RU1838411C - Способ получени рекомбинантной плазмидной ДНК и способ получени зимогенной формы белка С человека - Google Patents

Abstract

Использование: получение новых форм бе/.ка С человека. Сущность изобретени : разработан способ получени  зимогенноп формы белка С путем конструировани  ре- комбинантной плазмидной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность со свойствами зимогенной формы белка С. Указанные формы белка отличаютс  от на- тивного белка С более высокими амидолити- ческой и функциональной активност ми, и имеют новые углеводородные структуры, В изобретении раскрываютс  также ДНК-соединени , векторы и трансформанты. 2 с.п.ф- лы, 7 ил., 6 табл,

Description

Изобретение относитс  к новым ДНК- соединени м и векторам клонировани  ре- комбинантных ДНК, кодирующих новые зимогенные формы белка С человека. Эти зимогены сконструированы таким образом, что типы гликосилировани   вл ютс  совершенно иными по сравнению с зимогеном человеческого белка С дикого типа.Гликоси- лированйе, в частности, если углеводородные части содержат высокие уровни сиаловой кислоты, может играть важную роль в секреции белка и его функции. Новые зимогены изобретени  конструируют таким образом, что каждую из областей гликосилировани  измен ют отдельно. Векторы экспрессии позвол ют получить простой и эффективный способ экспрессии указанных зимогенных форм белка С человека в реком- бинантных хоз йских клетках. Изобретение позвол ет получить способ продуцировани 

зимогенных форм белка С, которые при активации обладают более высокой амидоли- тической и антикоа гулирующей активностью, чем нативна  форма белка С. Новые формы зимогеиов человеческого белка С отличаютс  от известных зимогенных форм аминокислотным последовательност ми различных областей гликосилировани . Эти новые зимогенные формы белка С обладают определенными преимуществами при лечении заболеваний крови, в частности , нарушений коагул ции.

Белок С, витамин К-зависимый белок плазмы имеет большое физиологическое значение дл  регулировани  гемостаза. Белок С синтезируетс  в виде неактивных молекул , называемых далее ранним белком С. Как будет подробно описано ниже, этот ранний белок подвергаетс  сложному процес- сингу, что приводит к образованию

шьт 

СО

45ь

ий

СО

различных неактивных молекул. Неактивные секретируемые формы белка С именуютс  о насто щем описании зимогенным белком С. Активаци  белка С происходит в крови путем реакции с комплексом тромбодулинт- ромбин. Активированный белок С вместе с его кофактором белком S  вл етс  антикоагул нтом , обладающим высокой физиологической активностью. Активированный белок С способствует предупреждению возникновени  интерваскул рного тромбоза и распространению образовавшихс  тромбов. Механизм действи  активированной формы белка С и механизм активации неактивного зимогена в активную протеазу подробно описан в нескольких работах последних лет. В активации белка С участвует тромбин, конечна  форма сериновой протеазы в каскаде коагул ции, и гликопротеин, ассоциированный с мембраной эндотелиальной клетки, и называемый тромбомодулином. Тромбомодулин образует тесный стехио- метрический комплекс с тромбином. Св зыва сь с тромбином, тромбомодулин резко измен ет функциональные свойства тромбина . Тромбин свертывает фибриноген, активирует тромбоциты и превращает кофакторы свертывани  крови V и VIII в их активные формы, Va и Villa. И наконец, тромбин активирует белок С, однако, этот процесс протекает очень медленно и неэффективно , и кроме того, активаци  ингиби- руетс  физиологическим Са +. Напротив, тромбин п комплексе с тромбомодулином не свертывает фибриноген, не активирует тромбоциты и не превращает кофакторы свертывани  Vn VII в их активные двойники Va и Villa, а становитс  эффективным акти- патором зимогенпого белка С в присутствии физиологического Са. Константа скорости активации зимогеиа белка С с помощью комплекса тромбомодулин-тромбин з 1000 раз превышает константу скорости процесса с участием лишь одного тромбина.

Длп более  сного представлени  регулирующей функции активированного белка С в свертывании, крови ниже приводитс  описание ферментативной системы коагул ции . Указанную систему коагул ции можно рассматривать как цепную реакцию с последующей активацией зимогена в активные сериновые протеазы. В итоге указанна  цепна  реакци  продуцирует фермент тромбин , который посредством ограниченного протеолиза превращает фибриноген плазмы в нерастворимый гелеобрззный фибрин. Ключевыми стади ми в каскаде коагул ции  вл ютс  превращение фактора саертыва- ни  крови X и Ха с помощью фактора свертывани  1Ха и превращение протромбина в

тромбин с помощью фактора свертывани  Ха. Обе указанные реакции происход т на поверхност х клеток, преимущественно на поверхности тромбоцитов, и дл  их осуществлени  необходимо присутствие кофакторов . Основные кофакторы, фэкторы V и VIII циркулируют в системе виде относительно неактивных предшественников, однако образование первых нескольких молекул

тромбина приводит к укреплению тромби- новых петель и активации кофакторов посредством ограниченного протеолиза. Активированные кофакторы Va и Villa ускор ют обе конверсии протромбина в тромбин

и факторы X в фактор Ха приблизительно на п ть пор дков величины. Актип /фованный белок С предпочтительно действует на кофакторы свертывани  Va и Villa, т.е. активированные формы неактивных факторов V и

VIII путем протеолитической деградации, гидрослива и необратимого расщеплени . Напротив факторы свертывани  V и VIII  вл ютс  плохими субстратами дл  активированного белка С.

Ценным кофактором дл  активированного белка С  вл етс  белок В, другой витамин К-зависимый белок плазмы. Белок S в основном в 25 раз ускор ет гидролиз факторов Va и Villa, опосредованный активированным белком С,

Белок С известен специалистам как- ценное терапевтическое средство. Активированный белок С  вл етс  нопым антитромбином с более широким

терапевтическим индексом по сравнению со стандартными антикоагул нтами такими, как гепарин, или антикоагул нтами типа гидроксикумарина дл  перорэльного введени . Ни зимогенный белок С, ни активированный белок С не  вл ютс  эффективными до тех пор, пока не будет образовыватьс  тромбин, поскольку его присутствие  вл етс  необходимым дл  превращени  свертывани  V в Va и VIII в Villa, активированные

формы этих двух кофакторов  вл ютс  предпочтительным субстратом дл  активированного белка С. Дл  активации зимогешюго белка С также требуетс  тромбин, при этом в отсутствии комплекса тромбомодулинтромбин превращение зимогена белка С в его активную форму протекает очень неэффективно .

Активированный белок С  вл етс  пред- почтительным актикоагул нтом, поскольку он действует посредством инактивации кофакторов Va и Villa. Так как дл  превращени  факторов V и VIM в их активные формы Va и Villa требуетс  тромбин, то белок С действует в качестве антикоагул нта л .пиь

после образовани  тромбина, В противоположность указанному активированному белку С, стандартные антикоагул нты сохран ют свое антикоагулирующее действие . ;в системе кровообращени  о течение всего 5. периода введени  их пациенту, что значительно увеличивает риск осложнени  в виде кровотечени . Поэтому активированный белок С  вл етс  предпочтительным антикоагул нтом широкого применени  и может 10 быть использован вместо гепарина и гидро- ксикумарина в качестве альтернативного средства.

При некоторых заболевани х, таких, как наследственный дефицит белка С, зимоген 15 белка С  вл етс  чрезвычайно ценным терал певтическим средством. Человек с врожденным гомозиготным дефицитом белка С обычно умирает в раннем детстве от молниеносной пурпуры, часто встречающейс  ле- 20 тальной формы диссеминированного внутрисосудистого свертывани . Человек с гетерозиготным дефицитом белка С обычно т жело страдает от рецидивирующих тром - 10 20 10

боэмболических осложнений. Клиниче было установлено, что концентраты бе плазмы, предназначенные дл  лечени  мофилей В или дефицита фактора IX и держащие в качестве примеси белок  вл ютс  эффективными дл  предупреж ни  и лечени  внутрисосудистого сверты ни  при гетерозиготном дефиците белк Было также установлено, что при тромбо ческих состо ни х, таких, как диссемиии ванное внутрисосуд стое свертывани при заболевани х, предрасполагающи тромбозу таких, как обширна  травма, ширное оперативное вмешательство, и уровн  белка С  вл ютс  крайне низким

Дл  лучшего понимани  механизма тивации белка С насто щего изобретен ниже представлена последовательно аминокислотных остатков дл  раннего б ка С человека. Указанна  аминокислот последовательность и ее соответствующ области в цел х насто щего изобрете также характеризует натишшй белок С ловека.

30 АО

5 -АТС TGG CAG СТС.АСЛ AGC СТО CTG СТО ТТС GTG GCC ACC TGG GGA ЛТТ H2N-MET TRP GLN LEU THR; SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY TIE ;. 5 10 15

боэмболических осложнений. Клинически было установлено, что концентраты белка плазмы, предназначенные дл  лечени  ге- мофилей В или дефицита фактора IX и содержащие в качестве примеси белок С,  вл ютс  эффективными дл  предупреждени  и лечени  внутрисосудистого свертыаа- ни  при гетерозиготном дефиците белкз С. Было также установлено, что при тромботи- ческих состо ни х, таких, как диссемиииро- ванное внутрисосуд стое свертывание, и при заболевани х, предрасполагающих к тромбозу таких, как обширна  травма, обширное оперативное вмешательство, и рак, уровн  белка С  вл ютс  крайне низкими.

Дл  лучшего понимани  механизма активации белка С насто щего изобретени , ниже представлена последовательность аминокислотных остатков дл  раннего белка С человека. Указанна  аминокислотна  последовательность и ее соответствующие) области в цел х насто щего изобретени  также характеризует натишшй белок С человека .

15

20

25

30

50 .. 6070 80 90

TCC .GGC АСА ССЛGCT CCTCTT GAG ТСЛ GTG TTC TCG AGC AGC GAG CGT

SER GLY THR PROALA PROLEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARC

.2025 30

100Д10120 130 140

GCC CAC CAG GTGCTG CGGАТС CGC MA CGT GCC AAC TCC TTC CTG GAG

ALA HIS GLN VALLEU ARG±LE ARG LYS ARC ALA ASN SER PHE LEU GLU

35. .40 45

150. 160 170 180 190

GAG CTC CGT CACAGC AGCCTG GAG CGG GAG TGC ATA GAG GAG АТС TGT

GLU.LEU ARG HISSER.SERШ1 GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILK CYS

50 ;.55 60

200 : 210 220 230 240

GAG TTC GAG GAGGCC AAGGAA-.ATT TTC CAA AAT GTG GAT GAG АСА CTG

ASP PHE GLU GLU ALA LYSGLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THE LEU

65

70

35

40

250 - 260 270 280

GCC TTC TGG TCC AAG CAC GTC GAG GGT GAG CAG TGC TTG GTC TTG CCC ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO 8590 . 95

290 300 310 320 - 330 TTG GAG CAC CCG TGC GCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC ACG.TGC АТС LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS 1LE 100105 110

75

JO

Х-7953А

340 . 350 360 370 380 GAC GGC АТС GGC AGO TTC AGC TGC GAC TGC-CGC AGC GGC TGG GAG GGC ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY

115 :120 125 : 5

390 400 410 420 430 CGC TTC TGC GAG CGC GAG GTG AGC TTC CTC AAT TGC TCG CTG GAC AAC ARG PHE CYS GLH ARG GLU VAL SER PHE LEU ASH CYS SER LEU ASP ASH

130135 -140 10 i ...... , .: ;-. ;; -.

i 440 450 460 . :470 480 GGC GGC TGC ACG CAT TAG TGC.СТА GAG GAG GTG GGC TGG CGG CGC TGT GLY GLY CYS TIIR HIS TYR CYS LEU. GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS 145 . 150 , . .155 . . . - - ... 160

.15 . . -., :: . . . .. ..---

490 . 500 ; - 510 . 520

AGC TGT GCG CCT GGC TAG AAG CTG GGG GAC GAC CTG CTG CAG TGT CAC SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS

: 165 . 170 175

20 : . . 530 540 550 . 560 570

CCC GCA GTG AAG TTC CCT TGT. GGG AGG CCC TGG AAG CGG ATG GAG AAG PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG flET GLU LYS

180185 . . 190 25 -..

