CN104946587B - 一种淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种淋巴细胞无血清培养基，组成如下：基础培养基、10mg/L转铁蛋白、0.01mg/L亚硒酸钠、110mg/L丙酮酸、1.5mg/L乙醇胺、10mg/L胰岛素、10mg/L-30mg/L谷氨酰胺替代物、300mg/L脂质型牛血清蛋白、0.001mg/L硫酸铜、0.0005mg/L偏钒酸铵、0.00005mg/L二氯化锰、0.8mg/L硫酸锌、2mg/L维生素E、100mg/LPHA和10-25mMHEPES/NaHCO3缓冲系统。本发明还提供了该培养基的制备方法和在淋巴细胞培养中的应用。该培养基能提高淋巴细胞培养的重复性，避免血清对细胞毒性和污染，利于淋巴细胞的分化，获得多分裂相。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用。
背景技术
遗传病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。有先天性的，如先天愚型、多指(趾)、先天性聋哑、血友病等，也有后天通过基因突变和染色体病变引起的。遗传病分为三大类，其一是染色体病或染色体综合征，其二是单基因病，第三是多基因病，目前已发现的遗传病超过3000种，估计每100个新生儿中约有3～10个患有各种程度不同的遗传病。遗传病涉及的学科很多，包括妇产科学－不孕不育、优生优育、内分泌紊乱；血液病学－慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴细胞性白血病等；儿科学－出生缺陷；肿瘤学；内科学－放射病、染色体断裂综合征等，具有先天性、终生性和家族性、病种多、发病率高等特点。临床常见的高血压、糖尿病、哮喘、癌症、忧郁症、老年痴呆等与遗传有关。
目前，对于遗传病的诊断主要采用的还是细胞遗传学的方法，即染色体核型分析。染色体核型分析是根据染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体的有无等特征，并借助染色体分带技术对某一生物的染色体进行分析，比较，排序，编号，是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、型态与功能之间的关系所不可缺少的重要手段。染色体核型分析也是临床上广泛开展的对遗传病进行诊断的一种基本方法，经核型分析后，可以根据染色体结构和数目的变异来判断生物的病因，比如是由于缺少了什么样的基因才导致的这种疾病。因此染色体核型分析在遗传病的诊断和筛查上具有重要意义。
染色体核型分析的原理和基本过程：利用PHA(植物血凝素)刺激成熟的淋巴细胞再次分裂；利用秋水仙素在细胞分裂中期破坏纺锤丝，抑制细胞分裂，形成染色体的形态；通过胰酶消化或缓冲液作用，将染色体显带，通过带纹和数目的分析判断染色体数目和结构的情况。从以上原理可以看出，染色体核型分析技术的关键是培养出合格的淋巴细胞。
传统的淋巴细胞培养基组成：基础培养基(RP1640培养基)、抗菌素、小牛血清(或者胎牛血清)、淋巴细胞刺激因子等组成。但是这种培养基含有小牛血清，成分复杂，有效期短，容易出现病毒、真菌、支原体等污染，并且血清质量标准难以统一，这对大批量配制、生产来说，很容易造成配制的质量培养基不稳定；并且胎牛血清以及小牛血清市价越来越贵。
为了降低成本，明确培养基成分，减少病毒、支原体等的污染，已有改良的培养基的研究报道，基本上就是在基础培养基的基础上添加生长因子、脂肪酸、转铁蛋白等。例如：中国专利申请CN03147874.3公开了用于培养淋巴细胞的无血清培养基，包含了下列组分：基本培养基、白介素-2、脂肪酸、胆固醇、甘油酯、转铁蛋白，其中基础培养基是McCoy’s5A改良的Eagle培养基与Ham’s-F12培养基以1∶1的比例混合而形成的培养基，Dulbecco改良的Eagle培养基与Ham’s-F12培养基以1∶1的比例混合而形成的培养基，或Iscove改良的Dulbecco培养基，该专利通过加入脂肪酸、IL-2、胆固醇、甘油酯、转铁蛋白来代替血清；中国专利申请201310082166公开了一种无动物源的淋巴细胞无血清培养基，其必要组成为IMDM、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、重组人胰岛素、人转铁蛋白、人血清白蛋白、2-巯基乙醇、N-乙酰-半胱氨酸、脂质、氨基酸、维生素、微量元素、柠檬酸铁、氢化可的松、乙醇胺、非必需氨基酸，该专利通过一些激素、氨基酸、脂质、人转铁蛋白、人血清白蛋白等代替血清。
