KR20010005626A

KR20010005626A - 혈관 질환의 치료 방법

Info

Publication number: KR20010005626A
Application number: KR1019997008693A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 더블유. 그린넬; 다니엘 씨. 호웨이; 찰스 브이. 잭슨
Original assignee: 피터 지. 스트링거; 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1998-03-24
Publication date: 2001-01-15
Also published as: TR199902335T2; AU6474198A; NO994630D0; AU733756B2; DE69833727D1; TW513307B; ID23176A; BR9808063A; JP4680329B2; WO1998042358A1; CN1252726A; EP0872245A1; DE69833727T2; ES2257794T3; NO994630L; ATE319472T1; JP2001518933A; CA2284279A1; IL131615A0; NZ337291A

Abstract

활성화 단백질 C (aPC)를 투여함으로써, 혈전성 뇌졸중의 후천적 질병 상태를 포함한 혈관 폐색 및 혈전색전성 질환의 환자를 치료하는 방법을 제공한다. aPC의 투여는 출혈 복합증을 일으킬 가능성이 낮은, 고도로 선택적인 치료제를 제공한다. aPC의 투여는 미소혈관 및 거대혈관 폐색성 동맥 혈전의 국소적인 확장을 방지함으로써 뇌졸중으로 인한 신경 손실을 감소시키는데 있어서 유익하다.

Description

혈관 질환의 치료 방법 {Methods for Treating Vascular Disorders}

단백질 C는 세린 프로테아제로서, 응혈 캐스케이드에서 인자 Va와 VIIIa를 불활성화시켜 항상성을 조절하는 역할을 하는 천연 항응혈제이다. 사람 단백질 C는 생체내에서 주로 간에서 461개 아미노산의 단일 폴리펩티드로서 생성된다. 이 전구체 분자는 1) 42개 아미노산 시그널 서열의 절단; 2) 155위의 라이신 잔기와 156위의 아르기닌 잔기를 단쇄 자이모겐으로부터 단백분해적으로 제거하여 2쇄형 분자 (즉, 262개 아미노산 잔기의 세린 프로테아제-함유 중쇄에 디술피드 브릿지를 통해 부착된 155개 아미노산 잔기의 경쇄) 형성; 3) 경쇄의 처음 42개 아미노산에 밀집된(clustered) 9개 글루탐산 잔기의 비타민 K 의존성 카르복실화로, 9개 감마-카르복시글루탐산 잔기의 생성; 및 4) 4개 위치에 탄수화물 부착 (경쇄에 1개 및 중쇄에 3개)을 포함하는 다수의 번역후 수식을 거친다. 중쇄는 Asp 257, His 211 및 Ser 360의 확립되어 있는 세린 프로테아제 트리아드를 포함한다. 마지막으로, 순환 2쇄 자이모겐은 생체내에서 칼슘 이온의 존재 하에 인지질 표면에서 트롬빈에 의해 활성화된다. 중쇄의 N-말단에서 도데카펩티드를 제거하여 활성화시키면, 효소 활성을 갖는 활성화 단백질 C (aPC)가 생성된다.

다른 단백질들과 결합하여, 단백질 C는 아마도 혈액 응고의 가장 중요한 억제 조절자 (down-regulator)로서 작용한다. 즉, 단백질 C 효소계는 주요한 생리학적인 항응혈 기전을 나타낸다.

응혈계는 자이모겐들을 활성 세린 프로테아제로 순차적으로 활성화시켜 궁극적으로 효소 트롬빈을 생산하고, 이는 제한적 단백분해를 통해 혈장 피브리노겐을 불용성 겔인 피브린으로 전환시키는 것을 포함하는 연쇄 반응으로서 가장 잘 설명된다. 응혈 캐스케이드에서 중요한 2가지 사건은 응혈 인자 IXa에 의한 응혈 인자 X의 응혈 인자 Xa로의 전환과 응혈 인자 Xa에 의한 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환이다. 이들 두 반응은 모두 세포 표면, 특히 혈소판 표면에서 일어난다. 이들 두 반응은 모두 보조 인자를 필요로 한다. 주요 보조 인자인 인자 V 및 VIII는 체내에서 비교적 불활성인 전구체로서 순환하지만, 처음 몇분자의 트롬빈이 형성되면, 이 트롬빈이 고리형으로 묶여 제한적 단백분해를 통해 보조 인자를 활성화시킨다. 활성화된 보조 인자 Va 및 VIIIa는 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환과 또한 인자 X의 인자 Xa로의 전환을 모두 약 5배 촉진시킨다. 활성화 단백질 C는 그가 가수분해시키고 비가역적으로 파괴하는 2종의 혈장 단백질 기질을 압도적으로 선호한다. 이러한 혈장 단백질 기질들은 응혈 보조 인자 Va와 VIIIa의 활성 형태이다. 활성화 단백질 C는 불활성 전구체인 응혈 인자 V와 VIII를 최소한으로만 분해한다. 개에 있어서 활성화 단백질 C는 주요 생리학적 피브린용해 효소인 조직 플라스미노겐 활성화인자 (tPA)의 순환혈 수준을 급격하게 증가시키는 것으로 나타났다. 시험관 내에서 활성화 단백질 C는 사람 전혈의 피브린 용해를 증진시키는 것으로 나타났다. 따라서, 활성화 단백질 C는 사람에 있어서 생체내 피브린용해에 중요한 보조물이다.