580 590 600 610 620 AAG CGC ACT CAC CTG ЛАЛ CGA .GAC АСА GAA GAC CAA GAA GAC C.AA GTA LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP TOR GLU ASP СШ GLU ASP GLN VAL

195200 205 30

630 . 640 650 660 670 GAT CTC ATT GAT GGG-AAG ATG ACC AGG CGG GGA GAC AGC CCC ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET TIIR ARG ARG GLY ASP SER PRO

210215 220 35 :

680 ; 690 : 700 710 720 TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC TCA AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG GCA TRP GLH VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA 225 , 230235 240 40

730 .740 750 760

GTG CTC АТС CAC CCC TCC TGG GTG CTG АСА GCG GCC CAC TGC ATG GAT VAL-LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU TIER ALA ALA HIS CYS MET ASP

, 245250 :. 255 45 ., X-7953A 770 780 790 800 810

GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC AGG CTT GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG . .- 260; 265 270

5 -

820 830 840 850 860 TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC АТС AAG GAG GTC TTC GTC CAC TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS

275 ; 280285 10

870 880 890 900 910

ССС ААС TAG AGO AAG AGC ACC ACC GAG AAT GAC АТС GCA CTG CTG CAC PRO ASH TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS

290295 300 15

920 930 940 950 960 CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ЛТС-TGC CTC LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN Tlffi ILE VAL PRO ILE CYS LEU 305. 310 315 - 320 20

970 . - 980 990 . 1000

CCG GAC AGC GGC CTT GCA GAG CGC GAG CTC.AAT CAG GCC GGC CAG GAG PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU

325 330 335 25

1010 1020 v 1030 1040 1050 ACC CTC GTG ACG GGC TGG GGC TAG CAC AGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC Tlffi LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARC GLU LYS GLU ALA

340345 350 30

1060 1070 1080 1090 1100 AAG AGA AAC CGC ACC TTC GTC CTC ЛАС ТТС АТС AAG ATT CCC GTG GTC , LYS ARG ASH ARG THR PHE VAL LEU ASN PIE ILE LYS ILE PRO VAL VAL 355360 365

35-: .

1110 1120 1130 1140 1150 CCG GAG AAT GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG TCT GAG AAC .. PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN 370 . 375 380

40......

1160 1170. . 1180 1190 1200

ATG CTG TGT GCG.GGC АТС CTCGGG GAC CGG CAG GAT GCC TGC GAG GGC

MET LEU CYS ALA GLY ILE LEUGLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

385 390395 . 400

45

X-7953A- ч

1210 1220 1230 1240

GAC ACT GGG GGG CCC ATG GTC GCC TCC TTC CAC GGC ACC TGG TTC CTG ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU

405 410415 5 1250 1260 1270 1280 1290 GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT GGG CTC СТГ.-САС AAC TAG VAL GLY LEU VAL SEE TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

420425 430 10

1300 1310 1320 1330 1340 GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC TAG CTC GAC TGG АТС CAT GGG CAC GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS

435440 445 15 . ,

1 1350 1360 1370 1380 АТС AGA GAC AAG GAA GCC CCC CAG AAG AGC TGG GCA CCT TAG-3 ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

450455 460 .20

где А- деэоксиаденил, G -дезоксигуанил, С

- дезоксицитидмл, Т - тимидил, ALA - ала- нин, APG - аргинин, ASN - аспарагин, ASP

- асларагинова  кислота, -СООН - карбоксильный конец, CYS - цистеин, GLN - глута- мин, GLU - глутаминова  кислота, GLY - глицин, HIS - гистидин, На - аминоконец, ILE - изолейцин/LEU - лейцин, LYS - лиг зин, МЕТ - метионин, РНЕ - фенилаланин, PRO - пролин, SER - серии, THR - треонин, TRP - триптофан, TYR - тирозин, и VAL - палии.

Изображенна  выше ДНК-последовательность происходит от клонов кДНК, полученных от мРНК печени человека, котора  кодирует белок С человека. Каждому специалисту известно, что способность генетического кода к вырождению дает возможность сконструировать много.различных ДНК-последовательностей , кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность. Таким образом, изображенна  выше кДНК- последовательность дл  раннего белка С человека  вл етс  лишь одной из многих возможных последовательностей, кодирую- щих ранний белок С человека. При констру- ировании кДНК-клонов, 5 поли G последовательность, 3 поли С последовательность , и 5 и 3- последовательности распознавани  рестриктирующего фермен- та Pstl были построены у концов кДНК, кодирующей белок С. Два из указанных кДНК-клонов были модифицированы в цел х построени  ДНК-молекулы, содержащей кодирующую последовательность раннего белка С человека, а также участки ДНК, кодирующей нетрэнслиров.знную мРНК у 5 и 3 - концов кодирующей области . Указанную ДНК-молекулу вводили в Pstl-сайт плазмиды рВР322 в цел х постро- ени  плазмиды рНС7. Таким образом, плаз- мида РНС7 содержала вышеуказанную кодирующую последовательность и указанные ниже дополнительные последовательности изображена лишь одна нить молекулы: 5- CTGC AGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG CTG TCATGG C.GG CAG CAC CGC GAA CTT GCA GTA TCT CCA CGA ССС GCC ССТ АСА GGT GCC ACT GCC ТСС AGA - 3 и 5 - CGA CCC ТСС CTG CAG GGC TGG GCT ТТТ GCA TGG САА TGG ATG GGA CAT TAA AGG GAC ATG TAA CAA GCA CAC CCC CCC ССС ССС ССС ССС ССС ССС ССТ GCA G - З у концов 5 и 3 соответственно кодирующей нити последовательности, кодирующей ранний белок С человека. Благодар  комп- лементарности при спаривании оснований ДНК, последовательности одной нити двух- нитееой ДНК-молекулы вполне достаточно дл  определени  последовательности противоположной нити. Плазмида pl-IC7 может быть выделена стандартным способом из штамма E.coli K12 RRI/pHC7, депонированного и  вл ющегос  частью посто нного фонда коллекции клеточных культур Северной региональной научно-исследовательской лаборатории (RR). Пеори , Иллинойс. Указанна  культура E.coli K12 PPI/pHC7 может быть получена из NRRL. под вход щим номером NRRL B-15926. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды рНС7 представлены на фиг.2.

Ниже привод тс  также схематическое изображение раннего белка С.

14243 197198 199200 211212 461

ргс-рго

KR

ЛР

ЛИС

«-не-

рге-рго - аминокислотные ост атки 1-42 раннего белка С человека, которые кодируют сигнальный пептид и пропентид белка С человека, играющие важную роль в направлении секреции и у-карбоксилировани  белка С.

LC- аминокислотные остатки 43-197 раннего белка С, которые после пост-трансл ционной модификации содержат легкую цепь (LC) двухцепочечного зимопена (образованного из одноцепочечного зимогена путем удалени  дипептидз, как указано ниже) и активированных форм белка С; KR - аминокислотные остатки 198-199 раннего белка С человека; указанные остатки, очевидно, могут быть удалены (на основе гомологии с бычьим белком С.) с помощью двухстадийного способа, заключающегос  сначала в расщеплении (либо между остатками 197-198, либо между остатками 199- 200), а затем о воздействии карбоксипептидазой или аминопептидазой с образованием дву/цепочечного белка С; АР - аминокислотные остатки 200-211 раннего белка С, содержащие пептид активации , который удал ют из зимогепных форм белка С в цел х получени  активированного белка С;

АНС - аминокислотные остатки 212-4G1 раннего белка С, которые после пост-трансл ционной модификации содержат активированную т желую цепь (АНС) активного белка С;

НС - т жела  цепь двухцепочечной формы зимогена белка С. котора  после посттрансл ционной модификации состоит из аминокислотных остатков 200-461, АР и АНС.

Зимоген человеческого белка С  вл етс  предшественником сериновой протеазы, синтезируемым п печени и присутствующим в крови. Дл  экспрессии новой биологической активности белок С нуждаетс  в посттрансл ционной модификации, дл  которой необходим витамин К. Двухцепочечный, с дисульфидной св зью зимоген белка С может быть получен из одноцепочечного зимо- гена путем ограниченного протеолиза. Указанный ограниченный протеолиз, очевидно , включает в себ  расщепление и удаление аминокислотных остатков 198 и 199. Активаци  двухцепочечного зимогена в активную сериновую протеазу представл ет собой протеолйтическое расщепление пеп- тидной св зи APG-LEU (остатки 211 и 212). Указанное расщепление высвобождает до- декапептид (остатки 200-211), пептид активации , который включает в себ  амино-концы большей (т желой) цепи двух- цепочечной молекулы зимогена. Белок С  вл етс  значительно гликосилированным; зрелый фермент из плазмы содержит 15- 23% углеводов. Белок С также содержит не- которое число редко встречающихс  аминокислот, например, у-карбоксиглута- миновую кислоту и /3-гидроксиаспарэгино- вую кислоту (эритро-1 -/ -гидроксиаспартат). .у-Карбоксиглутаминова  кислота (gla) мо- жет быть получена из остатка глутаминовой кислоты путем у-глутамилкарбоксилирова- ни  с использованием микросомной карбок- силазы, дл  которой в качестве кофактора требуетс  витамин К.

Ниже схематически представлена активаци  белка С человека. При этом каждому специалисту известно, что пор док стадий, показанный на схеме, не об зательно отражает пор док стадий при метаболическом пути in vivo

pre-pro-LC-KR AP-AHC ранний белок.С пост-трансл ционна  модифика- ци , т.е. у-карбоксилирова- ние конкретных остатков глутами- новой кислоты, /3-гидроксили- рование остатка аспарагиновой кислоты, и гликосилирование секреци ,удаление остатков 1-42, которое может состо ть из более, чем одного протеолитического расщеплени 

LC-KR-AP-AHC одноцепочечный зимоген удаление остатков 198-199; около 90% зимогенного белка С, найденного в крови человека,  вл етс  его двухцепочечной формой (S-S-дисульфидна  св зь)

С активаци  тромбин- $-$ Двухцепочечный

I зимоген j AHC-AR

тромбомодулином /-С

,-$ активированный дне белок с

Изобретение относитс  к получению новых соединений, векторов, трансформантов и способов рекомбинантной экспрессии новых зимогенов белка С.

Были использованы следующие обозначени :

Ad2LP - главный подний промотор аде- новируса типа 2.

Аминокислотные остатки в белках и пептидах обозначены аббревиатурами, представленными в табл.1.

ApR - ампициллин - устойчивый фенотип или его несущий ген

В К - ДЕК от ВК-вируса

ЕпЬилиэихансер-энхансер ВК-вируса.

ер или SV40 ер - ДНК - сегмент, содержащий SV40 - ранний промотор гена Т-ан- тигена, области св зывани  Т-антигенз,

40 - энхансер, и точка инициации репликации SV4C.

у-карбоксилирование - реакци  присоединени  карбоксильной группы к глутами- новым кислотам у у-углерода.

у-карбоксилированный белок - белок, в котором некоторые остатки глутаминовых кислот были подвергнуты у-карбоксилиро- ванию.