上述各类培养基含有L-谷氨酰胺，容易降解产生胺，对细胞具有一定毒性；此外谷氨酰胺是体外培养动物细胞的主要能源，缺乏时可导致细胞生长不良甚至死亡。因此，上述培养基在保存一段时间后对细胞培养不稳定，可重复性差。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术问题，提供一种淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用。该培养基成分明确，能够提高淋巴细胞培养和实验的重复性，避免血清对细胞毒性和血清源性污染，避免血清组分对实验研究的影响，利于体外培养淋巴细胞的分化，获得分裂相多的淋巴细胞培养基及其配方。
为实现本发明的目的，按如下方案实施：
本发明的淋巴细胞无血清培养基由以下成分组成：基础培养基、转铁蛋白、亚硒酸钠、丙酮酸、乙醇胺、胰岛素、谷氨酰胺替代物、脂质型牛血清蛋白、硫酸铜、偏钒酸铵、二氯化锰、硫酸锌、维生素E、PHA和HEPES/NaHCO3缓冲系统；所述成分的浓度分别为：所述转铁蛋白10mg/L；所述亚硒酸钠0.01mg/L；所述丙酮酸110mg/L；所述乙醇胺1.5mg/L；所述胰岛素10mg/L；所述谷氨酰胺替代物10mg/L-30mg/L；所述脂质型牛血清蛋白300mg/L；所述硫酸铜0.001mg/L；所述偏钒酸铵0.0005mg/L；所述二氯化锰0.00005mg/L；所述硫酸锌0.8mg/L；所述维生素E2mg/L；所述植物血球凝集素(PHA)100mg/L；所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)/NaHCO310-25mM，所述基础培养基为1640培养基。
优选的，所述谷氨酰胺替代物为丙氨酰谷氨酰胺和蛋氨酸脑啡肽的混合物。
优选的，所述丙氨酰谷氨酰胺和所述蛋氨酸脑啡肽的浓度比例为1:1。
优选的，所述丙氨酰谷氨酰胺的浓度为10mg/L，所述蛋氨酸脑啡肽的浓度为10mg/L。
优选的，淋巴细胞无血清培养基各个组分以及浓度如表1所示。
表1
本发明还提供了一种制备上述培养基的方法，按如下操作进行：取如上所述培养基的组分，加入超纯水中，使各组分充分溶解；加入超纯水定容，过滤除菌。
本发明还提供了上述培养基在淋巴细胞培养中的应用。
本发明的淋巴细胞无血清培养基中含有硒、铜、锰、钒、锌等微量元素，通过协同作用，能够显著增加细胞克隆和分裂相细胞数。各种微量元素使用量：亚硒酸钠0.01mg/L、硫酸铜0.001mg/L、偏钒酸铵0.0005mg/L、二氯化锰0.00005mg/L、硫酸锌0.8mg/L，对淋巴细胞生长、增殖有较好的效果。
本发明的淋巴细胞无血清培养基中含有抗氧化剂维生素E，能降低活性氧ROS浓度，促进淋巴细胞的克隆和增殖。
本发明的淋巴细胞无血清培养基中含有PHA，能够刺激淋巴细胞活化，明显增加分裂相数量。
本发明含有丙氨酰谷氨酰胺和蛋氨酸脑啡肽混合物，能刺激淋巴细胞活性明显增高，在培养基中对淋巴细胞的生长产生巨大刺激作用，并对细胞本身无任何毒副作用，其混合物使用量少，但是效果要比各自单独使用效果更佳。
本发明淋巴细胞无血清培养基效果显著改进，淋巴细胞克隆数和分裂相明显增加，提高淋巴细胞分化，充分发挥了丙氨酰谷氨酰胺和蛋氨酸脑啡肽混合物、PHA的作用，可以培养得到大量充分的处于分裂相的淋巴细胞，能够满足临床诊断和科研的要求。
具体实施方式
实施例1：不同配方的培养基培养效果比较
1、配制基础培养基SSF-1：配制1L基础培养基1640培养基，添加2gNaHCO3，5gHEPES，110mg丙酮酸，1.5mg乙醇胺，10mg转铁蛋白，10mg胰岛素，300mg脂质型牛血清蛋白，0.1gPHA。
2、配制SSF-2培养基：取1份基础培养基SSF-1，添加2mg维生素E。
3、配制SSF-3培养基：取1份基础培养基SSF-1，添加2mg维生素E，添加终浓度为0.01mg/L亚硒酸钠。
