DK152138B - Fremgangsmaade til fremstilling af urokinase - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af urokinase Download PDFInfo
- Publication number
- DK152138B DK152138B DK212079AA DK212079A DK152138B DK 152138 B DK152138 B DK 152138B DK 212079A A DK212079A A DK 212079AA DK 212079 A DK212079 A DK 212079A DK 152138 B DK152138 B DK 152138B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- urokinase
- substrate
- cells
- phenylalanine
- yield
- Prior art date
Links
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 title claims description 28
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 title claims description 28
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 title claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 23
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 13
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 6
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 235000015898 miriam Nutrition 0.000 claims 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 4
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 3
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 3
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 3
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 3
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000577979 Peromyscus spicilegus Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003080 antimitotic agent Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- -1 tryptosis Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
i
DK 15213 8 B
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af urokinase.
Urokinase er et enzym, der er i stand til at omdanne plasminogen til plasmin. Enzymet har vist sig nyttigt som ak-5 tivator til fremskyndelse af lysen af blodkoagler.
Urokinase findes i ringe mængde i menneskelig urin, men man har beregnet, at isolering af enzymet fra denne kilde kræver mindst 1500 1 urin pr. klinisk dosis enzym.
Fornylig er urokinase blevet fremstillet ud fra kulturer 10 af nyreceller fra forskellige dyr som f.eks. musenyrer, babyhamsternyrer og specielle humane embryonale nyrer (HEK) celler. Det har vist sig, at urokinase isoleret fra HEK-celler dyrket i vævskulturer er identisk med urokinase fra urin. Barlo«/ og Lazer, Thromb. Res. 1 (3), 15 201-7 (1972).
Der er blevet foreslået forskellige metoder indtil nu til at forbedre fremstillingen af urokinase ved celledyrkningsmetoder. Ifølge en af metoderne beskrevet i USA patentbeskrivelse nr. 3 904 480 anvendes forskellige antimitotis-20 ke midler i celledyrkningssubstratet for at forøge udbyt tet af plasminogenaktivator (urokinase). I en anden løsning på problemet overdækkes nyrecellekulturen med fibrin for at forøge urokinaseudbyttet. Bernik og Kvi/aan, 3. Lab.
Clin. Med. 70, 650 (1967); 3. Clin. Invest. 48, 1740 25 (1969); 3. Clin. Invest. 52.’ 823 (1973). Andre materia ler der tidligere har været foreslået som tilsætning til celledyrkningssubstratet i specielle mængder for at forøge udbyttet af urokinase er pronase, sålédes som beskrevet i USA patentsbeskrivelse nr. 3 930 944 og glycin, så-30 ledes som beskrevet i USA patentbeskrivelse nr. 3 930 945.
2
DK 152138 B
Ert :yderligere metode til at forbedre fremstillingen af urokinase indebærer selektion af celler, der fremstiller enzymet, og fjernelse af ikke-producerende celler således som beskrevet af Barlow et al., "Production of Plasmino-5 gen Activator by Tissue Culture Techniques", i "Proteases and Biological Control", Cold Spring Harbor Conference on Cell Proliferation, Vol. 2, 1975, Cold Spring Harbor Lab.
(udg. Reich, Rifkin and Shaw), på side 325-31. Denne publikation angiver også, at tilsætningen af ekstra mængder 10 aminosyrer som f.eks. asparaginsyre og glutaminsyre ikke forøger produktionen af plasminogenaktivator, men at tilsætningen af plasminogen og andre proteaser forøgede udbyttet. USA patentbeskrivelse 3 930 940 omtaler ligeledes, at andre aminosyrer end glycin (ikke specificeret) har 15 ingen eller somme tider den modsatte virkning på fremstil lingen af urokinase.
Det har nu uventet vist sig, at udbyttet af urokinase ved anvendelse af bestemte yderligere mængder af den aromatiske aminosyre phenylalanin i nyrecelledyrkningssubstra-20 tet forøger udbyttet af urokinase til niveauer, der er væsentligt større, end man opnår med ækvivalente mængder glycin. Denne opdagelse er så meget mere overraskende som anvendelsen af yderligere mængder af visse andre aminosyrer som f.eks. asparaginsyre, glutaminsyre, methionin og 25 histidin giver lille eller ingen forøgelse i udbyttet af urokinase i forhold til, hvad man får uden anvendelse af nogen tilsætningsmængde overhovedet af disse aminosyrer.