GBMT - транскрипционна  единица - модифицированна  единица регулировани  транскрипции, содержаща  знхансер Р2 ВК-вируса, расположенный непосредственно выше регул торного элемента главного позднего промотора аденовируса; позднмй главный промотор аденовируса-2, элемент поли-GT, ст имулирующий указанный промотор , и ДНК-последовательность, содержащую разделенную на три части сплайсерную лидерную последовательность аденовируса. GBMT-транскрипционна  единица находитс  приблизительно на Hindll - рестриктиционном фрагменте 900 п.с. плазмиды pGTIV-ДНК , кодирующа  интрон, так называема  внедр юща с  последовательность.

ММТрго - промотор мышиного гена ме- таллотионеина-1.

Ранний белок - полипептид, продуцированный после трансл ции мРНК-транскрип- та. до любых пост-трансл ционных модификаций. Однако пост-трансл ционные модификации, такие, как у-карбоксили- рование остатков глутаминовой кислоты и гидроксилирование остатков аспаргиновой кислоты, могут иметь место перед тем, как белок будет полностью транслирован о мРНК-транскрипта.

NoeR - ген. несущий устойчивость к не- омицину, который .может быть также использован дл  переноса устойчивости к антибиотику G418.

рА - ДНК - последовательность, кодирующа  сигнал полиаденилировани .

Промотор - ДНК-последовательность, котора  направл ет транскрипцию ДНК-в РНК.

Активность белка С - любое свойство белка С, ответственное за протеолитиче- скую, амидолитическую, эстеролитическую и биологическую антикоагулирующую или профибринолитическую активности. Методы испытани  белка на антикоагулирующую активность хорошо известны.

Вектор клонировани  рекомбинантной ДНК - любой аген.т, например агент хромосомной интеграции, автономно реплициру- ющиес  плазмиды, и фаги, содержащие ДНК-молекулу, к которой могут быть добавлены один или несколько дополнительных ДНК-фрагментов.

Вектор экспрессии рекомбинантной ДНК- любой вектор клонировани  рекомбинантной ДНК, в который ввод т промотор в цел х стимулировани  генного продукта.

Вектор рекомбинантной ДНК - любой вектор клонировани  и экспрессии рекомбинантной ДНК.

Репликон - ДНК-последовательность, контролирующа  и направл юща  автономную репликацию плазмиды или другого вектора .

Фрагмент рестрикции - люба  линейна  ДНК-последовательность, генерированна  с помощью одного или нескольких рестриктирующих ферментов.

Восприимчива  клетка-хоз ин - клетка- хоз ин, котора  неспособна развиватьс  в присутствии данного антибиотика или другого токсичного соединени , если отсутствует ДНК-сегмент, несущий устойчивость к данным соединени м.

TcR - тетрациклин - устойчивый фенотип или ген, несущий указанный фенотип.

Трансформаци  - введение в хоз йскую клетку-реципиент ДНК, измен ющую генотип указанной клетки-реципиента.

Трансформант - хоз йска  клетка-реципиент , подвергнута  трансформации.

Трансл ционна  актив ирующа  последовательность - люба  ДНК-последовательность , включающа  последовательность, кодирующую область св зывани  с рибосо- мо й и кодон инициации трансл ции, такой, как 5 -ATG - 3, который обеспечивает трансл цию мРНК-транскрипта в пептидили пол- ипептид.

Зимоген - ферментативно неактивный предшественник протеолитического фермента . Используемый в насто щем описании термин зимоген белка С относитс  к

секретируемым неактивным одноцепочеч- ным или двухцепочечным формам белка С. На фиг. 1 представлены рестрикцион- ный сайт и функциональна  карта плазмиды

pLPC-Q097; на фиг.2 - сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды pLPC- Q248; на фиг.З - сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды pLPC-Q313; на фиг.4 - сайт рестрикции и функциональна 

карта плазмиды pLPC-Q329; на фиг.5 - сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды pGTC; фиг. 6 представл ет собой сайт рестрикции и функциональную карту плазмиды pGT-d; на фиг.7 - сайг рестрикции и

5 Функциональна  карта плазмиды PGT-li.

Изобретение позвол ет получить ДНК- соединени , кодирующие экспрессию новых зимогенных форм белка С человека. Некоторые способы получени  зимогена на0 тивного белка С человека и раннего белка С человека известны. Способы прототипов направлены на экспрессию зимогенных форм белка С человека, аминокислотна  последовательность которых не отличаетс  от ами5 ноки слотной последовательности зимогенных форм, присутствующих в крови человека. При экспрессии в..определенных лини х укариотических клеток, таких, как лини  293 клеток почки человека, секретиру0 етс  зимоген нативного белка С человека с новым типом гликосилировани , который отличаетс  от формы зимогена, обнаруженного в крови человека.

Изобретение относитс  к получению зи5 могенных форм белка С человека, которые имеют измененные типы гликосилировани  вследствие сайт-напраоленных изменений в последовательности аминокислотных остатков . Указанные активированные зимо0 генные формы имеют более высокую амидолитическую и антикоагулирующую активность по сравнению с нативным белком С человека. Изобретение также относитс  к ДНК-соединени м, векторам экспрессии

15 рекомбининтной ДНК, лини м трансформированных клеток и способам рекомбинантной экспрессии указанных новых зимогенных форм белка С человека. Способ продуцировани  ухазанных форм зимогена

0 белка С человека заключаетс  в том, что:

А) эукариотическую хоз йскую клетку трансформируют с помощью фактора рекомбинантной ДНК, причем указанный пек- тор содержит:

5

(О ДНК-последовательность, кодирующую последовательность аминокислотных остатков, котора  от аминоконца до карбоксильного конца включает в себ  следующую аминокислотную последовательность:

171838411 18

Х-7953Л:

10 МЕТ ТЕР GLN LEU THE SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA TIffi TRP GLY ILE

SER GLY TIffi FRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG

ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARC LYS ARC ALA ASN SER PHE LEU GLU 15

GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

ASP PHE GLUGLUALA ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASPTHR LEU

20 ALA PHE TRPSERLYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VALLEU PRO

LEU GLU HISPROCYS ALA SER LEU GYS CYS GLY HIS GLY THRCYSILE

ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY 25:

ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU R1 CYS SER LEU ASP ASN

GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

.j

30 SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TR LYS ARG MET GLU LYS

LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP TIffi GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL 35

ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET TIffi ARG ARG GLY ASP SER PRO

TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA

40 VAL LEU ILE HIS .PRO SER TRP VAL LEU TIffi ALA ALA HIS CYS MET ASP

. GLU SER LYS LYS LEU LEU VALJUJG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG

3A TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS

PRO R2 .TYR SER LYS SER THE TIffi ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS

5 LEU ALA GLN PRO ALA TIffi LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU

PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLlfbEU- ASN GLN ALA GLY GLN GLU

THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA

10LYS ARG R3 ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL

PRO HIS R4 GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN

15 MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY TIffi TRP PHE LEU

VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

20

GLY VAL TYR TIffi LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS

ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRQ-COOH

где RI выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, Ra выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, Рз выбирают из группы, содержащей ASN и GIN и Нз выбирают-из группы, содержащей ASN и GIN; R4 выбирают из группы, содержащей ASN и GIN;

(ti) промотор длп регулировани  экспрессии указанной ДНК-последовательности;

B) хоз йскую клетку, трансформированную в стадии (А) культивируют при услови х, способствующих экспрессии указанной ДНК-последовательности и

C)указанный зимоген белка С выдел ют из культуры.

Изобретение также относитс  к ДНК- соединени м, используемым в цел х получени  новых зимогенных форм белка С человека. Все указанные соединени  кодируют препропептид, содержащий сигнальный пептид дл  направлени  секреции и пропептид из у-карбоксилированного (посредством воздействи  витамин К-зависи- мой карбоксилазы), белка. Такие пропептидные последовательности хорошо известны специалистом. См., например, Suttle и др., 1987, Proc.Natl. Acad. Sei. 34:634-637. Предпочтительно дл  простоты конструировани , если последовательность , кодирующа  си(нальный пептид, и последовательность, кодирующа  пропептид , будут происходить от аминокислотной последовательности пре-пропептида у-кар- боксилированного белка. Примерами таких у-карбохсилированных белков  вл ютс  (но не ограничиваютс  ими) фактор VII, фактор IX, фактор X, протромбин, белок S, белок Z и белок С, ДНК-последовательность, кодирующа  пре-п ропептид белка С человека  в- л етс  предпочтительной дл  введени  в вектор насто щего изобретени .

Кроме того, ДНК-соединени  изобретени  содержат последовательность кодировани  дл  легкой цепи белка С человека, котора  расположена непосредственно за гфе-пропептидкодирующей последовательностью и в трансл ционной рамке считывани . Легка  цепь белка С человека содержит аминокислотные остатки от 43 до 197 включительно , раннего белка С, как указано выше . Амино-концевые части витамин К-зависимых белков плазмы, также, как ами- но-концеоа  часть легкой цепи белка С, имеют область св зывани  с кальцием. Области св зывани  с кальцием указанных белков плазмы, таких, как фактор VII, фактор IX, фактор X, протромбин и белок S могут быть использованы аналогично област м св зывани  с кальцием легкой цепи белка С человека . В одной из новых форм зимогена (Q97) изобретени  остаток аспарагина в положении 139 в легкой цепи замен ли на остаток глутэмина. удал   тем самым область гликосилировани .

ДНК-соединени  изобретени , кроме того, содержат последовательность, кодирующую дипептид LYS-ARG (КР), котора  расположена непосредственно за

последовательностью, кодирующей легкую цепь и в трансл ционной рамке считывани  с этой последовательности. Двухосновный дипептид, такой, как LYS-ARG расположен в раннем белке со стороны карбоксильного

конца легкой цепи. Ориентаци  дипептида LYS-ARG в экспрессированном белке не относитс  к цел м изобретени . Дл  целей изобретени , двухосновные дипептиды,такие , как LYS-LYS или ARG-ARG, эквивэлентны дипептиду LYS-ARG. Однако дл  целей изобретени , дипептид LYS-ARG, который представл ет собой дипептид нативного белка С человека,  вл етс  предпочтительным .

Непосредственно ниже за кодонами дл  LYS-ARG-дипептида расположена последовательность , кодирующа  пептид активации . При этом следует отметить, что зимогены изобретени  в основном отличзютс  от нативных форм зимогенов белка С человека, описанных ниже.

Кроме того, другие замещени  аминокислот , в дополнение к замещению в поло- . жении 139 в легкой цепи, также может

способствовать уёилению амидолитической и антикоагулирующей активностью пол- . ученного зимогена. Выражение полученный зимоген указывает на то, что, хот  замещени  описываютс  со ссылкой на положени  в раннем белке С человека, однако ранний белок С человека должен быть сначала выделен (в результате удалени  амино- кислотных остатков от 1 до 42) дл  получени  зимогенной формы. Таким обра- J

зом, замещение остатка аспарагина в положении 139 (в раннем белке С человека) остатком глутамина приводит к новой форме зимогена насто щего изобретени . Замещение остатка аспарагина (в

активированной т желой цепи) в любом из положений 290, 355 или 371 остатком глутамина приводит к новой форме зимогена изо- , бретени .

5 Таким образом предпочтительные новые формы зимогена белка С человека изобретени  могут быть получены в результате секреции и процессинга молекул раннего белка С человека, имеющих следующую аминокислотную последовательность:

21 1838411 22

Х-7953Д

MET TRP GLN LEU.THR SER LEU LEU LEU РНЕ VAL ALA THR TRP GLY ILE

SER GLY THE PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARC

25 . ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU

GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU

J W

ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO , LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU €YS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE

k

35ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY

X-7953A

ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU Rt CYS SER LEU ASP ASN

.

GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

5 SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS

PRO.ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS

LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG .ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL

10 ...;,: ... ...;: -. : .v.::.V- . -.:-- .,. .: ,. -- :.У;-f . : Ь

ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO

, TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA

.15 VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP

GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG

TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS 20

PRO RZ TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS

LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU

25 PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASH GLN ALA.GLY GLN.GLU

- /THE LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SEE ARG GLU LYS GLU ALA

LYS ARG R3ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL

30., .

PRO HIS R4GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN

MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

35 ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU

VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

GLY VAL TYR THE LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ; 40

ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

где Ri выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, R2 выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, Ra выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, и R4 выбирают ш группы, содержащей ASN и GIN.

Новый зимогем 0,097 включает замещение остатка аспарагина в положении 139 остатком глутамина. Зимогенр,248 включает замещение остатка аспарагина в положении 290 остатком глутамина. Зимоген 0,313 включает в себ  замещение остатка аспарагина в положении 355 остатком глутамина, а зимоген 0,329 включает в себ  замещение остатка аспарагина в положении 371 остатком глутамина.

При этом следует отметить, что вследствие вырождени  генетического кода некоторые ДНК-соединени  могут кодировать изображенный выше полипептид. Следовательно , описанные ниже конструкции и примеры получени  предпочтительных ДНК-соединений, векторов и трансформантов изобретени   вл ютс  всего лишь иллюстративными и не ограничивают объема изобретени . Кроме того, замещение GIN вместо ASN  вл етс  иллюстративным и не ограничивает объема насто щего изобретени , поскольку могут быть использованы и другие.замещени , за исключением CYS или PRO. К тому же следует отметить, что различные замещени  отдельных- аминокислот насто щего изобретени  могут сочетатьс  дл  создани  новых зимогенов.

Все ДНК-соединени  изобретени  были получены посредством сайт-специфического мутагенеза гена белка С человека. Подвергнутые мутагенеэу зимоген-кодирующие молекулы затем вводили в эукариотические векторы экспрессии дл  осуществлени  экспрессии генов зимогенов с помощью главного позднего промотора аде нови руса-2. Указанные векторы содержат также элемент энхансера Р2 ВК-вируса, предназначенный дл  усилени  экспрессии от промотора. Векторы были трансформированы в E.coli K12 AGI-клетки и депонированы в основном фонде, клеточных культур Северной региональной исследовательской лаборатории в Peoria, Иллинойс 61604 от 9  нвар  1990 г. Конкретные культуры, даты депонировани  и вход щие номера пред- ставлены в табл.2.

С помощью стандартной техники получают культуры и выдел ют плазмиды, которыезатем трансфецируют непосредственно в хоз йские эукариотические клетки в цел х прордуцировани  зимо- генных форм белка человека С. Плазмиды предпочтительно трансформировать в хо1 з йские клетки, которые экспрессируют непосредственно ранний генный продуктаде- новируса EIA, поскольку ВК-энхансер, действующий на векторной основе, наиболее эффективно усиливает экспрессию в присутствии EIA. Дл  специалистов следует отметить , чтб имеетс  р д клеток-хоз ев, которые экспрессируют или которые могут быть адаптированы дл  экспрессии непосредственно раннего генного продукта большого ДНК-вируса. Предпочтительными лини ми клеток  вл ютс  лини  клеток почки человека 293 депонированна  в Американской коллекции типовых культур под номером допуска АТСС GRL 1573 или лини 

клеток АУ12 сирийского хом чка (АТСС . 9595). Однако наиболее предпочтительной  вл етс  лини  клеток 293 почки эмбриона человека.

Дли получени  более высоких уровней

экспрессии из депонированных векторов могут быть вырезаны гены, кодирующие различные формы зимогена белка С, и лиги- рованы в вектор, содержащий транскрипционную единицу G В МТ. В частности,

плазмида pGT-h, котора  содержит ген, несущий устойчивость к гидромицину, может быть получена из NRRL (NRRL В-18591). Плазмидный остов получают путем переваривани  плэзмиды рестрпктирующим ферментом Bell с последующим выделением плазмидной ДНК из darn-штамма E.coli, несущего метилазу, например, GN48 (NRRI В- 15725). Каждый из этих новых генов зимогена может быть выделен из их соответствующих плазмид путем Bell-переваривани . Векторный остов очищают и дефосфорилируют, а затем любой из генов нового-зимогеиа насто щего изобретени  лигируют в Bell-сайт, Плэзмиды, содержащие гены нового зимогена, расположенные за GBMT-транскрипциопной единицей, затем трансформируют в клетках 293, культи- ви руют, и полученные новые зимогеиы очищают от культуры с помощью стандартной техники. Способ очистки белка С человека из культуры, например, описан Уап.

Соединени  изобретени  также включают в себ  зимогенные формы, генерированные при секреции ранних белков насто щего изобретени , Таким образом, соединени  изобретени  включают ДНК-ко- дирующие последовательности, векторы экспрессии, направл ющие экспрессию

5 указанных последовательностей, ранние белки, продуцированные при трансл ции мРНК-транскриптов, генерированных из указанных кодирующих последовательностей , зимогены, продуцированные при секреции указанных ранних белков и

активированные производные некоторых зимогенов.

ДНК-соединени  изобретени  могут быть также синтезированы химически или путем объединени  рестрикционных фраг- ментов, или путем объединени  указанных способов, хорошо известных специалистам. Механизм синтезировани  ДНК также хорошо известен специалистам и может быть использован дл  конструировани  соедине- ний изобретени .

Характерные векторы изобретени  содержат ВК-знхансер, предназначенный дл  стимулировани  транскрипции главным поздним промотором эденовируса кодиру- ющей последовательности изобретени . При этом каждому специалисту известно, что существует большое количество эукари- отических промоторов, энхансеров и зкс- прессирующих векторов, которые обычно используютс  в аналогичных цел х и могут использованы в способе насто щего изобретени . Специалистам также известно, что эукариотический вектор экспрессии может быть использован и без энхансерного элемента. Ключевым аспектом изобретени   вл етс  не конкретный энхансер, если он присутствует, или промотор,.используемый дл  управлени  экспрессией зимогсна белка С, а нова  кодирующа  последователь- иость и соответствующие белки, продуцированные из указанной последовательности .

Однако выбор векторных элементов, таких , как энхансеры, промоторы, и селекти- руемые моркеры, может сильно повли ть на конечные уровни болкз, продуцируемого эукариотической клеткой-хоз ином. В публикации Европатента 0245949, опубл. 19 но бр  1987 г. вводимого в предлагаемое описание посредством ссылки, описываетс .р д экспрессирующпх еекторов дл  зи- моген.ч нативного белка С, s которых используетс  ВК-знхансер в цел х стимулировани  эукзриотического промотора, на- правл ющего экспрессию раннего белка С человека. Указанные векторы обеспечивают экспрессию особенно высоких уровней, если их трансформировать в эукариотические клетки, которые также эхспресс руют не- посредственно ранний генный продукт „большого ДНК-вируса, такого, как EIA-зде- новируса. Как видно из описани  характерных векторов pGT-Q097-h, pCT-Q248-g, pCT-Q313-h и pCT-329-h, раскрываемых в данном описании изобретени , способ экспрессии генного продукта CBMT-EIA  вл етс  особенно предпочтительным дл  использовани  в нем векторов насто щего изобретени .

Изобретение не ограничено использованием какой-либо определенной эукариотической клетки-хоз ина. Р д эукариотических хоз йских клеток  вл ютс  доступными, т.е. наход тс  в хранилищах, например, в АТСС, Роквилль, MD 20852, и могут быть использованы дл  целей насто щего изобретени . Выбор конкретной клетки-хоз ина в определенной степени зависит от конкретного вектора экспрессии, используемого дл  управлени  экспрессией ДНК- соединений, кодирующих белок С. Так как ранний белок С человека и производные раннего белка С человека изобретени  подвергаютс  значительной пост-трансл ционной модификации, то некоторые хоз йские клетки  вл ютс  более предпочтительными дл  использовани  векторами насто щего изобретени . В публикации Европатента N 0245949 и в работе Grlnel и др. 1987, Bio/Technology 5:1189 указываетс , что дл  получени  рекомбинантного продукта у- карбоксилированных белков, таких, кок белокС человека, особенно предпочтительными  вл ютс  оденовирус- трансформированные клетки почки эмбриона человека, Одной из таких аденовирус-трзнсформированных эмбриональных клеточных линий почки чнлопек   вл етс  лини  293, котора  может быть получена из АТСС под вход щим помором АТСС CRL 1573. Лини  клеток 293  вл етс  также предпочтительной дл  использовани  с векторами насто щего изобретени ,

Однако преимущества продуцировани  у-корбоксилированного белка, такого, как зимоген белка С человека, в аденовирус- трансформированной линии клеток не ограничиваютс  использованием аденопирус- трэнсформированных клеток почки эмбриона человека. Фактически, аденовирус- трансформироознные клетки  вл ютс  исключительными хоз евами дл  продуцировани  карбосилированного белка С человека. Одной из наиболее предпочтительных линий клеток этого топа  вл етс  лини  клеток AY12-664 (обозначаема  ниже AY12), которую можно получить из АТСС под вход щим номером АТСС CRL 9595. Линию клеток AY12 конструировали путем инъ- ециропаии  сирийского хом чка путем введени  п загривок человеческого адено- вируса 12 и выделени  клеток из полученной опухоли. Ниже, в примере 3, описана трансформаци  линий клеток 293 и AY12 с помощью характерного вектора рСТ-0.097-1.

Векторы изобретени  могут быть трансформированы и экепрессированы в р де эукариотических клетках-хоз евах, например , в клетках млекопитающих. Векторы насто щего изобретени , которые не имеют селектируемый маркер дл  выделени  и идентификации стабильных эукариотиче- ских трансформантов, используютс  не только дл  временных анализов, но и также дл  совместной трансформации. Векторы изобретени  могут также содержать последовательности , которые стимулируют репликацию в E.coli поскольку обычно более эффективно продуцировать плазмидную ДНК в E.coli, чем а других хоз йских организмах . . - Экспресси  последовательностей, кодирующих белок С человека и содержащихс  в векторах насто щего изобретени , происходит в тех клетках-хоз евах, в которых конкретный промотор ассоциирован с функци ми структурного гена. Характерные клетки-хоз ева, подход щие дл  использовани  их в изобретении, представлены в табл.3.

Как видно из данных табл.3, многие хоз йские клетки млекопитающих обладают необходимым клеточным механизмом распознавани  и надлежащего процессинга сигнального пептида на ранних белках изобретени  и обеспечиаают пост-трансл ционные модификации, такие, . как гликосилированио, у-карбоксилирование, и / -гидроксилирование, как это имеет место в белке С человека, присутствующего в плазме крови. Однако, как указывалось выше, оптимальный пост-трансл ционный про- цессинг HP С происходит в аденовирус- трзнсформировэнных клетках. Дл  трансформации указанных эукариотических клеток может быть использован широкий диапазон векторов, обсуждаемых ниже, однако , примеры описываемых ниже векторов не ограничивают объема изобретени .

Векторы р5У2-типа содержат сегменты генома SY40, которые составл ют определенна  зукариотическа  транскрипционна  единица-промотор (ер), нитрон (IYS), и область полиаденидированип (рА). При отсутствии Т-аитигена SY4ft, плазмидные векторы рЗУ2-типа трансформируют хоз йские клетки млекопитающих или других эукариотические клетки путем интеграции хромосомной ДНК в хоз йскую клетку. Был сконструирован р д плазмидных векторов типа pSY2, где SY40-npOMOTOp осуществл ет транскрипцию инсертированного гена. Указанные векторы могут быть использованы с кодирующими последовательност ми насто щего изобретени  и  вл ютс  доступными , так как наход тс  в Американской коллекции типовых культур (АТСС) в

Роквилле, Мэриленд, или в Северной региональной исследовательской лаборатории (NRRL) В Пеории, Иллинойс.