4、配制SSF-4培养基：取1份基础培养基SSF-1，添加2mg维生素E，添加终浓度为0.01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0.00005mg/L二氯化锰。
5、配制SSF-5培养基：取1份基础培养基SSF-1，添加2mg维生素E，添加终浓度为0.01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0.00005mg/L二氯化锰，终浓度为0.8mg/L硫酸锌。
6、配制SSF-6培养基：取1份基础培养基SSF-1，添加2mg维生素E，添加终浓度为0.01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0.00005mg/L二氯化锰，终浓度为0.8mg/L硫酸锌，终浓度为0.0005mg/L偏钒酸铵。
7、配制SSF-7培养基：取1份基础培养基SSF-1，添加2mg维生素E，添加终浓度为0.01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0.00005mg/L二氯化锰，终浓度为0.8mg/L硫酸锌，终浓度为0.0005mg/L偏钒酸铵，终浓度为0.001mg/L硫酸铜。
8、配制SSF-8培养基：取1份基础培养基SSF-1，添加2mg维生素E，添加终浓度为0.01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0.00005mg/L二氯化锰，终浓度为0.8mg/L硫酸锌，终浓度为0.0005mg/L偏钒酸铵，终浓度为0.001mg/L硫酸铜，终浓度为30mg/L丙氨酰谷氨酰胺。
9、配制SSF-9培养基：取1份基础培养基SSF-1，添加2mg维生素E，添加终浓度为0.01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0.00005mg/L二氯化锰，终浓度为0.8mg/L硫酸锌，终浓度为0.0005mg/L偏钒酸铵，终浓度为0.001mg/L硫酸铜，终浓度为30mg/L蛋氨酸脑啡肽。
10、配制SSF-10培养基：取1份基础培养基SSF-1，添加2mg维生素E，添加终浓度为0.01mg/L亚硒酸钠，终浓度为0.00005mg/L二氯化锰，终浓度为0.8mg/L硫酸锌，终浓度为0.0005mg/L偏钒酸铵，终浓度为0.001mg/L硫酸铜，终浓度为10mg/L蛋氨酸脑啡肽，终浓度为10mg/L丙氨酰谷氨酰胺。
11、以上培养基用盐酸/氢氧化钠溶液或者冲入二氧化碳调节pH至7.2。调节pH值后，0.22μm滤膜过滤除菌。
12、外周血淋巴细胞培养、染色体制片：
(1)采血：在采血者的肘部用碘伏棉签消毒皮肤两遍，取1ml一次性灭菌注射器，从肘部静脉采血1ml。
(2)培养：在酒精灯上将针头直接从橡皮塞(已用碘伏消毒)上插入，将血液缓缓滴入装有5ml1640培养基的瓶内，每瓶0.5ml，轻轻摇动，置于37℃温箱中培养68-72小时。
(3)秋水仙素处理：终止培养前4小时，在一瓶培养瓶内加入25μl/ml秋水仙素0.05ml，轻轻摇匀，继续培养4小时。2小时后在另一培养瓶内加入80μl/ml秋水仙素0.05ml，轻轻摇匀，继续培养2小时。这样使细胞分裂停止在中期。
(4)离心：在室温下将培养物移入10ml刻度离心管内，1500转/分离心10分钟，吸去上清液，留底层离心沉淀物。
(5)低渗处理：加入8ml预温(37℃)的0.075MKCl低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，放回37℃温箱中低渗30分钟。这样可以使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞解体。
(6)预固定：低渗30分钟后将培养物取出，加入新配制的固定液(甲醇：冰醋酸为3：1)1ml，吹打均匀。
(7)再离心：1500转/分离心10分钟，吸去上层液，保留沉淀物。
(8)固定：沿离心管管壁加入固定液7ml，用吸管将底部沉淀物打匀，室温固定30分钟。
(9)再离心：1500转/分离心10分钟，弃去上清液。
(10)再固定离心：加入固定液7ml，打匀，1500转/分离心10分钟，弃去上清液。
(11)重复步骤(10)一次。