Det bedrede udbytte med phenylalanin opnås på trods af den kendsgerning, at antallet af celler i kulturen (cel-30 ledensitet) formindskes i løbet af tiden.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.
DK 152138B
3 I en almen udførelsesform af opfindelsen dyrkes levende nyreceller, der vides at producere urokinase, i et passende dyrkningssubstrat ved ca. 35-37 °C i vævdyrkningskolber, indtil cellerne er sammenvoksede. Substrat 199 frem-5 stillet ved fremgangsmåden beskrevet Morgan, Morton og
Parker, Proc. Soc. Explt. Biol. Med. 73, 1 (1950) er et typisk velegnet vækstsubstrat. Dulbecco's modified Eagle substrat, McCoy’s substrat 5A, Waymouth's MB752/1 substrat, og lignende sådanne almindelige vævsdyrkningssubstrater 10 som f.eks. beskrevet af Morton, In Vitro 6 (2) 89-108 (1970) kan også anve.ndes'. Under vækstperioden forstærkes dyrkningssubstratet fordelagtigt med pattedyrserum f.eks. føtalt okseserum sædvanligvis i en mængde på ca. 5-15 rum-fang-% af subtratet.
15 Efter at cellerne er vokset til sammenflydning vaskes de med en fysiologisk acceptabel vaskeopløsning f.eks. pufret saltvand, og vaskevæsken erstattes herefter med et vedligeholdelsessubstrat.
Et vilkårligt vandigt næringssubstrat, der er kendt som 20 velegnet til vedligeholdelse af nyreceller og produktio nen af urokinase, kan anvendes. Fortrinsvis omfatter dette substrat lactalbuminhydrolysat, humant serumalbumin, glucose og natriumbicarbonat. Der kan også anvendes andre proteinhydrolysater end lactalbuminhydrolysat som f.eks.
25 trypton, tryptose, pepton og lignende materialer.
I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen suppleres vedligeholdelsessubstratet som nævnt med ca.
0,3-0,7 vægt-% phenylalanin for at opnå det ønskede forøgede udbytte af urokinase beskrevet ovenfor. Dette er 30 ækvivalent med ca. 60-140 gange mængden af phenylalanin i substrat 199. Fortrinsvis anvendes ca. 0,5 vægt-% phenylalanin i vedligeholdessubstratet. Niveauer i det væ-sdntlige over disse mængder anses for at være toxiske for cellerne.
4
DK 152138 B
Følgende eksempler illustrerer opfindelsen nærmere.
EKSEMPEL 1
Normale primære humane embryonale nyrer (HEK) celler leveret af Grand Island Biological Co. (GIBCO) i suspension 5 centrifugeredes og opslæmmedes i substrat 199 indeholden de 10 rumfang-* føtalt okseserum. Serumet er leveret af KC Biologicals, Inc., Lenexa, Kansas. Cellesuspensionen anvendtes til at pode 75 cm "Falcon" plastikkolber (T-75 kolber) indeholdende samme substrat i sådanne mængder, 10 at slutrumfanget af kulturen og celleidensiteten var i områderne henholdsvis 15-20 ml og 1,5-2,0 x 10^ celler pr. ml. Kolberne inkuberedes ved 37 °C i en inkubator med 5/ά CO^ i luften. Substratet i kolberne udskiftedes hver anden til tredje dag, indtil kulturen var vokset sammen.
15 Cellerne i hver kolbe vaskedes herefter med 25 ml steril fysiologisk normal saltvandsopløsning (Fischer Scientific Co., katalog nr. SO-S-442).