Плазмиды pSY2-dhfr (АТСС 37146) содержит мышиный ген дигидрофолат-редук- тазы (dhfr) под контролем раннего промотора SY40. Известно, что при определенных услови х ген dhfr может быть амп- лифицирован или реилицирован в

0 хоз йской хромосоме. Эта аплификаци  может включать ДНК-последовательности, примыкающие к dhfr-гену, например, последовательность , кодирующую белок С насто щего изобретени , и таким образом может

5 быть использована дл  увеличени  проду- цированип эимогенов белка С насто щего изобретени .

В плазмидах, которые были сконструированы п цел х экспрессии раннего белка С

0 и зимогенов белка С изобретени  в клетках млекопитающего и других эукгриотических клетках-хоз евах, может быть -использован широкий р д промоторов. Однако изобретение ни в коем случае не ограничиваетс  кон5 кретными эукариотаческими промоторами, представленными о насто щем описании изобретени  в Качестве примера. Такие промоторы , как поздний промотор SY40 или эукариотические промоторы, описанные

0 Bucher и др., 1986, Nuc.Aeicis, Res. 1.4(24): 1009, или промоторы от эукариотиче- ских генов, например, таких, как экстроге- нипдуцируемый ген куриного овальбумина, гены интерферона, глюкокортикоид-инду5 цируемый ген тирозин-аминотрансферазы, ген тймидин-киназы и главный ранний и поздний гены аденовируса, могут быть легко выделены и модифицированы с использо- ваниемлекторов . экспрессии

0 рекомбинантных ДНК, сконструированных в цел х получени  зимогена белка С в эука- риотических клетках-хоз евах. Эукариотические промоторы могут быть также использованы в тандеме дл  управлени 

5 экспрессией кодирующей последовательности насто щего изобретени . Кроме того, известно большое количество ретровиру- соо, которые инфицируют широкий р д эукариотических клеток-хоз ев. Длинные

0 концевые повторы в ДНК ретровирусов часто кодируют промоторную активность и поэтому могут быть использованы дл  управлени  экспрессией кодирующих последовательностей насто щего изобрете5 ни .

Плазмида pRSYCat (АТСС 37152) содержит участки длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса (RCY), который, как известно, поражает кур и другие хоз йские клетки. Последовательности длинных концевых повторов RSY могут быть выделены на 0,76 KB Ndel-Hlndlll -рестрикционном фрагменте плазмиды pRSYcat. Промотор в длинном концевом повторе RSY  вл етс  подход щим дл  его использовани  в векто- pax изобретени . Плазмида pMSYi (NRRL В-15929) содержит длинные концевые повторы вируса мышиной саркомы (MSY), который , как известно, поражает мышей и другие хоз йские клетки. Эти последова- тельности повторов могут быть использованы в качестве промоторов в векторах насто щего изобретени . Промоторы мышиного гена металлотионеина (ММТ) также  вл етс  весьма подход щим дл  использо- вани  в эукариотических хоз йских клетках и в векторах насто щего изобретени . ММТ- промотор присутствует 15 кв плазмиды pdBPV-MMTneo (ATCC 37224), котора  может служить в качестве исходного материа- ла дл  конструировани  других плазмид изобретени .

Можно осуществить множество модификаций и вариаций иллюстративных ДНК- последовательностей и плазмид изобретени . Например, вырождение генетического кода предусматривает замещение нуклеотидов на .прот жении пептидкодирующих областей, а также в стоп-сигнале трансл ции без альтерации полипептидкодирующей последовательности могут быть получены из известной аминокислотной или ДНК-последовательности белка С человека с помощью конструировани  с использованием стандартных методов синтеза или сайт-специфического мутагене- за. Синтетические методы могут быть осуществлены , например, в соответствии с процедурами, описанными Hakura и др.

Следовательно, изобретение неограни- чиваетс  ДНК-последовательности и плаз- мидами, представленными в описании в качестве примера.

После трансформации вектора насто щего изобретени  в эукариотических клет- ках-хоз евах, полученные трансформанты могут быть отобраны на основе селектируемого фенотипа. Этот селектируемый фенотип может быть наделен любым селектируемым маркером, присутствующим в векторе экспрессии или в другом векторе, .совместно трансформированным с вектором экспрессии в клетке-хоз ине. После отбора трансформантов, желательно идентифицировать те трансформанты, кото- рые экспрессируют наиболее высокие уровни целевого белка,колированного вектором Экспрессии. Указанна  идентификаци  особенно важна после процедуры совместной трансформации, котора  генерирует р д

трансформантов, содержащих лишь плзз- миду с селектируемым маркером и не содержащих вектор экспрессии. В приведенном ниже примере 4 описана не только процедура идентификации клеток, экспрессирую- щих и секретирующих целевой белок, но и также процедура количественной оценки секретированного белка по сравнению с другими клетками, исследованными, с использованием этого способа. Описанна  процедура также предусматривает выделение жизнеспособных клеток, секретирующих наиболее высокие уровни целевого белка.

Способы активации зимогенных форм белка С человека до активированного белка С (АРС)  вл ютс  давно отработанными и хорошо известны специалистам. Белок С может быть активирован с помощью одного тромбина, комплекса тромбин-тромбомоду- лин,  да гадюки Рассела, или с использованием широкого р да других средств. Активность зимогеноо белка С человека может быть измерена после активации тромбином с noMOuibto анализов на амидолитическую или антикоагулирующую активность. Активацию тромбином и анализы на активность белка С амидолитическую и антикоэгулирующую активность осуществл ли по Grinnell и др., 1987, Biotechnology 5:1189-1192 (вводитс  в насто щее описание посредством ссылки). Амидолитические активности углеводородных мутантов белка С представлены о табл.4.

Молекулы зимогена, использованные в анализах табл.4, были оценены количественно с помощью анализа ELISA с использованием моноклональных антител, которые не способны вступать в реакцию с мутантами или производными в такой степени , как это делают молекулы дикого типа, из которых происход т эти антитела. Затем проводили очистку и количественную оценку на основе содержани  белка, в результате чего получали данные, приведенные в табл.5.

Кроме того, помимо более высокой ан- тикоэгулирующей активности производных, представленных в табл.5, мутант Q313 показал повышенное сродство к тромбину, что привело приблизительно к трехкратному увеличению степени активации одним тромбином или тромбином в сочетании с кофактором тромбомодул ином. Это увеличение скорости активации может быть использовано при создании более восприимчивой формы зимогена белка С дл  клинических применений, а также дл  улучшени  способа расщеплени  зимогена белка С в цел х гюлучени  активированного белка С. В

табл.б представлен кинетический параметр активации эимогена Q313.

Представленные результаты  вл ютс  средними из трех независимых определений . Значени  определ лись с помощью линейно-регрессионного анализа.

Активированный белок С обладает значительной анти/ромботической активностью при использовании его дл  предупреждени  распространени  внутривенных тромбов и дл  предупреждени  смертности и повреждени  органов при сепсисе, вызванном грамотрицательной бактерией, эндотоксикоза и диссеминиро- ванного внутрисосудистого свертывани . И особенно важно, что повышенна  функциональна  активность активированных производных белка С изобретени  позвол ет использовать сниженные дозы при вышеуказанных клинических показани х, что способствует повышению безопасности лекарственного средства.

Активированные рекомбинантные зи- могены белка С насто щего изобретени  могут быть использованы в цел х предупреждени  в лечении широкого р да приобретенных заболеваний сопровождающихс  внутрисосудистым свертыванием, таких, как тромбофлебит, эмболи  легких, периферический артериальный тромбоз, эмболи , вызванна  поражением сердечных или периферических артерий, острый инфаркт миокарда , тромботические шоки, и диссеминированное внутрисосудистое свертывание. Указанные производные белка С могут быть также с успехом использованы при лечении большого количества пациентов, страдающих гетерозиготным дефицитом белка С, про вл ющимс  рецидивирующим тромбофлебитом, и гомозиготным дефицитом белка С с осложнением в виде молниеносной пурпуры. Положительные терапевтические показани  активированной белок С дает при использовании дл  предупреждени  эмболии легких и тромбофлебита, обычно обрабатываемых небольшими дозами гепарина.

Аналогично, ..Зимогены белка С насто щего изобретени  могут быть использованы дл  лечени  эмболии, вызванной в результате образовани  тромба в периферических артери х, а именно в сбнных артери х, и котора  не поддаетс  лечению или достаточному предупреждению с помощью обычно используемых средств, включа  средства дл  подавлени  действи  тромбоцитов, антикоагул нты дл  перорального введени . или их комбинации.

Зимогены изобретений могут быть также использованы при лечении острых инфарктов миокарда, поскольку после активации указанные зимогены обладают про- фибринолитическими свойствами. Эти зимоген ы могут быть введены вместе с тканевым активатором плазминогена при острой стадии инфаркта миокарда. После рассасывани  обтурирующего коронарного тромба указанные зимогены могут вводитьс  еще несколько дней в цел х предупреждени  повторного приступа инфаркта миокарда.

Активированный белок С используетс  при лечении диссеминированного внутри- сосудистого свертывани , При экстенсив5 ных клинических исследовани х пациентам с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием (DIC) вводили гепарин и антикоагул нты дл  перорального введени , однако получили при этом разочаровывающие

0 результаты. При лечении диссеминированного внутрисосудистого свертывани  активированный белок С, а также зимогены изобретени  обладают значительным преимуществом по сравнению со стандартны5 ми антикоагул нтами.

Стандартные антикоагулирующио средства в частности варфарин. используютс  при лечении инваэивных злокачественных опухолей. Многие опухолевые клетки проду0 Цируют вещества, которые способствуют активации системы коагул ции, что приводит к локальному отложению фибрина. Эти отложени  фибрина играют роль так называемых гнезд, в которых злокачественные

5 клетки могут делитьс , образу  метастазы. Однако введение варфарина или других стандартных антикоагул нтов в сочетании с более интенсивными и эффективными средствами хемотерапии не представл етс  воз0 можным, поскольку указанна  терапи  ведет к резкому снижению количества тромбоцитов , и тромбоцитопени  .в сочетании с варфарин-терапией может вызвать у пациента серьезные осложнени  в виде сильных

5 кровотечений. Производные белка С изобретени , аналогично активированному белку С, которые, будучи более селективными , чем стандартные антикоагул нты, и име  при этом более высокий терапевтиче0 ский,.индекс, чем гепарин или перорзльные антикоагул нты,  вл ютс  относительно безопасными дл  пациента с тромбоцитопе- нией, что таким образом делает возможным лечение пациентов с инвазивным раком с

5 помощью эффективной и интенсивной хе- мотерапией в сочетании с зимогеном белка С насто щего изобретени .

Зимогены и их активированные двойники насто щего изобретени  могут быть использованы дл  изготовлени 

фармацевтических композиций в соответствии со стандартной техникой, при которой зимоген белкэ С человека или активированный белок С смешивают с фармацевтически приемлемым носителем. Соответствующие носители и их составы, включа  и другие белки человека, например, альбумин человеческой сыворотки, описаны в Remington Pharmaceutical Sciens 16 th, 1980, Маек Publishing Co.. изд. изд. Osol и др., и ввод тс  в описание посредством ссылки. Указан- ные композиции будут содержать эффективное количество эимогенэ белка С или его активированную форму в сочетании с соответствующим количеством фармацевтически приемлемого носител . Указанные композиции белка С могут быть введены парентерально, или другим способов, пригодным длл снабжени  кровотоко эффективным средством.

Представленные ниже примеры иллюстрируют способы получени  характерных соединений, Ьектороо и трансформантов насто щего изобретени , однако он не ог- ранмчипают объема изобретени .

П р и м о р 1. Выделение плазмиды pIL PC-Q097.

