SU927126A3 - Способ получени урокиназы - Google Patents

Description

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРОКИНАЗЫ

I

Изобретение относитс  к химикофармацевтической промышленности и касаетс  получени  лекарственных препаратов.

Известен способ получени  урокиназы путем культивировани  культуры почечной ткани в жидкой питательной среде в присутствии аминокислоты с последующим выделением целевого продукта 1.

Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода целевого продукта .

Цель изобретени  - повышение выхода урокиназы.

Указанна  цель достигаетс  тем, что при осуществлении способа получени  урокиназы путем культивировани  культуры почечной ткани в жидкой питательной среде в присутствии аминокислоты с последующим выделением целевого продукта культивирование ведут в присутствии 0,3-0,5% фенилаланина.

Способ осуществл ют следующим образом .

Почечные клетки выращивают в соответствующей питательной среде в сосудах дл  тканевых культур при до сли ни  клеток. Среда 199  вл етс 

g типичной, подход щей средой роста. Можно также использовать модифицированную среду EagEe по DuEbeceo, среду 5 А по McCoy, среду MB 752/1 по Waymouth и другие о&цеприн тые среды

IQ дл  тканевых культур. Во врем  роста культуральную среду укрепл ют сывороткой млекопитающих, например сывороткой эмбриона крупного рогатого скота, в количестве 5-15% по объему.

15 среды.

После сли ни  клеток их промывают физиологическим раствором, например буферным рассолом, и затем промывную жидкость замен ют консервирующим веществом.

Можно использовать водную питательную среду, котора   вл етс  необходимой дл  сохранени  почечных клеток и дл  получени  урокиназы. Эта

25 среда содерххит гидролизат белка моло392 ka, альбумин человеческой сыворотки, глюкозу и бикарбонат натри . Кроме гидролизата белка молока, можно также использовать и другие белковые гидролизаты, такие как триптол, триптозу , пептон и другие материалы. П р и м е р 1. Нормальные первичные клетки почки человеческого эмбриона (ПЧЭ) центрифугируют и пересуспендируют в среду 199f содержащую 10% по объему сыворотки эмбриона круп ного рогатого скота. Клеточную суспензию примен ют дл  инокул ции пласт массовых колб Фалькона емкостью 75 см |;одержащих ту же среду в количествахi достаточных дл  того, чтобы конечный культуры составил 15-2J3 мл, а плотность клеток 1,,ОЧО клеток на мл. Колбы инкубируют при 37°С в инкубаторе с содержанием S% СОп в воздухе. Среду в колбах мен ют каждые 2-3 сут до сли ни  культур. Затем клетки в каждой колбе промывают 25 мл стерильного, физиологически нормального сол ного раствора. После удалени  промывного раствора 10 мл консервирующего вещества содержат 13,65 г/л среды гидролизата лактальбумина; 2,2 г/л NaHCO, 0,1 вес. сывороточного альбумина человека; (1,1 вес. Д-глюкозы и 0,5 вес.% фенилаланина. Из консервирующего вещества отбирают пробу дл  титров урокиназы и его пополн ют ежесуточно 10 мл того же свежего консервирующего вещества. По истечении четырехсуточного .культивировани  среДУ удал ют и клетки в каждой колбе промывают несколько раз 25 мл сол ного раствора и затем 1 н. раствором NaOH. Анализ показывает, что содержание ДШ в клетках почки человеческого эмбриона составл ет 9 мкг ДНК (10 эклеток ). . Анализ урокиназы производ т путем двухступенчатого метода с помощью йодированной фибрином плитки. В первой стадии урокиназа действует на плазминоген с образованием плазмина. Во второй стадии плазмин гидролизует радиоактивномеченый сгущенный фибриноген (фибрин) с выделением фибринопептидрв в раствор, измеренных гаммасчетчиком . Активность урокиназы затем относ т пропорционально к радиоактивности , выделенной в раствор. Единицу активности урокиназы определ ют как количество энзима, который гидролизует один мгк фибрина за час. П р им е Р2. Нормальные первичные клетки почки человеческого эмбриона культивируют до сли ни  в колбах Т-75, как описано в примере 1, также промывают в стерильном сол ном растворе и удал ют 90 мл консервирующего вещества, фенилаланин добавл ют в каждую колбу. Среду пополн ют свежей средой, которую добавл ют в колбу объемом 30 мл каждые трое суток. По истечение дев тисуточного культивировани  в фенилаланине среду удал ют, клетки промывают несколько раз и определ ют содержание ДНК и титры урокиназы как в примере 1. В данном примере консервирующее вещество состоит из 13,75 г/л среды гидролизата лактальбумина , 2,2 г/л NaHCOзи 0,1 вес. Д-Тлюкбзы. Аминокислоту и/или человемеский сывороточный альбумин (ЧСА) добавл ют в основное консервирующее вещество дл  получени  желательной конечной концентрации {в вес.%). Аналогично примеру 1 активность урокиназы определ ют в мл на день и мкг ДНК. Сравнительные, данные по выходу урокиназы представлены в таблице.

Без добавки

0,U ЧСА

0,1 ЧСА + 0,3 глицин

0,U ЧСА 0,5% глицин

Конечное содержание ДНК в клетках в каждой колбе по истечении дев тисуточного культивировани  в консервирующем веществе.

Выход урокиназы, полученный куль- ткани в жидкой питательной среде в

тивированием почечных клеток при ис- 5присутствии аминокислоты с последуюпользовании повышенных количеств фе-щим выделением целевого продукта,

нилаланина в консервирующем вещест-отличающийс  тем, что,

ве, в основном, выше, чем при ис-с целью повышени  выхода урокиназы,

пользовании других аминокислот гли-культивирование ведут в присутствии

цина, метионина, гистидина. Это улуч-ЗО0,3-0,5 0енилала «4на. шение достигаетс  и тогда, когда число клеток (т.е. содержание ДНК) по-Источники информации,

нижаетс ,прин тые во внимание при экспертизе

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  урокиназы путем Э51- Патент США If ЭЗЗОЭ

   культивировани  культуры почечнойкл. .7 опублик. 1976.

   Продолжение таблицы