Efter fjernelse af vaskeopløsningen tilsattes 10 ml vedligeholdelsessubstrat bestående af 13,65 g pr. liter lac-20 talbuminhydrolysatsubstrat (GIBCO katalog nr. M-ll), 2,2 g pr. liter NaHCO^, 0,1 vægt-% humant serumalbumin (HSA) (Sigma Chemical Co., Katalog nr. A-2386), 0,1 vægt-°o D-glucose og 0,5 vægt-% L-aminosyre (enten phenylalanin, methionin, histidin eller glycin således som angivet ne-25 denfor i tabel 1). Vedligeholdelsessubstratet undersøgtes for urokinasetiter og fornyedes dagligt med 10 ml af det samme friske vedligeholdelsessubstrat. Efter afslutning af fjerde dag af celledyrkningsperioden fjernedes substratet, og cellerne i hver kolbe vaskedes med 25 ml saltvands-30 opløsning adskillige gange, og blev herefter nedbrudt med IN NaOH opløsning. DNA (deoxyribonucleinsyre) undersøgelse foretoges herefter, idet DNA-indholdet af HEK-celler blev bestemt ved den sædvanlige standard på 9^ug (mikrogram)
DK 15213 8 B
5 DNA = 10^ celler. Uroikipasetiter i tabel 1 udtryktes i ml pr. dag pr. ^ug DNIA.
Urokinaseforsøget foretoges ved ep 2-trins iodidbehandlet fibrin-plademetode. I det første trip virker urokinase på 5 plasminogen under dannelse af plasmin. I det andet trin hydrolyser-er plasmiinvet herefter et radioaktivt mærket koa-guleret f ibr image n (fibrin) for at frigøre I-fibrino-pegtirier ud i espiiørstningen, der måles i en gammatæller. Ur®kinas£:aiktdvitte±ieitn sammeimlignes herefter med den radio-10 aktive aktivitet·, der er frigjort i aplas-nim-gem. En enhed urøkimaseaktivitet defineres som -den mængde enzym, der hy-idriolysereT i micrjagsram fibrin p;r.. time. Denne forsøgspro-ceidiiire stammer fra em aimiLmcde 1 itg metode til måling af cellef akt or-ak tivitiet baseret på .filkrinOlyse af en ^^I-fi-15 bTin-pirBide beskrevet fa-f ililmikeless -et al., J. Exptl. Med.
157 (1), .85-111 (1975) ag en almindelig metode til iodid-behandling af fibrinogen således som beskrevet af Helm-kamp et al, Cancer Res.. 20, 1495-1500 (1960).
TABEL 1 20 Urokinase titer DNA11
Aminosyre dag 1 dag 2 dag 5 dag 4 yug
Phenylalanin 57,85 46,8 55,55 57,2 80,95
Methionin 15,5 7,2 7,6 10,4 79,0
Histidin 11,9 12,6 15,5 8,2 71,5 25 Glycin 10,7 11,4 16,4 55,5 67,8
Slut DNA-indhold af cellerne i hver kolbe efter fire dages dyrkning i vedligeholdelsessubstrat.
DK 15213 8 B
6 EKSEMPEL 2
Normale primære HEK-celler dyrkedes til de var sammenflydende i T-75 kolber således som beskrevet i eksempel 1 ovenfor, og man vaskede på samme måde i sterilt saltvandsopløsning, som fjernedes.
30 ml vedligeholdelsessubstrat sattes til hver kolbe. Substratet forsynedes med frisk substrat til de samme 30 ml rumfang hver tredje dag. Efter ni dages dyrkning i vedligeholdelsessubstratet nedbrydes cellerne til DNA-for-søg, og urokinase-titer bestemtes således som beskrevet i eksempel 1.
I dette eksempel bestod vedligeholdelsessubstratet af 13,75 g pr. liter lactalbumin-hydrolysesubstrat, 2,2 g pr. liter NaHCO^ og 0,1 vægt-% D-glucose. Aminosyre og/ eller HSA sattes til det basale vedligeholdelsessubstrat til den ønskede slutkoncentration (vægt-%) således som vist i tabel 2 nedenfor. Som i eksempel 1 bestemmes uro-kinaseaktiviteterne pr. ml pr. dag pr.^ug DNA.