현재, 혈전성 뇌졸중을 포함한 혈관 폐색증에 이용가능한 몇가지 유효한 치료법이 있다. tPA를 사용한 치료법은 뇌졸중 발작후 수시간 이내에 투여하는 것으로서 최근 FDA의 승인을 받았다. 헤파린 또는 경구 항응혈제를 사용하는 뇌졸중 치료법은 때때로 유익하기는 하지만, 경색이 일어난 뇌 영역에 출혈을 일으킬 위험이 크다.

비비(baboon) 모델에서 혈전성 폐색증 또는 혈전색전증의 치료에 재조합 aPC (r-aPC)를 사용하는 것이 그리핀(Griffin) 등의 미국 특허 제5,084,274호에서 제안되었다. 그리핀은 혈전성 폐색증의 치료를 위해 0.2 ㎎/㎏/시 내지 1.1 ㎎/㎏/시 범위의 투여량 수준을 청구하였다. 그러나, 본 출원인들은 이러한 투여량 수준이 r-aPC의 독성학적 수준보다 상당히 더 높은 범위에 있음을 발견하게 되었다. 예를 들면, 사람을 제외한 영장류의 전임상 독성 연구는 96시간 주입에 대한 r-aPC의 안전역이 약 0.05 ㎎/㎏/시의 최고 투여량으로 제한되는 것을 나타낸다. 따라서, 그리핀 등에 의해 교시된 최저 투여량 수준 (즉, 0.2 ㎎/㎏/시)은 사람에 대하여 본 출원인들이 확립한 중독량보다 4배 더 많은 수준이다. 따라서, 그리핀에 의해 교시된 최저 투여량 수준에서조차 경색이 일어난 뇌 영역에 출혈을 일으킬 위험이 커서, 뇌졸중에 수반되는 신경 손실을 더욱 악화시킨다. 따라서, 그리핀 등의 교시내용을 고려하더라도, aPC를 사용한 사람의 동맥 혈전 형성에 대한 유효한 치료법을 확인할 필요가 남아있다.

선행 연구자의 교시내용과는 대조적으로, 본 출원인들은 적은 투여량의 r-aPC를 사용한 치료법도 혈전성 뇌졸중의 치료에 유용함을 발견하기에 이르렀다. aPC의 투여는 또한 미소혈관 및 거대혈관 폐색성 동맥 혈전의 국소적인 확장을 방지함으로써 뇌졸중으로 인한 신경 손실을 감소시키는데 있어서 유익하다.

〈발명의 개요〉

본 발명은 혈관 폐색성 및 동맥 혈전색전성 질환의 사람 환자에게 약 0.01 ㎎/㎏/시 내지 약 0.05 ㎎/㎏/시의 투여량의 활성화 단백질 C를 투여하는 것을 포함하는, 혈관 폐색성 및 동맥 혈전색전성 질환의 사람 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 약 0.01 ㎎/㎏/시 내지 약 0.05 ㎎/㎏/시의 투여량으로 투여하기에 적합한 약 5 ㎎ 내지 약 20 ㎎의 활성화 단백질 C를 함유하는 단위 투여량 수용기를 포함하는, 연속 주입에 의해 투여하기에 적합한 단위 투여형을 제공한다.

본 발명은 의학 분야, 구체적으로 활성화 단백질 C를 사용한 혈관 질환의 치료에 관한 것이다.

본원에 기술하고 청구하는 본 발명의 목적을 위해 사용한 용어들은 다음의 뜻을 갖는다.

aPC 또는 활성화 단백질 C는 재조합 또는 혈장 유래의 단백질 C를 나타낸다. aPC는 사람 단백질 C를 포함하고 바람직하게는 사람 단백질 C이지만, aPC는 또한 단백질 C의 단백 분해 활성, 아미드분해 활성, 에스테르 분해 활성 및 생물학적 (항응혈 또는 프로-피브린용해) 활성을 갖는 다른 종류 또는 유도체를 포함할 수 있다. 단백질 C 유도체의 예는 게르리츠(Gerlitz) 등의 미국 특허 제5,453,373호 및 포스터(Foster) 등의 미국 특허 제5,516,650호에 기재되어 있고, 이들의 전체 교시내용을 본원에 참고로 인용하였다.