Из Северной региональной исследоиа-. тельской лаборатории (Пеори , Иллинойс 61604) получали лиофилы E.coli K12 AGl/pIL PC-Q097 (номер допуска NRRL В-18600), Эти лиофилы сливали в пробирки, содержащие 10 мл LB-среды (10 г Бактотриптона, 5 г экстракта бэкто-дрожжей, и 10 г NaCI на 1 л рИ доводили до 7,5) и инкубировали, и течение 2 ч при 32°С, затем культуры обрабатывали 50 мкг/мл амлициллином и инкубировали при 37°С в течение ночи.

Небольшую часть ночной культуры по- .мещали на чашки с LB-агаром (LB-среда с 15 г/л бакто-arapa), содержащие 50 мкг/мл ам- пициллкна, дл  того, чтобы получить изоллт единичной колонии E.coli K12 AGl/pLPC- Q097. Полученную единичную колонию ино- кулировали в 10 мл LB-среды. содержащей 50 мкг/мл эмпициллина, и инкубировали, при этом энергично перемешива , в течение ночи при 37°С. 10 мл ночной культуры ино- кулмровали п 500 мл LB-среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, и инкубиропапи при37°С. энергично размешива  до тех пор, пока культура не достигнет стационарной фазы.

Следующа  процедура  вл етс  адаптированной процедурой, описанной Маниати- сом и др., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory).

Клетки собирали центрифугированием при 4000 г в течение 10 мин при 40°С, а надосадочную жидкость сливали. Клеточный осадок промывали в 100 мл охлажденного льдом буфера STE (0,1 М NaCL. 10 мМ Трис-HCI, рН 7,8, и 1 мМ ЭДТК). После промывани  клеточный осадок ресуспендиро- 5 вали в 10 мл раствора 1 (50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-HCI, рН 7,0, и 10 мМ ЭДТК), содержащего 5 мг/мл лизоцима, и оставл ли на 10 мин при комнатной температуре. Затем к обработанным лизоцимам клеткам добавл 0 ли 20 мл раствора 2 (0,2 н NaCI и 1 % SDS) и полученный раствор слегка размешивали. Смесь инкубировали на льду в течение 10 мин.

К .смеси лизироианных клеток добавл 5 ли 15 мл 5 М охлажденного льдом ацетата

кали  (рН 4,8) и полученный раствор разме шивали. Раствор инкубировали на льду о

течение 10 мин. Раствор 5 М ацетата кали 

получали путем добавлени  1 1,5 мл лед ной

0 уксусной кислоты к 28,5 мл воды и ВО мл 5 М ацетата кали , полученный в результате раствор представл л собой соотношение кали  к ацетату как ЗМ к 5М.

Смесь лизированных клегок ценгрифу5 гировали в устройстве Beckman SW 27 (или в его аналоге) при 20000 об/мин в течение 20 мин при 4°С. ДНК клеток и дебрис образовывали на дне пробирки осадок. Около 36 мл нздосадочной жидкости выдел ли и до0 бавл ли 0,6 объемов изопропанолэ, затем размешивали и полученный раствор оставл ли на 15 минут при комнатной температуре . Плазмидную ДНК собирали путем центрифугировани  при 12000 г в течение

5 30 мин при комнатной температуре. Нэд- осадочную жидкость сливали, ДНК-осадок промывали 70% этанола при комнатной температуре. Этаноловую промывку сливали , а осадок осушали в вакуумном эксикато0 ре. Затем осадок ресуспендировали в 8 мл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCI, рН 8,0 и 1 мМ ЭДТК).

.- К ДНК-раствору добавл ли 8 г CsCI. На каждые 10 мл С С1-ДНК-рзствора добавл ли

5 около 0,8 мл раствора бромида этили  10 мг/мл в воде. Конечна  плотность раствора составл ла около 1,55 г/мл, а концентраци  бромида этили  составл ла около 600 мкг/мл, Полученный раствор переносили на

0 центрифужные пробирки Веек а типа 50, заполн ли доверху парафиновым маслом, запаивали, и центрифугировали при 45000 об/мин в течение 24 ч при 20°С. После центрифугировани  в видимом диапазоне

5 спета наблюдались две полосы ДНК. Затем снимали крышку пробирки и удал ли нижнюю полосу ДНКс помощью шприца с иглой дл  подкожных инъекций №21, которую вводили через боковую сторону центрифужной

пробирки,

Этидийбромид удал ли путем неодно- i кратного экстрагировани  водонасыщени  1-бутанолом. CsCI удал ли путем диализа против IE-буфера. После экстрагировани  буферным фенолом, а затем хлороформом ДНК осаждали, промывали 70% этанолом и осушали. В результате получали около I г плазмиды pLPC-0.097, которую хранили при 4°С а ТЕ-буфере при концентрации около 1 мкг/мкл. На фиг. 1 представлены сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды pLPC-Q097. Аналогичным образом, из соответствующих клеток-хоз ев, также вз тых из NRRL, были выделены плазмиды PL PC-Q24G, pi. PC-Q313, и pL PC-Q329. Сайт рестрикции и функциональные карты этих плазмид представлены на приложенных к данному описанию фигурах.

Пример 2. Конструирование плазми- - ды pGT-Q097-h.

В цел х продуцировани  высоких уровней зимогенов белка С человека, плазмиды PLPC-Q097, pL PC-Q248, pPC-Q313 и pL PC- 0329 могут быть трансформированы непос- редственно в эукариотических клетках/хоз евах (предпочтительно 293- клетках). При этом могут быть получены лаже более высокие уровни экспрессии и секреции продукта, если ген, кодирующий мугантным зимоген, лигировать в вектор так, чтобы экспресси  гена упрапл лась GBMT-транскрипционпой единицей.

Одним из таких векторов  вл етс  плаз- мида pGTC, где ген дикого типа зимогена белка С человека запускаетс  транскрипционной единицей GBMT; Ген дикого типа белка С может быть легко удален из вектора Bcll-рсстрикционном фрагменте, и на этом фрагменте в вектор может быть введен любой ген насто щего изобретени . Переваривание плазмидной ДНК рестриктазой ВсП-ингибировали путем метилировани  у аденина в последовательности 5 -GАТС-3 . Следовательно, плазмиду pGTC получали из хоз йских клеток E.coil, в которых отсутствует адеиин-мегилаза такал, котора  кодируетс  dam-геном, продукт которого метилирует остаток аденина в последовательности 5 -GATC-3 . В К12 GM48 E.coli (NRRL B-15725) отсутствует функциональна  метилаза, и поэтому эти клетки  вл ютс  подход щими хоз евами дл  использовани  их в получении ДНК-плазми- ды pGTC, которую используют в качестве исходного материала при конструировании плаэмидных производных.

Клетки К12 GM48 E.coli культивировали и делали компетентными дл  трансформации , которую осуществл ли в соответствии с процедурой примера 1, использу  плазмиду pGTC. Трансформированные клетки помещали на чашки с L-агаром, содержащим ампициллин, и после того, как ампициллин- устойчипые трансформанты К12

GM48/pGTC E.coli образовывали колонии, одну из таких колоний использовали дл  получени  ДНК-плазмиды pGTC согласно процедуре примера 1. Около 1 мг полученной pGTC-плззмидной ДНК суспендировали приблизительно в 1 мл ТЕ-буфера. Аналогично, могут быть получены плазмид- ные-ДИК из pGT-h и pGT-d. Плазмида pGT-cl содержит транскрипционную единицу GBMT, в которой отсутствует ген в ВсП-сай5 те, так, чтобы можно было легко ввести любой ген. Плазмида pGT-d содержит также мышиный ген clhfr, поэтому любой транс- формант может быть отобран или амп- лифицирован с использованием

0 метотрексат-устойчивого фенотипа. Плазмида pGT-h содержит GBMT-транскриптон, Bel 1-саГгг дл  свободного введени  целевого гена, и ген, несущий устойчивость к гидро- мицииу. Штаммы К12 AG E.coli, содержа5 щие каждую из этих плазмид, были депонированы в NRRL 18  нвар  1990 г. Эти штаммы доступны под номерами допуска NRRL В-18591 (дл  К12 AG /pCT-d). NRRL В-18592 (дл  К.12 AGi/pGT-h), и NRRL B0 18593 (дл  К12 AGI/pGTC). Сайт рестрикции и функциональные карты этих плазмид представлены на фигурах, приложенных к описанию.

Около 10 мкл pL РС-0097-плазмидной

5 ДНК, полученной из 6М48-клеток;смешивали с 20 мкл 10.x Bcll-рестрикционного буфе- ра (100 мМ-Трис-HCI. рН 7,4, 1,5 М KCI, 100 мМ MgCl2 и 10 мМ ДТТ), 20 мкл 1 мг/мл В А, Б мкл, 5 мкл рестриктирующего фермента

0 Belt ( 50 Ед., по определению Bethesda Research Laboratories (BRL), из которого были получены все использованные в примерах фер.менты), и 145 мкл воды, и полученные в результате реакционные сме5 си инкубировали в течение 2 ч при 37°С, Описанные реакции рестриктирующих ферментов обычно прекращали путем экстрагировани  фенолом, а затем хлороформом, после чего ДНК осаждали, промывали зта0 HoJidiM и ресуспендировали в ТЕ-буфере. Пе- реваренные ДНК затем подвергали электрофорезу на 1% згарозном геле, и 1400 п.о. - фрагмент рестрикции, содержащий мутантный ген, очищали, использу  би5 орадиологический набор Prep-A-Gene в соответствии с инструкци ми изготовител . Затем плазмиду pGT-h выдел ли из К12 AGI/pGTC E.coli (NRRL B-18593) в соответствии с процедурой, описанной в примере 1, культивировали в GM48, а затем выдел ли

в соответствии с процедурой, описанной в примере 2. После чего pGT-h плазмидную ДНК переваривали рестриктирующим ферментом , как указано выше, и большой фрагмент выдел ли и очищали. Этот фрагмент сектора доводили до 90 мкл объема ТЕ-бу- фером (рН 8.0) фрагмент вектора доводили до 9 мкл объема ТВ-буфером (рН 8.0), а затем добавл ли 10 мл (0,05 Ед.). кишечной щелочной фосфатазы теленка в цел х де- фосфорилировани  концов вектора. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 37°С, затем добавл ли 10 мкл 500 мМ EGTA и

реакцию инкубировали в течение 45 мин

при 65°С дл  инактивации фермента. После этого реакцию экстрагировали смесью фенола и хлороформа, осаждали этано лом, промывали, и ресуспендировали о 20 мкл .воды.

Затем около 7 мкл (10 кг) остова Bcll-ne- реваренного вектора смешивали приблизительно с 1 мкл (100 кг) около 1400 п.о. Bcli-рестрикционного фрагмента плазмиды pLPC-0097, 1 мкл 10хлигазногобуфера(0,5 Трис-HCI. рН 7,6, 100 мМ MgCl2, 100 мМ ДТТ и 500 мк/мл BSA) и 1 мкл ДНК-лигазы Т4. После чего реакционную смесь лигировани  инкубировали в течение 12-16 часов при 1б°С. Реакци  лигировани  приводит к получению плазмид, содержащих мутантный , ген зимогена, ориентированный дл  транскрипции от GBMT-траискрипционной единицы , или к получению плазмид, в которых ген лигировэн в противоположном направлении . Те плазмиды, которые содержат ген в подход щей дл  транскрипции ориентации , обозначали плазмидой pGT-Q097-h.

Замороженные компетентные клетки E.coli K12 AGI получали от Strategene, 3770.

Tansey Roud, Сан Диего, Калифорни  92121. Около 5 мкл реакционной смеси лигировани  смешивали с 100 мкл аликвотой компетентных клеток, после чего смесь клеток и ДНК инкубировали на льду в течение 1 ч, затем подвергали теплопому шоку при 42°С в течение 45 с, и охлаждали на льду приблизительно в течение 2 мин. Смесь клеток и ДНК разбавл ли 1,0 мл ОС-среды в пробирке Falcon 2059 и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. 100-мкл аликвоту помещали на LB-агаровые чашки, содержащие ампи- циллин и инкубировали при 37°С до тех пор, пока не по вл лись колонии.

Полученные колонии культивировали отдельно, а плззмидную ДНК отдельных колоний исследовали с помощью рестрикци- онного анализа. Выделение плазмидной ДИК осуществл ли в небольших количествах в соответствии с процедурой примера 1, но CsCI-стадию не проводили, до тех пор,

пока соответствующие трансформанты К12 AGI/pGT-Q097-l E.coli не будут идентифицированы . После этого осуществл ли получение высокоочищенных плазмид в большом 5 количестве. В соответствии с указани ми примеров 1 и 2, любой из мутантных генов зимогена может быть легко клонирован в любой из GBMT-векторов с образованием плазмид pGT-Q097-h, pGT-Q248-h, pGT- 0 Q313-hn PGT-Q329-h.

Пример З. Конструирование трансформантов аденовирус-трансформирован- ной линии клеток почки эмбриона человека 293 и аденовирус-трансформированной ли5 нии клеток сирийского хом чка AY12 с использованием плазмиды pGT-Q097-l.

Лини  клеток почки человеческого эмбриона 293 была вз та из Американской коллекции типовых кул.ьтур под номером

0 допуска АТСС CRL 1573. Лини  аденовирус- трансформированных клеток сирийского хом чка AY12 также была вз та из АТСС № АТСС CPL 9595. Процедура трансформации клеток 293, как клеток-хоз ев описана ниже,

5 однако, указанна  процедура в основном, применима также клини м наиболее типичных зукариотических клеток, включа  клетки линии AY12, и к-векторам экспрессии насто щего изобретени .

0 Клетки 293 были получены из АТСС (под номером CPL 1573) в 25-мм 2-колбе, содержащей сплошной монослой около 5,5 х 106 клеток в минимальной поддерживающей среде Игла (Gibco)с 10% термо-инактипиро5 ванной лошадиной сыпороткой. Колбу инкубировали при 37°С, а среду мен ли два раз  в неделю. Среда состо ла из DM EM (Gibco), дополненной 10% околоплодной сывороткой ,.теленка, 50 мкг/мл гентамйцина, и 10

0 мкг/мл витамина Ki, фитонадионэ АквэМефитон R Merck Sharp & Dohme, Merck & Co.,

Jnc., West Point, PA, 19486). Клетки субc культивировали путем удалени  среды, промывани  сбалансированным солевым

5 раствором Хзнкса {Gibco), добавлени  в течение 1-2 мин 0,25% трипсина (содержащего 0,2 г/л ЭДТК), промывани  свежей средой и диспергировани  в новых колбах при отношении субкультивации 1:5 или 1:10.

0За день до трансформации клетки засевали при 0,7 х 10 клеток на 100-мм чашку. Стерильную, осажденную этанолом плазмидную ДНК, растворенную в воде, использовали дл  получени  2 х

5 ДНК-СаС 2-раствора. содержащего 25 мкг/мл трансформирующей плазмидной ДНК и 250 мМ CaCl2 2 х HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнкса) содержал 280 мМ fxlaCI, 50 мМ Нере и 1,5 мМ фосфата натри  с рН доведенным до 7,05-7,15. Раствор 2 х ДНК-С0С12 по капле добавл ли к равному объему стерильного 2 х HBSS. 1-мл стерильную пластиковую пипетку с ватной пробкой вставл ли о смесительную пробирку , содержащую 2 х HBSS и путем продувки вводили пузырькк добавл   при этом ДНК. После этого раствор оставл ли на 30-45 мин при комнатной температуре без перемешивани  дл  образовани  преципитата фосфат кальци -ДНК.

Затем полученный преципитат смешивали путем м гкого пипетировани  пластиковой пипеткой и 1 мл (на чашку) преципитата добавл ли непосредственно к 10 мл среды дл  выращивани , котора  покрывает клетки-реципиента. После 4-х часового инкубировани  при 37°С среду замен ли свежей средой: а клетки оставл ли дл  инкубации в течение еще 72 ч, а затем подавали селекционное давление. Дл  плззмид, которые не содержат селектируемый маркер, функционирующий в эукарио- тических клетках, трансформацию осуществл ют с использованием смеси плазмид: вектор экспрессии изобретени , в котором отсутствует селектируемый маркер , и вектор экспрессии, который содержит селектируемый маркер, функционирующий в эукариотических клетках. Дл  использовани  в такой системе совместной трансформации имеетс  р д подход щих векторов, например, плазмиды pSY2-dhfr (ATCC 37146) pSY2-neo (ATCC 37149), pSY2-gpt (ATCC 37145) и pSY2-hyg (NRRL В-18039). Плазмида pSY2-hyg несет вектор устойчивости к гидромицину В дл  эукариотических клеток-хоз ев. Указанна  техника совместной трансформации позвол ет осуществл ть отбор клеток, содержащих пла миду с селектируемым маркером. Затем эти клетки идентифицировали на содержание обеих трансформирующих плазмид. Изобретение также включает векторы экспрессии, содержащие селектируемый маркер дл  эукариотических клеток, и дл  них не требуетс  использовани  совместной трансформации ., . Дл  клеток, трансфицированных плаз- мидами, содержащими ген, несущий устой- чивость к гидромицину, такими, как плазмида pGT-Q097-h, к среде дл  культиви- рооани  добавл ли гидромицин В до получени  конечной концентрации около 200 мкг/мл. Затем клетки инкубировали при 37°С в течение 2-4 недель, мен   среду с интервалами 3-4 дн . Полученные гидроми- цин-устойчивые колонии переносили в отдельные колбы с культурой в цел х определени  их свойств. Плазмида pSY2- пео несет устойчивость к неомицину (вме-

сто неомицина также используют G418) и отбор на С418-устойчивые колонии осуществл ли , в основном в соответствии с процедурой отбора дл  гидромицин-устойчиоых

клеток, за исключением того, что G418 добавл ли до конечной концентрации 400 мкг/мл.

Использование гена гидрофолат-редук- тазы (dhfr) или производного dhfr-гена, не0 сущего устойчивость к метотрексату (dhfr-mtx), в качестве селектируемого маркера дл  введени  гена или плазмиды в линию клеток с дефицитом dhfr и последующее использование метотрексата дл  амплифици5 рооани  числа копий плазмиды известны. Клетки 293  вл ютс  dhfr- положительными , поэтому 293-трансформанты, включающие в себ  плазмиды, содержащие ген ghfr, не отбираютс  лишь на оснопе dhfr-положи0 тельного фенотипа, который способен к росту в среде, где отсутствуют гипоксантин и тимин. Лини  клеток, в которых отсутствует функциональный ген dhfr и которые  вл ютс  трансформированными dhfr-содержащи5 ми плазмидами, могут быть отобраны на основе, dhfr -фенотипа. М хот  процедура использовани  ghfr в качестве селектируемого и амплифицируемого маркера при dhfr-продуцирооании клеток еще недоста0 точно хорошо изучена, однако, в специальной литературе имеютс  свидетельства, что dhfr может быть использован в качестве селектируемого маркера и дл  амплификации гена при dhfr-продуцировании клеток. Изо5 бретение не ограничиваетс  селектируемым маркером, используемым в векторах экспрессии. Кроме того, могут быть использованы амплифицируемые маркеры, такие, как гены металлотионеина, гены аденозин0 деаминазы, или члены семейства множества генов устойчивости, представителем которого  вл етс , например, ген Р-гликоп- ротеина.

В результате трансформации линий кле5 ток 293 с использованием плазмид pGT- Q097-h, pGT-Q248-h, pGT-Q313-h и pGT-Q329-h получали р д трансформантоь. анализ этих трансформантов описан в примере 4.

0 Р р и м е р 4. Отбор клеток, секретиру- ющих мутанты зимогена человеческого белка С.

Гидромицин-устойчивые трансформанты , полученные в примере 3, культивирова5 ли на 100 мм чашках с тканевой культурой при плотности в несколько сотен клеточных клонов на чашку с тканевой культурой. Среду декантировали, а клетки дважды промывали 5-мл аликвотами сбалансированного солевого раствора Хэнкса (Gibco). Растоор

стерильного 0,45% агара (эгароза Сигма типа 4, каталожный номер А3643, Сигма Кеми- кал Компани, P.O.Box 14508, Сент-Луис. МО 63178) получали путем смешивани  1 мл 1,8%-но агара 47°С с 3 мл модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (ОМЕ) (Gibco)(37°C), и 2 мл полученного 0,45%-но- го агарового раствора наслаивали понерх клеток.

Нитроцеллюлозные фильтры (Sclileicher и Schuell. Jnc., Keene, NH 03431) кип тили, а затем автоклавмровали 2 ч в цел х удалени  смачиваемого агента, который  вл етс  токсичным дл  клеток. После чего фильтры Помещали поверх сло  аг ара, и после удалени  пузырьков ооздуха чашки инкубировали при 37°С в течение 1-3 ч. Затем фильтры, которые были предварительно помечены дл  указани  первоначальной ориентации их на чашках в цел х облегчени  последующей идентификации колоний, снимали и помещали в PBS (50 мМ Трис-HCI, рН 7,2, и 150 мМ NaCI).

Дл  поддержани  жизнеспособности , клеток, на чашках во врем  анализов на фильтрах, клетки покрывали 8 мл смеси, содержащей 2 мл 1,8%-ного агара (47°С), 2 мл ДМЕ-солевого раствора (37°С) и 4 мл ДМЕ- солевого раствора, содержащего 20%-ной околоплодной сыворотки толенка (37°С). Затем клетки помещали в инкубатор при 37°С.

Все промывки и реакции, проводимые на фильтрах,- осуществл ли, располага  фильтры на качающейс  платформе. Сначала фильтры блокировали путем инкубации при комнатной температуре в5%-ном молоке в PBS. Затем фильтры промывали (5 мин на промывку) в PBS четыре раза. После этого к фильтрам добавл ли 10 мкг/мл биоти- . нилированного козьего поликлонального антитела против белка С человека в 2,5%- ном альбумине бычьей сыворотки в количествах , достаточных дл  покрыти  фильтра. и проводили инкубацию при 37°С в течение 1ч.

Очистка белка С дл  его последующего использовани  в цел х получени  антитела против белка С, может быть осуществлена способом, описанным Kisi el, 1979, T.Clin, Invest. 64, 761. Поликлональное антитело может быть получено способом, описанным в Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, E.A. Kabat, опубл. в 1968 Холтом, Ринехартом и Уинстоном., Моно- клональное антитело, которое также пригодно дл  использовани  в анализе, может быть получено способом, раскрытым в работе Kohler и Milstein, 1975, Nature 256:495, или раскрытым в патенте США N; 4696895, публ. ЕРО N« 205046, Laurell и др., 1985,

FEB 191 (I), Sutukl и др., 1985, Т, Blochem 97:127-138, и ЕРО- публ, Ns 138222. Авидин D и биотинилированную пероксидазу хрена (HRP), используемого в анализе, получали в 5 Векстаотаин-ч наборе (Вектор лзборато- риез, Инк., 30 Ингоулд Роуд, Берличгем, СА 94010). Биотин был также получен из Вектор-лабораторий . Инк.

Фильтры четыре раза промывали PBS

0 при 4°С. Затем получали и добавл ли зви- дин D и биотилировэнную пероксидазу хрена в соответствии с инструкци ми, приложенными к набору Векстатасин (Вектор лабораториез). Фильтры инкубировали

5 с НРР-конъюгированным авидином D в течение 1 ч при 4°С (более длительное врем  инкубировзни , т.е. в течение ночи, может быть использовано при секретмронании небольших количеств белка), после чего филь0 тры четыре раза промывали PBS при 4°С.

Дл  про влени  на фильтрах окраски индикатора, к 50 мл PBS и 30 мкл 30% Н202 добавл ли около 30 мг НРР-окрашивающе- го реагента (4-хлоро-1-нафтол, Сигма), рас5 творенного в охлажденном льдом 100%--ом метаноле. Эту смесь добавл ли к нитроцел- люлозным фильтрам, которые инкубировали при комнатной температуре до тех пор, пока не по витс  окраска. Колонии, секре0 тирующие наибольшее количество зимоге- на человеческого белка С изобретени , будут отмечатьс  на фильтрах не только бо- лее ранним по влением окраски, но также и более темными п тнами на фильтре.

5 После по влени  окраски фильтры перегруппировывают с первоначальными чашками дл  определени  того, какие колонии с какими п тнами ассоциируютс  на фильтре. Колонии, секретирующие наиболь0 шее количество зимогена белка С изобретени , отбирают и используют дл  получени  зимогена.

При этом следует отметить, что описанный выше анализ просто иллюстрирует спо5 соб идентификации высокосекретирующих линий клеток. В способе изобретени  может быть с успехом использован целый р д методик анализа. Например, может быть использована реакци  с двойным антителом,

0 в которой биотинилированное козье антитело против белка С замен ют козьим антителом против белка С IgG и биотинилированным антителом против козьего IgG.

5 Зимогенные мутанты могут быть очищены от клеточных культур. Из клеток, экс- прессирующих рекомпинантный продукт, удал ют надосадочную жидкость и провод т очистку на колонке Farmacia Fastlow Трис-НС .(рН 7,4), 0,15 М NaCI, 5 мМ ЭДТК и 4 мМ бензамидина, Супернатант культуры доводили до рН 7,4 путем добаолени  Тристромбомодулин , затем измер ли амидоли- тическую активность продукта путем гидролиза трипептидного субстрата S-2366

: HCi (рН 8.0), и вводили 5 мМ ЭДТК и 4 мМ(полученного из лаб. Helena). Антикозгули бензамидина. Затем супернатант наносилирующую активность определ ли путем прона смолу а колонке и промывали 3 х объема-длени  периода действи  частично

ми колонки Трис-НС (оИ 7,4), 0,15 М Nad, 5 мМ ЭДТК, а затем 3-м  объемами колонки 20 мМ трис-НС, 0,15 М NaCI, и 4 мМ бензамидина . Рекомбииантный продукт элюиро- вали с колонки, использу  в качестве элюента буфер, содержащий 10 мМ CaCl2 в 20 мМ Трис-НС (рН 7,4), 0,15 М NaCI, 5 мМ бензамидина.

Специфическую активность продукта определ ли с помощью процедуры, описан- нойОПпеМидр,, 1987, B otechno ogy5:1189- 1192,следующим образом, Концентрированный и диализованный продукт элюата колонки сначала активировали иммобилизованным комплексом тромбинактивированного тромбопластина с использованием реагентов от лаборатории Helena.

Claims (2)

1. Формула изобретени  1. Способ получени  рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность со свойствами зимогенной формы белка.С, предусматривающий конструирование вектора, включающего область репликации, селективный маркер, промотор, нуклеотидную последовательность , кодирующую белок С, о т л и- ч а ю щ и и с   тем, что нуклеотидна  последовательность кодирует следующую аминокислотную последовательность:

   НЕТ TRP GUI LEU THR SER LEU LEU LEU PilE VAL ALA THR TRP GLY ILE

   SER GLY TJIR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE ЗЕЙ SER SER GLU ARG

   ALA HIS GLN VAL LEU ARC ILE ARG LYS ARG ALA ASM SER PILE LEU GLU

   GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

   ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLH ASN VAL ASP ASP THR LEU

   ALA PllE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GUI CYS LEU VAL LEU PRO

   LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LE U CYS CYS GLY HIS GLY Tim CYS ILE

   ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARC SER GLY TRP GLU OLY

   ARG Plffi CYS GLH ARG GLU VAL SER PilE LEU Rl CYS SER LEU ASP ASN

   r

   GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARC ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLH CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARC PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP Tim GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET. THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG

   TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PllE VAL HIS PRO R2 TYR SER LYS SER THR THR ASP ASH ASP ILE ALA LEU LEU HI

   LEU ALA GUI PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU

   тромбомодулин, затем измер ли амидоли- тическую активность продукта путем гидролиза трипептидного субстрата S-2366

   (полученного из лаб. Helena). Антикозгулиактивированного тромбопластина с использованием реагентов от лаборатории Helena.

   Формула изобретени  1. Способ получени  рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность со свойствами зимогенной формы белка.С, предусматривающий конструирование вектора, включающего область репликации, селективный маркер, промотор, нуклеотидную последовательность , кодирующую белок С, о т л и- ч а ю щ и и с   тем, что нуклеотидна  последовательность кодирует следующую аминокислотную последовательность:

   451838411 46

   PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARC GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU

   T.

   THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARC GLU LYS CLU ALA

   LYS ARC R3 ARO Tlffi Р1ГЕ VAL LEU ASN РКБ ILE LYS ILE PRO VAL VAL

   PRO HIS R4 GLU CYS SER GLU VAL НЕТ SER ASN MET VAL SER GLU ASN

   .. i- MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYSGLU GLY

   ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRPPHE LEU

   VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HISASN TYR

   GLY VAL TYR Tlffi LYS VAL SER ARG TYR LEU -ASP TRP ILE HIS GLY HIS

   ILE, АЯО ASP LYS GLU ALA PRO GLNLYS SER TPJ ALA PRO-COOH

   где R.1 - GLNiR2- ASM, Пз - ASN; R - ASN,
2. 2. Способ получени  зимогенмой формы

   полученные в результате сайт специфиче-. белка С человека, включэкщий траксфорского мутагенеза фрагментов-ДНК плэзмиды.мацию эукариотической хоз йской клетки

   рН PC-Q097 или pGT-Q097-h, или Ri -ASN,рекомбинантным пектором ДНК, содержаR2 - GLN, R2 - ASN, R4 - ASN, полученные в5 щим нуклеотидную последовательность, корезультате сайт специфического мутагенезадирующую аминокислотную

   фрагментов ДНК плазмиды pLPC-Q248, илипоследовательность полипептидэ со свой-pGT-Q248-h , или RI - ASN, R2 - ASN, Ra - GLN,ствами белка С человека, промотор, стиму R4-ASN , полученные в результате сайтспеци-лирующий экспрессию ДНК,

   фичсского мутагенеза фрагментов ДНК плаз-4 0 культивирование трансформированных клемиды pLPC-Q313 или плазмиды pGT-Q313-h,ток, выделение целевого продукта из кульили RI - ASN, R2 - ASN, RG - ASM, R - GLN,туры трансформированных клеток, отл и- ч

   полученные п результате сайт специфическогоа ю щ и и с   тем, что аминокислотна 

   мутагенеза фрагментов ДНК плазмиды pLPO-последовательность имеэт следующий

   . Q329 или плазмиды pGT-Q32.9-h.-{5 вид: MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PIffi VAL ALA T1LR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GUI VAL LEU ARC ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PIE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SЈR GLY TRP GLU GLY ARG PIffi CYS CLN ARG GLU VAL SER PHE LEU П1 CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

   SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PICE PRO CYS- GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS

   LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP Tlffi GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO

   TRP, GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA

   VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SEH LYS LYS LEU LEU VAL ARC LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARC ARC TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL РИЕ VAL HIS PRO R2 TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU. ALA GLN PRO ALA Tim LEU SER CLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU ;THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA

   LYS .AR. ARC THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS R4 GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN

   MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER Plffi HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP tYS GLU ALA PRO GItN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

   где Ri - GLN, R2 - ASN. Ra - ASN, RA -ASN группы следующих . клеток: 293/pL wmRi-ASN, R2-GLN, R3-ASN, R4-ASN, PS-Q097, . 293/pL PC-Q248, 293/pLPC- MflMRt-ASN.Rz-ASN, R3-GLN,R4-ASN, Q313, 293/pLPC-Q329, 293/pGT-Q097-h, или Ri-ASN. R2-ASN, R3 - ASN, R4-GLN. 293/pGT-Q248-h, 293/pGT-Q313-h и а трансформированную клетку выбирают из 5 293/pGT-Q329-h.

   Таблица1

   49

   1838411

   Клетк -хоз ин

   Происхождение

   HepG-2 CV-1 исход. LLC-MK2 LC-MK2 производное

   ЗТЗ СНО-К1

   Гепатобластома чел. Почка афр. зел. мартышки Почка макак-резуза

   ЭмОр. фибробласты

   мыши

   Яичник китайс. хом чка

   Чел. шеечный эпителий

   Миелома человека

   Гепатома крысы

   Мышиный

   фибробласт

   Клет. чел. Плазмоцитомы

   ВМК-21

   Почка-дитеныша хом чка

   т А м е р и ка i i с л л е к ц и   типовых культур, 12301 Парклаун Драйв, Рокьилль, Мэриленд 20852-1776. Таблица 4

   Определ ли путем делени  количестоа активированного белка С, определенного с помощью АРТТ-анализа на количество, определенное

   с помощью амидолитического анализа.

   Не определ ли. Относительна  амидолитич. активность по сравнению с нативным АРС, умноженна  на относительную антикоагулирующую активность.

   50 Таблица 2

   Таблица 3

   Источник

   Примечание

   АТСС # НВ 8065

   ATGC # CCL 70

   АТСС CCL7

   TCC#CCL7.1

   АТСС # CCL 92 АТСС#СС1 61

   АТСС #CCL 2 TCC#CCL 155

   ТСС# CRL 1600

   Эта лини  клеток

   описана в патенте

   США №4393133

   Растет быстрее, чем

   №CCL7ATCC Пролин-зависим.

   Производи. СНО-К1, такие, как dhfr - про- извод. DXB11, могут быть генерированы из этого хоз ина Секретирование легкой цепи 10G Я-типа

   Производные, такие, как 8-азагуанин-ус- тойчивые FAZA хоз йск . клетки, могут

   быть генерированы

   из этого хоз ина.

   ATCC#CCL10

   511838411

   Функциональна  активность (ед./мг)

   Примечание. Перва  цифра в скобках означает кратность увеличени  активности по сравнению с HP С, происход. из плазмь. Число независимых проб (п) определ ли с удвоением или утроением.

   Hind ML

   tui

   Stul

   Stul/Pvull Bel

   pLPG-Q097

   fyuz. 1

   52 Таблица 5

   Т а б л и ц-а 6

   Bell

   Pvull

   Bel

   Hindi

   StuI

   Stu

   Stul/Pvull

   Фиг. 2

   Hindlll

   StuI

   StuI

   Sttil/Pvull

   Фиг.з pLPC-Q313

   Bell

   Pvull

   Bel

   EcxiRI

   Bell

   Pvuli

   Hindi IГ

   tul

   Stui

   PLPC-Q329

   ФигЛ

   BCII

   Hindll

   TPUMLP

   BzmH Bglll

   BamHI

   Pvull

   Bell

   Stul/Pvull Bell Hindlll

   BzmH Bglll

   Bglll HintjIJ

   pGTC

   cpu 2. 5

   Hindlll Bcli

   Bglii

   Hindlll

   BamH

   Bgilf

   Bell Bglll Л jr Hindlll

   BamHl EcoRI

   BamHl Hindlll

   Bglll Hindlll

   Bglll

   Aatll