TABEL 2
Urokinase titer Total DNA*
Tilsætninger dag 3 dag 6 dag 9 ^ ingen 6,1 3,6 3,1 285,8 0,1% HSA 13,5 7,4 4,8 298,5 0,1% HSA + 0,3% Gly. 22,4 11,9 11,7 308,3 0,1% HSA + 0,5% Gly. 26,3 24,8 17,0 264,0 0,1% HSA + 0,3% Phe 22,2 25,6 16,4 223,8 0,1% HSA + 0,5% Phe 61,2 35,6 36,3 126,0 0,3% Gly 13,1 14,0 7,4 287,0 0,5% Gly 27,2 10,5 9,0 296,3 0,3% Phe 24,4 16,1 10,1 205,5 0,5% Phe_ 46,7 27,0 19,9 118,8
Claims (3)
1. Fremigaimgsmå'de til fremstilling af urokinase ved dyrkning .af levende nyreceller i et vandigt næringssubstrat 15 indeholdende aminosyrer, kendetegnet ved, at næringssubstratet indeholder phenylalanin i en mængde på ca. 0,3 til ca. 0,7 vægt-%.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at phenylalanin anvendes i en mængde på ca. 0,5 20 vægt-%.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at cellerne er normale primære humane embryonale nyreceller.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US90913778 | 1978-05-24 | ||
| US05/909,137 US4190708A (en) | 1978-05-24 | 1978-05-24 | Production of urokinase |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK212079A DK212079A (da) | 1979-11-25 |
| DK152138B true DK152138B (da) | 1988-02-01 |
| DK152138C DK152138C (da) | 1988-08-08 |
Family
ID=25426682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK212079A DK152138C (da) | 1978-05-24 | 1979-05-23 | Fremgangsmaade til fremstilling af urokinase |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4190708A (da) |
| EP (1) | EP0005644B1 (da) |
| JP (1) | JPS54163887A (da) |
| AU (1) | AU522609B2 (da) |
| CA (1) | CA1114761A (da) |
| DE (1) | DE2965182D1 (da) |
| DK (1) | DK152138C (da) |
| HU (1) | HU179549B (da) |
| MX (1) | MX5901E (da) |
| SU (1) | SU927126A3 (da) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8003402A (nl) * | 1980-06-11 | 1982-01-04 | Leuven Res & Dev Vzw | Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking. |
| JPS5852634B2 (ja) * | 1980-12-05 | 1983-11-24 | 株式会社林原生物化学研究所 | ウロキナ−ゼの製造法 |
| US4659655A (en) * | 1981-11-25 | 1987-04-21 | Bio-Response, Inc. | Method for isolating product-producing cells |
| US5112755A (en) * | 1982-04-15 | 1992-05-12 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human urokinase proteins |
| US5185259A (en) * | 1982-05-05 | 1993-02-09 | Genentech, Inc. | Truncated human tissue plasminogen activator |
| US4853330A (en) * | 1983-04-07 | 1989-08-01 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
| US4766075A (en) * | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
| FI831484L (fi) | 1982-05-05 | 1983-11-06 | Genentech Inc | Plasminogen aktivator foer maenskovaevnad |
| ZA833174B (en) * | 1982-05-05 | 1984-08-29 | Genentech Inc | Human tissue plasminogen activator |
| US5011795A (en) | 1983-01-19 | 1991-04-30 | Genentech, Inc. | Human tPA production using vectors coding for DHFR protein |
| US4550080A (en) * | 1984-06-05 | 1985-10-29 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for the preparation of a plasminogen activator |
| US5132214A (en) * | 1986-04-09 | 1992-07-21 | Monsanto Company | Large scale production of plasminogen activator from normal human colon cells |
| US4927630A (en) * | 1986-02-26 | 1990-05-22 | Monsanto Company | Tissue plasminogen activator from normal human colon cells |
| US4751084A (en) * | 1986-02-26 | 1988-06-14 | Monsanto Company | Tissue plasminogen activator from normal human colon cells |
| US4851517A (en) * | 1986-02-26 | 1989-07-25 | Monsanto Company | Tissue plasminogen activator oligosaccharide from normal human colon cells |
| US4920051A (en) * | 1988-02-03 | 1990-04-24 | Damon Biotech, Inc. | Recovery of urokinase compounds |
| JP2548915Y2 (ja) * | 1991-04-02 | 1997-09-24 | カヤバ工業株式会社 | 重量物の支持装置 |