APTT - 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간.

AU - 아미드분해 유닛(unit).

HPC - 사람 단백질 C 자이모겐.

MEA - 2-아미노에탄올.

tPA - 조직 플라스미노겐 활성화인자.

r-HPC - 재조합 사람 단백질 C 자이모겐.

r-aPC - 재조합 활성화 단백질 C: 이는 단백질 C 자이모겐을 시험관내 또는 생체내에서 활성화시키거나, 또는 원핵 세포, 진핵 세포 또는 형질전환 동물로부터 단백질 C의 활성형을 직접 분비시킴으로써, 예를 들면, 사람 신장 293 세포로부터 자이모겐으로서 분비시킨 다음, 당업계의 숙련자에게 공지되어 있고 얀(Yan)의 미국 특허 제4,981,952호와 코팅햄(Cottingham)의 국제 공개 제WO 97/20043호 (이들 문헌의 전체 교시내용을 본원에서 참고로 인용함)에서 증명된 기법으로 정제하고 활성화시킴으로써 제조함.

연속 주입 - 특정 기간 동안 용액을 혈관 내로 실질적으로 중단시키지 않으면서 계속 도입시킴.

볼러스(bolus) 주사 - 소정량의 약물(볼러스로 불림)을 약 120분 까지의 시간에 걸쳐 주사함.

투여에 적합한 - 바람직하게는 치료제로서 제공하기에 적당한, 동결건조된 aPC로부터 제조된 제제 또는 용액.

자이모겐 - 단백 분해 효소의 효소적 불활성인 전구체. 본원에 사용되는 바와 같이, 단백질 C 자이모겐은 1쇄 또는 2쇄의 단백질 C의 분비된 불활성 형을 나타낸다.

본 출원인들은, 사람을 제외한 영장류의 전임상 독성 연구에서 96시간 동안의 주입에 대해 r-aPC의 안전역이 약 0.05 ㎎/㎏/시의 최대 투여량으로 제한되는 것으로 나타나는 것을 발견하게 되었다. 이들 데이타는 선행 기술에 비교할 때 예기치 않은 것이다. 실제로, 선행하는 전임상 및 임상 연구에 기초한 사람에 대한 r-aPC의 투여량 수준은 상기한 독성학적 연구에서 확립된 독성 범위를 초과한다.

본 발명은 혈관 폐색성 및 동맥 혈전색전성 질환의 사람 환자에게 약 0.01 ㎎/㎏/시 내지 약 0.05 ㎎/㎏/시의 투여량의 활성화 단백질 C를 투여하는 것을 포함하는, 혈관 폐색성 및 동맥 혈전색전성 질환의 사람 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 활성화 단백질 C를 저투여량 수준으로 투여하면 고투여량 수준과 관련될 수도 있는 수반되는 출혈 문제 없이 혈전성 뇌졸중의 치료에 유용하다. 본 발명은 또한 사람에 대한 임상 시험에서 재조합 사람 단백질 C (r-aPC)를 사용하여 r-aPC의 혈장 농도를 측정하는 것을 설명하였다 (실시예 1).

본 발명은 또한 폐색성 관상 동맥 혈전증의 개 모델에서 완전 폐색된 관상 동맥의 재관류에 대한 r-aPC의 정맥내 투여의 효과를 증명하였다 (실시예 2). 놀랍게도, r-aPC로 치료한 6 마리의 동물 중 5 마리의 동물에서 혈관 재관류가 나타났으며, 이에 비해 6 마리의 대조 동물 중에서는 어느 동물에서도 혈관 재관류가 나타나지 않았다.

본 발명은 혈전성 뇌졸중, 말초 동맥 혈전증, 심장 또는 말초 동맥에서 기원한 색전, 급성 심근 경색증 및 관상 동맥 질병을 포함하는 혈관 폐색성 또는 동맥 혈전색전성 질환에 대한 활성화 단백질 C를 사용한 치료 방법에 관한 것이다.

aPC를 공지 방법에 따라 제제화하여 제약학적으로 유용한 조성물을 제조할 수 있다. aPC는 바람직하게는 혈류 내에 그를 유효한 형태로 전달하기 위해, 약 1 내지 약 48시간 동안 연속 주입으로서 적절한 투여량을 주사함으로써 비경구 투여한다. 더 바람직하게는, 적절한 투여량의 aPC를 약 4 내지 약 36시간 동안 연속 주입에 의해 투여할 것이다. 더욱 더 바람직하게는, 적절한 투여량의 aPC를 약 12 내지 약 24시간 동안 연속 주입에 의해 투여할 것이다. 가장 바람직하게는, 적절한 투여량의 aPC를 약 24시간 동안 연속 주입에 의해 투여할 것이다. aPC 투여는 뇌졸중의 진단 이후 가능한 한 빨리 시작할 것이다.

투여되는 aPC의 양은 약 0.01 ㎎/㎏/시 내지 약 0.05 ㎎/㎏/시이며, 이는 약 20 ㎎/70 ㎏/24시 내지 약 84 ㎎/70 ㎏/24시의 양에 상당한다. 투여량 수준을 24시간당 특정양으로서 나타냈지만, 당업계의 숙련인은 이러한 투여량 수준이 투여량 수준에 대한 지시이며, 반드시 24시간 주입에만 제한되는 것이 아니라 다양한 시간 동안, 예를 들면, 약 1시간 내지 약 48시간 동안의 연속 주입을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 더 바람직하게는, 투여되는 aPC의 양은 약 0.01 ㎎/㎏/시 내지 약 0.04 ㎎/㎏/시 (약 20 ㎎/70 ㎏/24시 내지 약 67 ㎎/70 ㎏/24시)이다. 보다 더 바람직하게는, 투여되는 aPC의 양은 약 0.01 ㎎/㎏/시 내지 약 0.03 ㎎/㎏/시 (약 20 ㎎/70 ㎏/24시 내지 약 50 ㎎/70 ㎏/24시)일 것이다. 가장 바람직한 aPC의 투여량은 약 0.024 ㎎/㎏/시 (약 40 ㎎/70 ㎏/24시)이다.

별법으로, aPC를 시간당 적절한 투여량의 일부를 약 5분 내지 약 30분에 걸쳐 볼러스 주사로서 주사한 후, 약 23시간 내지 약 47시간 동안 적절한 투여량을 연속 주입함으로써 투여하여, 적절한 투여량이 24시간 내지 48시간에 걸쳐 투여되도록 할 것이다.

앞서 논의한 바와 같이, 상기 제시된 aPC의 투여량 수준은 그리핀 등에 의해 제시된 투여량 수준과 대조적이다. 그리핀은 혈전성 폐색증의 치료에 대해 0.2 ㎎/㎏/시 내지 1.1 ㎎/㎏/시 범위의 투여량 수준을 청구하였다. 이와 대조적으로, 본 발명에서 청구한 투여량 수준은 상기 투여량의 1/10에 상당하며, 약 0.01 ㎎/㎏/시 내지 약 0.05 ㎎/㎏/시의 범위이다. 본원에 기재한 바와 같이 혈전성 폐색증에 대해 투여되는 aPC의 가장 바람직한 투여량 수준은 약 0.024 ㎎/㎏/시일 것이다. 본원에서 나타낸 바와 같이 0.024 ㎎/㎏/시의 가장 바람직한 투여량 수준이 그리핀 등에 의해 청구된 최저 투여량 수준보다 8배 적고, 그리핀에 의해 청구된 최고 투여량 수준보다 44배 적다는 것을 주목하는 것이 중요하다.

제조예 1

사람 단백질 C의 제조

그의 교시내용 전체를 본원에 참고로 인용한 얀의 미국 특허 제4,981,952호에 기술된 바와 같은, 당업계의 숙련인에게 공지된 기법으로 사람 신장 293 세포에서 재조합 사람 단백질 C (rHPC)를 생산하였다. 사람 단백질 C를 암호화하는 유전자는 그의 교시내용 전체를 본원에 참고로 인용한 뱅(Bang) 등의 미국 특허 제4,775,624호에서 개시되고 청구되었다. 293 세포에서 사람 단백질 C를 발현시키기 위해 사용되는 플라스미드는 그의 교시내용 전체를 본원에 참고로 인용한 뱅 등의 미국 특허 제4,992,373호에서 개시된 플라스미드 pLPC이었다. 플라스미드 pLPC의 구조는 또한 그들의 교시내용을 본원에 참고로 인용한 유럽 특허 공개 제0 445 939호와 문헌[그린넬(Grinnell) 등, 1987, Bio/Technology 5:1189-1192]에 개시되어 있다. 간략하게, 플라스미드를 293 세포에 형질감염시킨 다음, 안정한 형질감염체를 확인하여 2차 배양하고, 무혈청 배지에서 배양하였다. 배양한 후, 미세여과에 의해 무세포 배지를 얻었다.

사람 단백질 C를 그의 교시내용 전체를 본원에 참고로 인용한 얀의 미국 특허 제4,981,952호를 변경하여 배양액에서 분리하였다. 세정한 배지를 EDTA 중에 4 mM로 만든 후 음이온 교환 수지(Fast-Flow Q, 파마시아(Pharmacia))에 흡착시켰다. 4 칼럼 부피의 20 mM 트리스, 200 mM NaCl, pH 7.4 및 2 칼럼 부피의 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 7.4로 세척한 후, 결합된 재조합 사람 단백질 C 자이모겐을 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7.4로 용출시켰다. 용출된 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정할 때 용출 후 95% 이상 순수하였다.

단백질을 NaCl 중에 3 M로 만든 후 20 mM 트리스, 3 M NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7.4에 평형화시킨 소수성 상호작용 수지(Toyopearl Phenyl 650M, 도소하스 (TosoHaas))에 흡착시켜 단백질을 더욱 정제하였다. 2 칼럼 부피의 CaCl₂가 없는 평형 완충액으로 세척한 후, 재조합 사람 단백질 C를 20 mM 트리스, pH 7.4로 용출시켰다.

용출된 단백질을 잔류 칼슘을 제거함으로써 활성화를 위해 준비하였다. 재조합 사람 단백질 C를 금속 친화성 칼럼(Chelex-100, 바이오-라드(Bio-Rad)) 상으로 통과시켜 칼슘을 제거하고, 다시 음이온 교환 수지(Fast Flow Q, 파마시아)에 결합시켰다. 이들 두 칼럼은 일렬로 배열시켰고, 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 6.5에 평형화시켰다. 단백질을 로딩한 후, Chelex-100 칼럼을 1 칼럼 부피의 동일 완충액으로 세척한 후 열에서 분리시켰다. 음이온 교환 칼럼을 3 칼럼 부피의 평형 완충액으로 세척한 후, 단백질을 0.4 M NaCl, 20 mM 트리스-아세테이트, pH 6.5로 용출시켰다. 재조합 사람 단백질 C 및 재조합 활성화 단백질 C 용액의 단백질 농도를 UV 280 ㎚ 흡광에서 측정하였고, 흡광도 E^0.1%는 각각 1.85 및 1.95였다.

제조예 2

재조합 사람 단백질 C의 활성화

소 트롬빈을 4℃에서 50 mM HEPES, pH 7.5의 존재하에 활성화 CH-세파로즈 4B (파마시아)에 커플링시켰다. 커플링 반응은 약 5000 유닛 트롬빈/㎖ 수지를 사용하여 칼럼에 미리 충전시킨 수지 상에서 수행하였다. 트롬빈 용액을 칼럼을 통하여 약 3시간 동안 순환시킨 후, MEA를 0.6 ㎖/ℓ(순환 용액)의 농도로 첨가하였다. MEA 함유 용액을 추가로 10-12 시간 동안 순환시켜 수지 상의 비반응된 아민을 완전히 차단시켰다. 차단시킨 후, 트롬빈 결합된 수지를 10 칼럼 부피의 1 M NaCl, 20 mM 트리스, pH 6.5로 세척하여 비특이적으로 결합된 모든 단백질을 제거하고, 활성화 완충액에 평형화시킨 후 활성화 반응에서 사용하였다.

정제 rHPC를 EDTA 중에 5 mM로 만들고 (임의의 잔류 칼슘을 킬레이팅시키기 위해), 20 mM 트리스, pH 7.4 또는 20 mM 트리스-아세테이트, pH 6.5로 2 ㎎/㎖의 농도로 희석시켰다. 이 물질을 37℃에서 50 mM NaCl 및 20 mM 트리스 pH 7.4 또는 20 mM 트리스-아세테이트 pH 6.5로 평형화시킨 트롬빈 칼럼을 통해 통과시켰다. 유속은 rHPC와 트롬빈 수지의 접촉 시간이 약 20분이 되도록 조정하였다. 유출물을 모아 즉시 아미드분해 활성에 대해 분석하였다. 이 물질이 aPC의 확립된 표준품에 상당하는 특이 활성(아미드분해 활성)을 갖지 않으면, 이를 트롬빈 칼럼 상으로 재순환시켜 rHPC를 완전히 활성화시켰다. 이후, 이 물질을 pH 7.4 내지 6.0의 임의의 pH (자동 분해를 방지하기 위해 보다 낮은 pH가 바람직함)의 상기한 20 mM 완충액으로 1:1 희석시켜 aPC를 보다 저농도로 유지시키고, 다음 처리 단계에 사용하였다.

aPC를 150 mM NaCl를 갖는 활성화 완충액 (20 mM 트리스, pH 7.4 또는 바람직하게는 20 mM 트리스-아세테이트, pH 6.5)에 평형화시킨 음이온 교환 수지 (Fast Flow Q, 파마시아)에 결합시킴으로써 aPC 물질로부터 누출되는 트롬빈을 제거하였다. 트롬빈은 칼럼을 통해 통과하여 20 mM 평형 완충액으로 2-6 칼럼 부피로 세척하는 중에 용출된다. 결합된 aPC를 5 mM 트리스-아세테이트, pH 6.5 또는 20 mM 트리스, pH 7.4 중 0.4 M NaCl를 사용하여 단계 구배액으로 용출시켰다. 칼럼을 보다 많은 부피의 세척액으로 세척하면 도데카펩티드가 보다 완전히 제거된다. 이 칼럼에서 용출된 물질을 동결 용액(-20℃) 중에 보관하거나 동결건조 분말로서 보관하였다.

aPC의 아미드분해 활성(AU)은 벡크만(Beckman DU-7400) 다이오드 배열 분광광도계를 사용하여 카비 비트룸(Kabi Vitrum)에서 구입한 합성 기질 H-D-Phe-Pip-Arg-p-니트로아닐리드(S-2238)로부터 p-니트로아닐린을 방출시킴으로써 측정하였다. 활성화 단백질 C 1 유닛은 9620 M^-1㎝^-1의 405 ㎚에서의 p-니트로아닐린에 대한 흡광 계수를 사용하여, 25℃, pH 7.4에서 1분 내에 1 μmol의 p-니트로아닐린을 방출시키기 위해 필요한 효소의 양으로서 정의하였다.

활성화 단백질 C의 항응혈 활성은 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT) 응고 분석에서 응고 시간의 연장을 측정함으로써 결정하였다. 125-1000 ng/㎖의 단백질 C 농도 범위에 대해 희석 완충액(1 ㎎/㎖ 방사선면역분석 등급 BSA, 20 mM 트리스, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.02% NaN₃) 중에서 표준 커브를 제작하고, 이 동안 샘플을 수회 희석하여 상기 농도 범위로 제조하였다. 각각의 샘플 큐벳에 50 ㎕의 냉각 말 혈장과 50 ㎕의 재구성 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 시약 (APTT 시약, 시그마(Sigma))을 첨가하여 37℃에서 5분간 배양하였다. 배양한 후, 50 ㎕의 적절한 샘플 또는 표준품을 각각의 큐벳에 첨가하였다. 샘플 또는 표준품 대신 희석 완충액을 사용하여 기초 응고 시간을 결정하였다. 각각의 샘플 또는 표준품에 50 ㎕의 37℃ 30 mM CaCl₂를 첨가할 때 피브로미터 (fibrometer; CoA Screener Hemostatis Analyzer, 아메리칸 레이버(American Labor))의 타이머를 재기 시작하였다. 표준 커브의 선회귀식으로부터 샘플 중 활성화 단백질 C 농도를 계산하였다. 표준 커브 샘플을 포함하여 본원에 기록한 응고 시간은 최소한 3회 반복 시험의 평균이다.

당업계의 숙련인은 상기 상세한 내용으로부터 혈전성 뇌졸중의 치료에 사용하기 위한 aPC를 제조할 수 있을 것이다.

실시예 1

aPC의 사람 혈장 수준

6명의 사람 환자에게 1 ㎎/㎡/시 또는 약 0.024 ㎎/㎏/시의 aPC를 24시간에 걸쳐 동맥내 주입하였다. 투여되는 aPC는 물 2 ㎖에 재구성시키고 pH 6.5로 조정한, 10 ㎎ aPC, 5 mM 트리스 아세테이트 완충액 및 100 mM 염화나트륨을 함유하는 동결건조 제제였다.

aPC의 혈장 농도를 면역포획-아미드분해 분석을 이용하여 측정하였다. 혈액을 시트르산염 항응혈제와 aPC의 가역적 억제제인 벤즈아미딘의 존재 하에 수집하였다. 미세적정판 상에 고정시킨 aPC 특이적 쥐 모노클론 항체, C3에 의해 혈장으로부터 효소를 포획하였다. 억제제를 세척하여 제거하고, aPC의 아미드분해 활성을 올리고펩티드 색원체 기질을 사용하여 측정하였다. 37℃에서 16-20시간 동안 배양한 후, 405 ㎚에서 흡광도를 측정하고, 데이타를 칭량된 선형 곡선-피팅 알고리듬 (weighted linear curve-fitting algorithm)으로 분석하였다. aPC 농도를 0-100 ng/㎖의 농도 범위에서 표준 곡선으로부터 평가하였다. 분석의 정량 한계는 1.0 ng/㎖이었다. aPC 투여량 수준과 혈장 농도를 약 24시간에서 측정하였다. 혈장 범위는 2 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖ 이하이다. 바람직한 혈장 범위는 약 20 ng/㎖ 내지 80 ng/㎖이다. 가장 바람직한 혈장 범위는 약 30 ng/㎖ 내지 약 60 ng/㎖이고, 더욱 더 바람직하게는 약 50 ng/㎖이다. 따라서, 0.024 ㎎/㎏/시의 투여량은 보다 고투여량 수준에서 수반되는 출혈 문제 없이 혈전성 뇌졸중을 치료하기 위해 24시간에서 50 ng/㎖의 가장 바람직한 혈장 농도를 생성한다.

실시예 2

폐색성 관상 동맥 혈전증의 개 모델에서 유도된 재관류

12 마리의 개 (17-22 ㎏, 자웅 모두, 버틀러 팜즈(Butler Farms))를 소듐 펜토바르비탈(30 ㎎/㎏, 정맥내)로 마취시키고 실내 공기로 환기시켰다. 혈압 측정, 약물 투여 및 채혈을 위해 각각 경동맥, 대퇴 정맥 및 경정맥에 캐눌라를 설치하였다. 좌측 개흉술을 수행하고, 심장을 심막 크래들(cradle)에 현수시키고 좌측 굴절 관상 동맥(LCCA)의 2 ㎝ 절편을 제1 대각선 분지점에 인접하게 단리시켰다. LCCA에 관상 동맥 혈류를 측정하기 위한 전자기적 혈류 탐침, 혈관 손상을 일으키기 위한 자극 전극 및 중대한 협착을 일으키기 위한 외부 폐색기를 각각 장치하였다. 혈관의 내막측에 자극 전극(양극)을 접촉시켜 놓고 양극을 100 ㎂ d.c. 전류로 자극함으로써 혈관 손상을 일으켰다 (회로는 음극을 피하에 놓음으로써 완성하였다). 손상 전류를 60분 동안 유지시킨 다음 혈관이 폐색되거나 폐색되지 않거나에 무관하게 중단시켰다. 혈관 손상 시작부터 약 60분에 혈관은 완전히 폐색되었다. 혈관이 완전히 폐색된지 30분 후(30분 동안 0의 관상 동맥 혈류로서 확정함), 2.0 ㎎/㎏/시의 aPC 또는 20 ㎖의 트리스 완충액, pH 7.4 (비히클 군)의 연속 정맥내 주입액을 2시간 동안 주입하였다. 제제들을 LCCA 손상 시작점부터 시작하여 4시간 동안 추적조사하였다. 동맥압, 심박수 및 관상 동맥 혈류를 얻고 분석하였다. 실험 전기간 동안 상이한 시점에 혈액 샘플을 채취하여 전혈 응고 시간을 측정하고 (Hemochron 801), 잇몸 주형 출혈 시간을 Simplate II 출혈 시간 장치를 사용하여 측정하였다. 제2 세트의 혈액 샘플(시트르산 처리)을 실험 전기간 동안 수집하여 혈장 플라스미노겐 활성화인자 억제제-1 (PAI-1)을 측정하였다. 혈장 PAI-1 수준을 IMUBIND^TM혈장 PAI-1 ELISA 킷트 (아메리칸 다이아그노스티카(American Diagnostica))를 사용하여 측정하였다. 모든 데이타 (평균±SEM으로 기록됨)를 단일 ANOVA를 이용하여 통계학적 차이에 대해 분석한 후 p〈.05 수준에서 유의성에 대해 스튜던트-노이만-코일스(Student-Neuman-Keuls) 분석하였다. 재관류의 발생과 개방성을 피셔(Fisher's) 정밀 시험을 이용하여 p〈.05 수준에서 분석하였다.

2.0 ㎎/㎏/시의 aPC를 연속 주입하면 2시간 동안의 약물 주입 끝에 APTT 전혈 응고 시간이 6배 증가하였다 (표 1). APTT는 실험 종료시 정상 값으로 회복되기 시작하였다. 트롬빈 응고 시간 또는 주형 출혈 시간에 대해 관찰가능한 영향은 없었다. 결과를 하기 표 1에 나타냈다.

마취시킨 개에서 응혈 및 주형 출혈 시간에 대한 aPC의 영향

처리	파라미터	약물 투여전	60분 주입	120분 주입	종료
비히클^a(n=6)	트롬빈 시간 (초)	36±1	38±4	33±1	34±1
	APTT (초)	100±6	95±5	89±10	91±10
	주형 출혈 시간 (초)	132±15	182±14	152±15	159±13
	트롬빈 시간 (초)	33±1	34±1	34±1	34±1
	APTT (초)	96±6	573±237	670±209^*	138±13^*
	주형 출혈 시간 (초)	199±41	272±84	204±20	193±39
비히클 군에 대해 사용된 투여 방식은 20 ㎖의 트리스-완충 염수를 2시간 주입하는 것이고, aPC (2.0 ㎎/㎏/시×2시간)는 혈관이 완전히 폐색된지 30분 후에 투여하기 시작한다.
^*비히클 군에 대한 p〈.05 수준에서 통계학적 차이를 나타냄. 각각의 값은 평균±SEM을 나타냄

하기 표 2는 완전히 폐색된 관상 동맥의 재관류에 대한 aPC의 정맥내 투여의 효과를 예시한다. 관상 동맥의 완전한 혈전성 폐색에 대한 시간은 2군에서 유사하여; 비히클 처리군에서는 66±7분이었고 aPC 처리군에서는 62±6분이었다. aPC 처리군에서는 6개의 혈관 중 5개가 재관류를 나타냈고, 이에 비해 비히클 처리군에서는 6개의 혈관 중 어느 것도 재관류를 나타내지 않았고; aPC 처리군에서 재관류에 대한 시간은 128±17분이었다. aPC 처리군에서 관상 동맥 혈류는 대응하는 비히클 처리군보다 유의하게 더 컸고; aPC 처리군은 재관류 기간 중에 13.7±2.7 ㎖/분의 유속과 1069±623 ㎖의 혈류 부피에 도달하였다 (이는 이 군에서 혈전생성전 관상 동맥 혈류의 약 60-70%가 회복된 것을 나타낸다). aPC에 노출시킨 5개의 혈관 중 3개의 혈관이 4시간의 실험의 종료시에도 여전히 개방되어 있었다. 따라서, 이들 데이타는 aPC가 개 모델에서 폐색성 관상 동맥 혈전증의 치료에 유효하다는 것을 증명한다.

개의 관상 동맥 혈전증 모델에서 관상 동맥 혈류의 회복에 대한 aPC의 영향

파라미터	비히클(n=6)	aPC(n=6)
페색 시간 (분)	66±7	62±6
혈전 질량 (㎎)	10.8±2.1	8.2±1.2
재관류 발생	0	6개 중 5개^*
재관류 시간 (분)	0	128±17^*
실험 종료시 혈관 개방성	6개 중 0개	5개 중 3개
재관류 동안 CBF (㎖/분)	0	13.7±2.7^*
재관류 부피 (㎖)	0	1069±623
^*비히클 군에 대한 p〈.05 수준에서 통계학적 차이를 나타냄. 각각의 값은 평균±SEM을 나타냄

각각의 실험 전체에서 채취한 혈액 샘플은 aPC의 정맥내 주입과 플라스미노겐 활성화인자 억제제-1 (PAI-1)의 순환혈 수준 사이에 유의한 상관관계가 있음을 증명한다. aPC의 정맥내 주입 종료시에 혈장 PAI-1 수준은 80% 감소하였다. aPC의 주입을 중단하면 혈장 PAI-1 수준은 주입전 수준으로 회복하기 시작하였다.

이들 개 모델에서의 상기 투여량 수준이 사람에 대해 청구한 투여량 수준보다 높기는 하지만, 본 출원인은 개가 사람 활성화 단백질 C에 대해 특히 둔감하므로, 사람에 대해 청구한 투여량 수준이 적절한 것임을 알게 되었다.

Claims

혈관 폐색성 및 동맥 혈전색전성 질환의 사람 환자에게 활성화 단백질 C를 약 0.01 ㎎/㎏/시 내지 약 0.05 ㎎/㎏/시의 투여량으로 투여하는 것을 포함하는, 혈관 폐색성 및 동맥 혈전색전성 질환의 사람 환자의 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 혈관 폐색성 또는 혈전색전성 질환이 혈전성 뇌졸중인 방법.
제2항에 있어서, 상기 환자에게 활성화 단백질 C를 약 0.01 ㎎/㎏/시 내지 약 0.03 ㎎/㎏/시의 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 환자에게 활성화 단백질 C를 약 0.024 ㎎/㎏/시의 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 활성화 단백질 C가 사람 활성화 단백질 C인 방법.
제1항에 있어서, 상기 활성화 단백질 C를 약 1시간 내지 약 48시간 동안 연속 주입하여 투여하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 활성화 단백질 C를 약 12시간 내지 약 36시간 동안 연속 주입하여 투여하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 활성화 단백질 C를 약 24시간 동안 연속 주입하여 투여하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 활성화 단백질 C가 사람 활성화 단백질 C인 방법.
제9항에 있어서, 활성화 단백질 C를 약 0.024 ㎎/㎏/시의 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 활성화 단백질 C를 볼러스(bolus) 주사로 투여하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 활성화 단백질 C을 볼러스 주사한 후 연속 주입하는 방법.
5 내지 20 ㎎의 활성화 단백질 C를 함유하는 단위 투여 용기(receptacle).
제13항에 있어서, 상기 활성화 단백질 C가 동결건조된 것인 용기.
제13항에 있어서, 상기 활성화 단백질 C가 멸균 용액에 0.01 ㎎/㎏/시 내지 0.05 ㎎/㎏/시의 투여량으로 투여하기에 적합하게 용해된 것인 용기.
제13항에 있어서, 약 1 내지 약 48시간 동안 연속 주입에 의해 투여하는 단위 투여 용기.
약 0.01 ㎎/㎏/시 내지 약 0.05 ㎎/㎏/시의 투여량으로 혈관 폐색성 및 동맥 혈전색전성 질환 치료용 의약으로서 사용하기 위한 활성화 단백질 C.