온 전달체의 최적 조건을 확립하였다. 벡터의 양은 일정하게 고정하고 양이온 전달체의 양은 변화시켜 양이온 전달체의 최적 조건을 찾아내고, 또한 양이온 전달체의 양은 고정하고 DNA의 양을 변화시켜 DNA의 최적 조건을 찾아내었다. 그 결과, 중량을 기준으로 DNA와 양이온 전달체의 비율이 1:4 내지 1:14, 바람직하게는 1:7일 때 트랜스펙션이 가장 효율적으로 일어났다.
미리 배양시킨 세포주에 재조합 레트로 바이러스 벡터/양이온 전달체를 1:4 내지 1:14의 비율로 포함하는 반응액을 첨가하여 트랜스펙션을 수행한다. 양이온 전달체로는 리포펙타민이 바람직하다.
재조합 레트로 바이러스 벡터가 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여, 트랜스펙션을 수행한 세포주들을 항생제를 포함한 배지상에서 배양시킨다. 그 결과, 재조합 레트로 바이러스 벡터로 트랜스펙션된 세포주들만이 항생제 저항성 물질을 발현하므로 트랜스펙션된 세포주들을 선별할 수 있다.
또한 레트로 바이러스 벡터는 베타-갈락토시다제를 발현시키므로, 상기에서 선별된 클론 중 일부를 취하여 X-gal로 염색하여 관찰하면 재조합 레트로 바이러스 벡터가 도입된 세포주를 선별할 수 있다. 이 세포주는 냉동보관하여 필요할 때마다 해동시켜 이용할 수 있다.
이 세포주를 외피 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 다시 상기 방법과 동일하게 트랜스펙션시켜 패키징 세포주를 제조한다. 트랜스펙션한 다음, 패키징 세포주를 다시 배양하여 바이러스 입자를 포함하는 배양액을 수득한 후, 이 배양액을 필터에 통과시켜서 세포 부유액을 제거하고 28,000rpm으로 초원심분리한다. 이때 레트로 바이러스가 1X107 내지 1X1011 입자수/㎖로 농축되는 것이 바람직하다.
원심분리에 의해 침전된 바이러스의 현탁화에 있어서, 통상적으로 TNE(50mM Tris(pH 7.8), 130 mM NaCl, 1 mM EDTA) 용액 및 Hank's balanced salt 용액(HBSS, Gibco사, 미국) 등이 이용되고 있으나, 이들은 장기간 보관하는 경우 활성이 급격하게 떨어지는 단점이 있다. 따라서 일정 기간 이상을 보관하기 위해서는 새로운 형태의 부형제가 요구된다.
본 발명에서는 상기에서 설명한 바와 같이 새로운 형태의 부형제의 필요성에 따라, 당 및 아미노산은 단백질의 보존성을 향상시킨다는 일반적인 사실에 근거하여 당 및 아미노산을 포함하는 용액을 부형제로서 사용하였다.
당으로는 포도당, 락토스, 마니톨, 수크로스, 갈락토스, 프룩토스, 상기 단당류를 포함하는 다당체 또는 이들의 혼합물 등이 사용될 수 있으며, 마니톨이 바람직하다. 당의 농도는 1 내지 50㎎/㎖, 바람직하게는 1 내지 10㎎/㎖이다.
아미노산으로는 글리신, 라이신, 세린, 알라닌 또는 이들의 혼합물 등이 있으며, 글리신이 바람직하다. 아미노산의 농도는 1 내지 100㎎/㎖, 바람직하게는 5 내지 50㎎/㎖이다.
본 발명에 따른 부형제인 글리신/마니톨을 포함하는 용액으로 레트로 바이러스 침전물을 현탁시킨 경우에는 통상적으로 사용되는 TNE 또는 Hank's balanced salt 용액에 비해 레트로 바이러스의 활성 및 보관 시간 경과에 따른 안정성이 훨씬 높은 것으로 확인되었다.
레트로 바이러스의 활성을 알아보기 위해 역가를 측정한다. 이는 바이러스 용액을 세포주에 감염시킨 후 감염된 세포수를 세어서 측정할 수 있다. 상기 현탁시킨 바이러스 용액을 8㎍/㎖의 폴리브렌(polybrene, Sigma사, 미국)이 포함된 배양 배지로 희석한 후, 미리 배양해 놓은 세포주에 감염시켜 다시 배양한다. 감염된 세포를 확인하기 위해 배양된 세포주를 고정하고 X-gal 용액(Promega사, 미국)을 첨가하여 배양한 후, 파란색을 나타내는 세포수를 세어서 역가를 측정한다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 레트로 바이러스 벡터의 제작
베타-갈락토시다제 유전자를 포함하는 pCMV-β 벡터(Clonetech사)를 PstI 제한 효소(Roche사)로 37℃에서 1시간 동안 절단하여 CMV 및 LacZ가 융합된 상태의 4.5 kb의 DNA 절편을 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 분리하였다. 분리된 DNA절편은 겔 분리 칼럼(Qiagen사)을 사용하여 정제하고 이를 다시 녹두의 말단 절단 효소(Roche사)로 상온에서 5분 동안 처리하여 평활화 작업을 수행하였다.
또한 pLXRN(Clonetech사) 벡터를 HpaI(Roche사)으로 37℃에서 1시간 동안 처리하여 평활화된 CMV-LacZ의 DNA 절편과 함께 T4 DNA 융합효소(Roche사)를 사용하여 16℃에서 16시간 이상 융합반응을 실시하였다. 융합 반응액을 TOP10 수용성 세포주(Invitrogen사)에 열충격 형질도입하고, 50㎍/㎖ 앰피실린이 있는 LB 플레이트 배지에서 하루 동안 37℃에서 배양하였다. 얻어진 콜로니를 각각 취하여 액체 LB 배지에서 플라스미드를 추출한 후, HpaI, EcoRI, SalI, XhoI 등의 제한 효소 지도 작성법으로 방향성을 검증하였다. 제한 효소 지도 작성법으로 방향성이 검증된 클론을 DNA 염기서열 분석을 통하여 염기 서열을 분석해서 최종 클론을 결정하고 이름을 pLXRN/LacZ라 명명하였다(도 1 참조).
실시예 2: 재조합 레트로 바이러스 벡터를 세포주에 도입
양이온 지질법을 이용한 트랜스펙션(transfection) 최적 조건을 알아보기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 벡터를 4.5㎍로 고정하고, 2㎍/㎕의 리포펙타민을 4.5㎕부터 4.5㎕씩 증가시켜 27㎕까지 변화시킨 그룹, 및 리포펙타민을 4.5㎕로 고정하고 벡터를 0.625㎍부터 2배씩 증가시켜 7.5㎍까지 변화시킨 그룹을 각각 트랜스펙션을 실시하였다. 결과적으로, 벡터를 4.5㎍, 리포펙타민을 16㎕(32㎍)으로 첨가했을 때 가장 높은 트랜스펙션 효율을 나타냈다. 이로써, 리포펙타민과 DNA의 비율이 7:1(w:w)인 경우에 바이러스 생산성이 가장 높으므로 효율적인 트랜스펙션이 수행됨이 확인되었다.
실시예 1에서 제조된 pLXRN/LacZ 벡터 18㎍을 무혈청 배지상에서 양이온 전달체인 리포펙타민(lipofectamine, Invitrogen사) 63㎕(126㎍)와 20분 동안 결합시켜 반응용액을 제조하였다. 상기 벡터와 리포펙타민의 비율은 최적조건으로 확인된 1:7(w:w)이다.
트랜스펙션을 하기 전에 배양해 놓은 GP293 세포주(Clontech 사)는 4㎖의 무혈청 배지로 1회 수세하였으며, 4㎖의 무혈청 배지를 첨가한 후, 상기 실시예 1에서 상기에서 제조된 반응용액 4㎖을 첨가하여 6시간 동안 배양하였다. 트랜스펙션 후 약 48시간 경과 후부터 G418 항생물질(400㎍/㎖; Geneticin, Sigma, St.Louis, MO)을 800㎍/㎖이 되도록 배지에 첨가하여, 트랜스펙션된 세포주들을 선별하였다. 약 1주일이 경과한 후, 살아 남은 세포들을 60mm 디쉬에 옮기면서 한 디쉬당 약 10개의 세포가 들어가도록 한계 희석하였다. 지속적으로 G418이 들어 있는 배지에서 배양을 실시하여 육안으로 콜로니가 형성될 때까지 배양을 지속적으로 실시하였다. 평균적으로 4 내지 5개 정도의 콜로니가 디쉬에서 관찰되었다. 육안으로 콜로니가 관찰된 후 링 실린더를 이용하여 세포주를 흡입하고 이를 다시 6 웰 플레이트로 이식하였으며, 집적도 70 % 이상으로 분열할 때까지 다시 G418 배지상에서 배양하였다. 클론중 일부를 취하여 다시 배양한 후, 0.04 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 및 0.04 % 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 고정하고, 1.7㎎/㎖의 X-gal을 포함하는 염색용액(5mM Potasium ferricyanide, 5mM potassium ferrocyanide 및 2mM MgCl2) 1 내지 2㎖로 염색하였다. 염색 정도를 관찰하여 최종적으로 트랜스펙션된 세포주를 결정하였다. 최종적으로 도 2의 I-2 및 II-1 클론을 선별하였다.
실시예 3: 바이러스의 생산과 농축
상기 실시예 2에서 선별된 세포주를 4㎖ 무혈청 배지로 1회 수세하였으며, 4㎖의 무혈청 배지를 첨가하여 6시간 동안 배양하였다.
이 세포주를 VSV-G 생산 유전자를 포함하는 pVSV-G 벡터(Invitrogen사)로 다시 트랜스펙션시켰다. 이때 트랜스펙션은 실시예 2에서 수행한 방법과 동일하게 실시하였다.
트랜스펙션 후, 다시 48시간 동안 배양하여 바이러스 배양액을 생산하였다. 이 바이러스 배양액 11.5㎖를 0.45㎛ 필터(Millipore사)에 통과시켜 세포 부유액을 제거하고 90분 동안 28,000rpm에서 초원심분리하여 농축된 바이러스 침전물을 수득하였다. 농축된 바이러스 침전물을 50㎕의 글리신/마니톨이 포함되어 있는 용액(20mM Sodium phosphate, 10㎎/㎖ 글리신, 2.6㎎/㎖ 마니톨)으로 현탁하였다. 현탁액은 실험예 1에서와 같이 역가를 측정하였으며, 역가는 107 내지 1011/㎖이었다.
실험예 1: 부형제의 종류에 따른 바이러스의 역가
상기 실시예 3에서 수득된 농축된 바이러스 침전물을 각각 50㎕의 TNE 완충액, Hank's balanced salt 용액(HBSS) 및 상기 글리신/마니톨이 포함되어 있는 용액(20mM Sodium phosphate, 10㎎/㎖ 글리신, 2.6㎎/㎖ 마니톨)으로 각각 현탁하였다.
현탁시킨 바이러스 용액을 8㎍/㎖의 폴리브렌(polybrene, Sigma사, 미국)이 포함된 배양 배지로 희석한 후, 미리 배양해 놓은 생쥐에서 유래한 NIH3T3 및 Swiss3T3 세포주, 소의 골수에서 유래한 MDBK 세포주, 및 닭에서 유래한 CEF 세포주(ATCC사)에 감염시켜 다시 배양한다. 0.04 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 및 0.04 % 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 고정하고, 1.7㎎/㎖의 X-gal을 포함하는 염색용액(5mM Potasium ferricyanide, 5mM potassium ferrocyanide 및 2mM MgCl2) 1 내지 2㎖로 염색하여, 색을 나타내는 세포수를 세어서 역가를 측정한다. 측정된 결과는 표 1과 같다.
NIH3T3 MDBK Swiss3T3 CEF
TNE 4.1 X 108 6.8 X 108 7.4 X 108 8.7 X 108
Hank's soln. 7.8 X 108 9.0 X 108 8.3 X 108 9.7 X 108
Gly/Manitol 1.2 X 1010 2.0 X 1010 1.8 X 1010 3.1 X 1010
표 1에서 보는 바와 같이 부형제 중에서 본 발명에 따른 글리신/마니톨이 가장 좋은 역가를 유지하고 있으며, 세포의 종류에 상관없이 가장 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있다.
실험예 2: 부형제의 종류에 따른 레트로 바이러스의 안정성 시험
부형제의 종류에 따른 레트로 바이러스의 안정성을 확인하기 위해 Hank's balanced salt 용액(HBSS), TNE 용액 및 본 발명에 따른 글리신/마니톨이 포함되어 있는 용액으로 각각 현탁시킨 바이러스를 4℃에서 24시간 동안 보관하며 시간에 따른 레트로 바이러스의 활성을 역가로 실측하였다.
부형제의 종류, 보관 온도 및 보관 시간의 외적 요소에 따라 안정적으로 활성을 나타내는 정도가 다르게 나타났다.
4℃에서 시간에 따른 안정성을 확인한 결과, 본 발명에 따른 글리신/마니톨이 포함되어 있는 용액에 현탁된 레트로 바이러스가 가장 높은 활성을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다(도 3).
도 3에서 보여지는 바와 같이, Hank's balanced salt 용액 또는 TNE를 포함하는 현탁액에 비해 발명에 따른 부형제를 포함한 현탁액을 사용한 경우에, 레트로 바이러스의 활성이 50% 감소하는 데 걸리는 시간이 2배 정도였다. 따라서 본 발명에 따른 부형제를 포함하는 현탁액을 사용하는 경우 오랜 시간 활성을 유지한다는 것을 확인하였다.
본 발명은 방법에 따라 레트로 바이러스를 고농도로 농축할 수 있을 뿐만 아니라 장기간 보존할 수 있는 고농도 레트로 바이러스 현탁액을 제조하여, 레트로 바이러스를 백신 또는 유전자 치료제 등의 용도로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 재조합 레트로 바이러스 벡터인 pLXRN/LacZ를 제조하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 재조합 레트로 바이러스 벡터인 pLXRN/LacZ로 트랜스펙션된 세포주들을 X-gal로 염색한 사진이다.
도 3은 Hank's balanced salt 용액(HBSS), TNE 및 글리신/마니톨을 포함한 용액 각각을 부형제(stabilizer)로 사용하여 4℃에서 레트로 바이러스 현탁액을 보관할 때, 시간 경과에 따른 레트로 바이러스의 안정성을 비교한 그래프이다.

Claims (9)

  1. i) 재조합 레트로 바이러스 벡터로 트랜스펙션(transfection)된 세포주의 배양액을 원심분리에 의해 농축시키는 단계; 및
    ii) 농축된 배양액을 글리신, 라이신, 세린, 알라닌 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 아미노산 및 마니톨, 포도당, 락토스, 수크로스, 갈락토스, 프룩토스, 이들을 포함하는 다당체 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 당을 포함하는 부형제로 현탁시키는 단계
    를 포함하는, 1X107 내지 1X1011 입자수/㎖로 농축된 레트로 바이러스 현탁액의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    레트로 바이러스가 소포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV)임을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    아미노산의 농도가 1 내지 100㎎/㎖인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    당의 농도는 1 내지 50 ㎎/㎖인 방법.
  7. 1X107 내지 1X1011 입자수/㎖의 재조합 레트로 바이러스; 1 내지 100㎎/㎖의 글리신, 라이신, 세린, 알라닌 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 아미노산; 및 1 내지 50㎎/㎖의 마니톨, 포도당, 락토스, 수크로스, 갈락토스, 프룩토스, 이들을 포함하는 다당체 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 당을 포함하는 레트로 바이러스 현탁액.
  8. 제 1 항에 따른 방법으로 제조된 레트로 바이러스 현탁액을 이용하여 세포주를 감염시키는 단계를 포함하는, 세포주의 유전형질을 변화시키는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    세포주가 인간을 포함한 포유동물 세포주 또는 가금을 포함한 조류 세포주임을 특징으로 하는 방법.
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