| CN110607272B (zh) * | 2019-09-23 | 2022-11-01 | 山东甲骨文生物科技有限公司 | 一种哺乳动物细胞培养液的添加剂及细胞培养液 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2930945A (en) * | 1956-08-16 | 1960-03-29 | Vickers Inc | Power transmission |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3904480A (en) * | 1972-10-24 | 1975-09-09 | Lilly Co Eli | Enhanced production of plasminogen activator |
| US3930944A (en) * | 1975-03-31 | 1976-01-06 | Abbott Laboratories | Urokinase production |
| AR208001A1 (es) * | 1975-03-31 | 1976-11-22 | Abbott Lab | Procedimiento mejorado para la produccion de uroquinasa |
-
1978
- 1978-05-24 US US05/909,137 patent/US4190708A/en not_active Expired - Lifetime
-
1979
- 1979-05-22 EP EP79300902A patent/EP0005644B1/en not_active Expired
- 1979-05-22 DE DE7979300902T patent/DE2965182D1/de not_active Expired
- 1979-05-23 HU HU79MO1050A patent/HU179549B/hu not_active IP Right Cessation
- 1979-05-23 DK DK212079A patent/DK152138C/da not_active IP Right Cessation
- 1979-05-23 CA CA328,201A patent/CA1114761A/en not_active Expired
- 1979-05-23 MX MX797995U patent/MX5901E/es unknown
- 1979-05-23 SU SU792767757A patent/SU927126A3/ru active
- 1979-05-23 AU AU47343/79A patent/AU522609B2/en not_active Expired
- 1979-05-23 JP JP6276979A patent/JPS54163887A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2930945A (en) * | 1956-08-16 | 1960-03-29 | Vickers Inc | Power transmission |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU4734379A (en) | 1979-11-29 |
| EP0005644A2 (en) | 1979-11-28 |
| JPS54163887A (en) | 1979-12-26 |
| AU522609B2 (en) | 1982-06-17 |
| JPS629319B2 (da) | 1987-02-27 |
| US4190708A (en) | 1980-02-26 |
| EP0005644A3 (en) | 1979-12-12 |
| DK212079A (da) | 1979-11-25 |
| EP0005644B1 (en) | 1983-04-13 |
| CA1114761A (en) | 1981-12-22 |
| MX5901E (es) | 1984-08-22 |
| SU927126A3 (ru) | 1982-05-07 |
| DE2965182D1 (en) | 1983-05-19 |
| DK152138C (da) | 1988-08-08 |
| HU179549B (en) | 1982-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK152138B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af urokinase | |
| Bowman et al. | Primary culture of microvascular endothelial cells from bovine retina: selective growth using fibronectin coated substrate and plasma derived serum | |
| Jones et al. | A novel mode of arbovirus transmission involving a nonviremic host | |
| Robbins et al. | Studies on the Cultivation of Poliomyelitis Viruses in Tissue Culture: II. The Propagation of the Poliomyelitis Viruses in Roller-Tube Cultures of Various Human Tissues | |
| US4356261A (en) | Anti-invasion factor containing cultures | |
| Davison et al. | Human dermal microvascular endothelial cells in vitro: effect of cyclic AMP on cellular morphology and proliferation rate | |
| Carrel | Tissue culture and cell physiology | |
| Mills et al. | Long-term culture of cells from bone affected by Paget’s disease | |
| CN102787094B (zh) | 培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法 | |
| JP2007537760A (ja) | インフルエンザワクチンを製造するためのプロセス | |
| US3699222A (en) | Production of viral interfering substances | |
| EP2718421B1 (en) | Engineered living tissue substitute | |
| CN106497872A (zh) | 骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法和应用 | |
| Delbruck et al. | In-Vitro Culture of Human Chondrocytes From Adult Subjectsm | |
| JPH0630610B2 (ja) | 組み換え蛋白質の生産 | |
| Li et al. | An improved two-step method for extraction and purification of primary cardiomyocytes from neonatal mice | |
| CN103103157A (zh) | 一种非接触式细胞三维共培养方法 | |
| CN119307439B (zh) | 一种对皮肤组织进行体外3d细胞模型构建的培养基和方法 | |
| CN109609435A (zh) | 一种中华绒螯蟹血细胞的培养基及其培养方法 | |
| Maurizi et al. | Morphological and functional characteristics of human temporal-bone cell cultures | |
| CN108823154A (zh) | 一种脂肪干细胞的无血清培养基及其制备方法 | |
| CA2006685C (en) | Production of horseshoe crab amebocytes in vitro | |
| CN102517250B (zh) | 兔软骨下骨成骨细胞体外扩增培养方法及应用 | |
| Schor et al. | Inhibition of endothelial cell morphogenetic interactions in vitro by alpha-and beta-xylosides | |
| CN104726407A (zh) | 一种利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |