HU179549B

HU179549B - Process for producing uroquinase

Info

Publication number: HU179549B
Application number: HU79MO1050A
Authority: HU
Inventors: Mau-Jung Kuo; Margaret J Reents; Joseph Feder
Original assignee: Monsanto Co
Priority date: 1978-05-24
Filing date: 1979-05-23
Publication date: 1982-11-29
Also published as: CA1114761A; SU927126A3; JPS629319B2; AU522609B2; EP0005644B1; US4190708A; EP0005644A3; DK152138B; JPS54163887A; AU4734379A; DE2965182D1; DK152138C; DK212079A; MX5901E; EP0005644A2

Description

A találmány tárgya eljárás urokináz előállítására.

Az urokináz-enzim hatására a plazminogén plazminná alakul át. (A plazmin aktív proteáz, amely a fibrint oldható peptidekre hasítja.) így az urokináz mint aktivátor elősegíti a vérrögök (a vérpályában keletkező fibrinalvadék) feloldódását.

Urokináz kis mennyiségben előfordul az emberi vizeletben, de a számítások szerint az enzim klinikai dózisának előállításához legalább 1500 liter vizelet szükséges.

Újabban különböző állati vesesejtek, például egérvese, újszülött hörcsög-vese (BHK = baby hamster kidney) és emberi embrió-vese (HEK = humán embryonic kidney) sejtek tenyészetéből nyertek urokinázt. Kimutatták, hogy a szövettenyészetben növekedett HEK-sejtekből izolált urokináz azonos a vizeletből származó urokinázzal (Barlow és Lazer, Thromb. Rés. 1/3,201—207(1972)].

Ezideig különböző módszereket ajánlottak az urokináz-termelés szövettenyésztő eljárásokkal való megjavítására: A 3 904 480 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás eljárásában különböző mitózisgátló anyagokat adnak a sejttenyésztő folyadékhoz a plazminogén aktivátor (urokináz) termelésének fokozása céljából. A probléma egy másik megközelítésénél a vese-sejttenyészetre fibrint rétegeznek az urokináz-képződés fokozása céljából [Bemik és Kwaan, J. Láb. Clin. Med. 70, 650 (1967), J. Clin. Invest. 48, 1740 (1969), J. Clin, Invest. 52, 823 (1973)]. Egyéb anyagok meghatározott mennyiségé nek. hozzáadását is javasolták az urokináz-termelé elősegítése céljából, így pronáz (3 930 944 számi Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás) és glicin (3 930 945 számú Amerikai Egyesült Államok5 beli szabadalmi leírás) hozzáadását.

Az urokináz-termelés megjavításának egy másik módszere szerint kiválasztják az enzimet termelő sejteket és eltávolítják az enzimet nem termelőket (Barlow és munkatársai, „Production of Plas10 minogen Activator by Tissue Culture Techniques”. „Proteases and Biological Control”, Cold Spring Harbor Cönference on Cell Proliferation, 2. kötet, 1975, Cold. Spring Hatbor Láb., kiadó Reich, Rifkin és Shaw, 325-331 oldal). Az utóbbi közleményben azt 15 is leírják, hogy külön hozzáadott aminosavak, mint aszparaginsav és glutaminsav nen növelik a plazminogén aktivátor termelődését, de plazminogén és más proteázok viszont növelik. A 3 930 940 számú Amerika: Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint 20 az aminosavak - glicin kivételével - hatástalanok, vagy néha ellentétesen befolyásolják az urokináz-termelíídést.

A találmány szerint váratlanul azt találtuk, hogy ha a vesesejt-tenyészet tápfolyadékához meghatáro25 zott mennyiségű aromás aminosavat, mint fenil-alanint adunk, az urokináz termelődése olyan mértékben fokozható, amely lényegesen meghaladja az ekvivalens mennyiségű glicinnel elérhető mennyiséget. Ez a felfedezés annál is inkább meglepő, mert bizonyos 30 más aminosavak, mint aszparaginsav, glutaminsav, me<79549 tionin és hisztidin pótlólagos mennyiségének hatására csak kis mértékben fokozódik az urokináz-képződés, vagy pedig egyáltalán nem nagyobb, mint a fenti aminosavak pótlólagos hozzáadása nélkül. A fenil-alaninnal kapott nagyobb kitermelést annak ellenére érjük el, hogy a tenyészetben a sejtszám (sejtsűrűség) az idővel csökken.

A találmány szokásos kivitelezésénél élő vesesejteket - melyek ismert módon urokinázt képeznek alkalmas, a sejtek növekedését serkentő tápfolyadékban mintegy 35-37 °C-on szövettenyésztő edényekben addig inkubáljuk, amíg a sejtek összefüggő réteget nem képeznek az edény alján. A „Médium 199”, melyet Morgan, Morton és Parkéi [Proc. Soc. Exptl. Bioi. Med. 73, 1 (1950)] szerint állítottunk elő, jellemző, sejtnövekedést serkentő tápfolyadék. A Dulbecco által módosított Eaglemédium, a McCoy-féle Médium 5A, a Waymouth-féle MB752/1 Médium és hasonló szokványos szövettenyésztő tápfolyadékok [például Morton, In Vitro 6/2, 89-108 (1970)] szintén használhatók. A növekedési fázis folyamán a tápfolyadék előnyösen egészíthető ki emlős szérummal, például fötális borjúszérummal, általában a tápfolyadék térfogatára vonatkoztatva mintegy 5-15% mennyiségben.

Miután a sejtek már összefüggő réteget képeztek, fiziológiailag elfogadható mosóoldattal, például pufferezett konyhasóoldattal mossuk, majd a mosóoldatot fenntartó tápközeggel cseréljük fel.

Bármilyen vizes tápfolyadék használható, amelyről ismeretes, hogy alkalmas a vesesejtek és azok urokináz-termelésének fenntartására. A tápfolyadék előnyösen laktalbumin-hidrolizátumot, emberi szérumalbumint (HSA), glükózt és nátrium-hidrogén-karbonátot tartalmaz. A laktalbumin-hidrolizátumon kívül más fehérje-hidrolizátum is használható, mint például tripton, triptóz, pepton és hasonló anyagok.

A találmány szerint a fenntartó táptalajt felemelt mennyiségű, előnyösen 0,3-0,7 súly% fenű-alaninnal egészítjük ki az urokináz fent leírt, nagyobb kitermelése érdekében. Ez körülbelül 60-140-szerese a Médium 199-ben levő fenil-alanin mennyiségének. Legelőnyösebben körülbelül 0,5% fenil-alanint használunk a fenntartó táptalajban. Úgy gondoljuk, hogy ennél lényegesen nagyobb mennyiségek mérgezőleg hatnak a sejtekre.

A következő példák a találmány további ismertetésére szolgálnak, de a találmányt nem korlátozzák a példák speciális részletei.

1. példa

Normális primer (közvetlenül szervezetből származó) emberi embrió-vese (HEK) sejteket [a Grand Island Biological Co. (GIBCO) cégtől szuszpenzió formájában beszerezve] lecentrifugálunk és 10 térfogat% fötális boíjúszérumot tartalmazó Médium 199-ben újraszuszpendálunk. (A szérum beszerzési forrása: KC Biologicals, Inc., Lenexa, Kansas.) A sejtszuszpenzióval 75 cm² területű Falcon-műanyagedényeket (T-75 edények) oltunk be, amelyek szintén a fenti médiumot tartalmazzák. A beoltást úgy végezzük, hogy a tenyészet végtérfogata 15-20 ml és a sejtsűrűség 1,5-2,0 · 10^s sejt/ml legyen. Az edényeket °C-on 5% CO₂ - levegő keveréket tartalmazó termosztátban inkubáljuk. Az edényekben levő tápfolyadékot minden 2. vagy 3. napon addig cseréljük, amíg a tenyészetek sejtjei összefüggő réteget nem alkotnak. Ezután a sejteket minden edényben 25 ml steril fiziológiás konyhasóoldattal mossuk (Fisher Scientiflc Co., katalógusszám SO-S—442).

A mosóoldat eltávolítása után 10 ml fenntartó tápfolyadékot adunk minden edényhez, a fenntartó tápfolyadék 13,65 g/liter laktalbumin-hidrolizátum médiumot (GIBCO, katalógusszám M-ll), 2,2 g/ /liter nátrium-hidrogén-karbonátot, 0,1 súly% HSA-t (Sigma Chemical Co., katalógusszám A—2386), 0,1 súly% D-glükózt és 0,5 súly% L-aminosavat (fenil-alanint, metionint, hisztidint vagy glicint) tartalmaz, az alábbi 1. táblázat szerint. A fenntartó tápfolyadékból mintát veszünk az urokináz-titer meghatározásához és naponta friss, azonos fenntartó tápfolyadékkal cseréljük fel. A 4 napos sejttenyésztő szakasz után a tápfolyadékot eltávolítjuk és az összes edényben levő sejteket többször 25 ml konyhasóoldattal mossuk, majd 1 n nátrium-hidroxid-oldattal emésztjük. Ezután dezoxiribonukleinsav (DNS) meghatározást végzünk. A HEK-sejtek szokásos standard DNS-tartalma 9 gg/10⁶ sejt. Az 1. táblázatban feltüntetett urokináz-titerek megadásának módja: ml per nap per Mg DNS.

Az urokináz-próbát kétlépcsős, jódozott fibrinlemez módszerrel végezzük el. A fibrinolízis első fázisában az urokináz a plazminogénre hat és lehetővé teszi annak plazminná alakulását. A második fokozatban a plazmin hidrolizálja a radioaktív jelzésű, megalvadt fibrinogént (fibrint) és ^{12 5} J-fibrinopeptidek szabadulnak fel és kerülnek be az oldatba, melyet gamma-számlálóban lemérünk. Az urokináz-aktivitás arányos az oldatban mért radioaktivitással. 1 egység urokinázaktivitás az enzim azon mennyisége, amely óránként 1 Mg fibrint hidrolizál. A fenti urokináz-meghatározás a ¹²⁵J-fibrinlemez fibrinolízisen alapuló sejtfaktor-aktivitásának mérésére szolgáló általános eljárásból (Unkeless és munkatársai, J. Exptl. Med. 137/1, 85-111 (1973)] és a fibrinogén jódozására leírt általános módszerből [Helkamp és munkatársai, Cancer Rés, 20,1495-1500(1960)] származik.

2. példa

Normális primer HEK-sejteket egyenletes sejtréteg kialakulásáig tenyésztünk a T-7 5 edényekben a fenti

1. példában leírtak szerint, steril fiziológiás sóoldattal mossuk és a mosó folyadékot eltávolítjuk.

ml fenntartó tápfolyadékot adunk minden edényhez. Minden 3. napon tápfolyadékcserét végzünk friss, azonos médiummal. A fenntartó tápfolyadékban való 9 napos tenyésztés után a sejteket DNS-próbához emésztjük és meghatározzuk az urokináz-titereket.

E példában a fenntartó tápfolyadék 13,75 g/liter laktalbumin-hidrolizátum tápközeget 2,2 g/liter nátrium-hidrogén-karbonátot és 0,1 súly% D-glükózt tartalmaz. A kívánt végkoncentráció eléréséig (súly%) aminosavat és/vagy emberi szérumalbumint (HSA) adunk a fenntartó alap-tápfolyadékhoz, az alábbi 2. táblázat szerint. Az 1. példához hasonlóan az urokináz-aktivitást per ml per nap per Mg NDS formájában fejezzük ki.

1.táblázat

Urokináz-titerek összes DNS*

Aminosav	l.nap	2. nap	3. nap	4. nap	dg
Fenil-alanin	37,85	46,8	33,55	37,2	80,95
Metionin	15,3	7,2	7,6	10,4	79,0
Hisztidin	11,9	12,6	13,5	8,2	71,5
Glicin	10,7	11,4	16,4	33,3	67,8

* Az edényekben levő sejtek végső DNS-koncentrációja a fenntartó tápfolyadékban való 4 napos tenyésztés végén.

2. táblázat

Adalékok	3. nap	Urokináz-titerek 6. nap	9. nap	összes DNS* Mg
semmi	6,1	3,6	3,1	285,8
0,1% HSA	13,5	7,4	4,8	298,5
0,1% HSA +0,3% Gly	22,4	11,9	11,7	308,3
0,1% HSA+ 0,5% Gly	26,3	24,8	17,0	264,0
0,1% HSA+0,3% Phe	22,2	25,6	16,4	223,8
0,1% HSA+0,5% Phe	61,2	35,6	36,3	126,0
0,3% Gly	13,1	14,0	7,4	287,0
0,5% Gly	27,2	10,5	9,0	296,3
0,3% Phe	24,4	16,1	10,1	205,5
0,5% Phe	46,7	27,3	19,9	118,8

* Az edényekben levő sejtek végső DNS-tartalma a fenntartó táp folyadékban való 9 napos tenyésztés után Gly = glicin

Phe = fenil-alanin Szabadalmi igénypontok:

A fenti példákból látható, hogy ha a fenntartó tápfolyadékban megnövelt mennyiségű fenil-alanint alkalmazunk, akkor a vese-sejttenyészetből kinyert urokináz mennyisége lényegesen nagyobb, mint más aminosavak, például glicin, metionin és hisztidin alkalmazása esetén. Ez a fokozott urokmáz-termelődés annak ellenére következik be, hogy a sqtszám (a DNS-tartalom alapján) az idő függvényében csökken.

E leírás elolvasása után a szakember számos más példát is nyilvánvalónak találhat a találmány szellemétől és hatókörétől való eltérés nélkül. Szándékunknak megfelelően az igénypontok hatályába minden ilyen további példa is beletartozik.

Claims

1. Eljárás urokináz termelésére élő vesesejtek vizes tápfolyadékban való tenyésztése útján, azzal jellemezve, hogy az urokináz-termelés fokozása céljából 0,3-0,7 súlyszázalék mennyiségű fenil-alanint adunk a tápfolyadékhoz.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fenil-alanint 0,5 súlyszázalék mennyiségben alkalmazzuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy normális primer emberi embrió-vesesejteket tenyésztünk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy laktalbumin-hidrolizátumot, emberi szérum-albumint, glükózt és NaHCO₃-ot tartalmazó tápfolyadékot használunk.