(12)五次固定：加入固定液0.5-1ml，打匀制成细胞悬液。
(13)制片：用滴管吸细胞悬液，滴在已用4-6℃冰水浸泡的洁净载玻片上，促使细胞平铺于载玻片上。然后立即放入80℃恒温干燥箱中烤片15分钟。
(14)染色：Giemsa染色。
13、血液样品采集，种血72小时后，进行染色体制片，结果见表2，表2为各配方培养基对外周血淋巴细胞培养效果比较。
表2
备注：
淋转率(转化淋巴细胞百分数)＝转化细胞百分数/总淋巴细胞数量×100％；
分裂指数＝分裂细胞数/(淋巴细胞总数-分裂细胞数)×100％；
CV(变异系数)表示淋巴细胞培养效果的离散程度。
实验结果：各组培养基细胞生长旺盛，从表中结果可以看出维生素E能能够促进淋巴细胞的克隆和增殖，添加亚硒酸钠利于淋巴细胞生长，在其它元素(硫酸铜、偏钒酸铵、二氯化锰、硫酸锌)共同作用对淋巴细胞生长、增殖效果更好。但是单一添加其它一种或者几种微量元素，对淋巴细胞增殖效果影响不大。在此基础上加入丙氨酰谷氨酰胺或者蛋氨酸脑啡肽，淋巴细胞增殖效果更佳，培养效果更佳稳定；同时使用丙氨酰谷氨酰胺和蛋氨酸脑啡肽混合物，其使用量减少，但是效果比单独使用效果更好。丙氨酰谷氨酰胺、蛋氨酸脑啡肽能刺激淋巴细胞活性明显增高的作用，在培养基中对淋巴细胞的生长产生巨大刺激作用，并对细胞本身无任何毒副作用。
实施例2：淋巴细胞无血清培养基配制
1、材料：转铁蛋白、胰岛素、维生素E、亚硒酸钠、二氯化锰，由Sigma公司提供；硫酸锌、偏钒酸铵、硫酸铜、HEPES、NaHCO3、乙醇胺，由上海生工工程生物提供；1640干粉、脂质型牛血清蛋白、丙氨酰谷氨酰胺，由GIBCO公司提供；蛋氨酸脑啡肽，由PentaBiotechInc公司提供。
2、设备：pH计，搅拌器。
3、配制方法：
(1)100×亚硒酸钠母液配制：称取10mg亚硒酸钠，溶于1000ml超纯水中。
(2)偏钒酸铵母液配制：称取50mg偏钒酸铵，溶于1000ml超纯水中；然后量取10ml溶液，加入990ml超纯水，即得到偏钒酸铵母液。
(3)二氯化锰母液母液配制：称取50mg二氯化锰，溶于1000ml超纯水中；然后量取1ml溶液，加入990ml超纯水，即得到二氯化锰母液母液。
(4)硫酸铜母液配制：称取10mg硫酸铜，溶于100ml超纯水中；然后量取10ml溶液，加入990ml超纯水，即得到硫酸铜母液。
(5)10×硫酸锌母液配制：称取80mg硫酸锌，溶于100ml超纯水中。
(6)配制1L淋巴细胞无血清培养基：根据表1组分以及含量浓度配制。
按照质量称取各组分：PRMI-1640干粉10.45g培养基，2gNaHCO3，5gHEPES，10mg转铁蛋白，10mg胰岛素，300mg脂质型牛血清蛋白，0.1gPHA，2mg维生素E，10mg丙氨酰谷氨酰胺，10mg蛋氨酸脑啡肽，称取完后加入500ml超纯水；完全溶解后加入100μl丙酮酸，1.5μl乙醇胺，1ml亚硒酸钠母液，1ml硫酸锌母液，1ml偏钒酸铵母液，1ml硫酸铜母液，1ml二氯化锰母液；盐酸/氢氧化钠溶液或者冲入二氧化碳调节pH至7.2，最后用超纯水定容至1L并0.22μm滤膜过滤除菌。
实施例3：淋巴细胞无血清培养与传统含牛血清的淋巴细胞培养基的培养效果比较
选取在广州市场上传统含有牛血清的淋巴细胞培养基最常见的两个品牌，自编号为DH和YSJ。取血液样品，分别将上述两个品牌以及本发明的产品中滴入同一个人的血液0.5ml，细胞培养、染色体制片。结果见表3，表3为淋巴细胞无血清培养基与传统含牛血清的淋巴细胞培养基的培养效果比较结果。
表3
备注
淋转率(转化淋巴细胞百分数)＝转化细胞百分数/总淋巴细胞数量×100％；
分裂指数＝分裂细胞数/(淋巴细胞总数-分裂细胞数)×100％；
CV(变异系数)表示淋巴细胞培养效果的离散程度。
由表3结果可见：淋巴细胞无血清培养基培养效果与传统含血清的淋巴细胞培养基相比，细胞生长和增殖效果更好，并且培养效果的稳定性明显好于含血清培养基。
Claims (5)
1.一种淋巴细胞无血清培养基，其特征在于，由以下成分组成：基础培养基、转铁蛋白、亚硒酸钠、丙酮酸、乙醇胺、胰岛素、谷氨酰胺替代物、脂质型牛血清蛋白、硫酸铜、偏钒酸铵、二氯化锰、硫酸锌、维生素E、植物血球凝集素(PHA)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)/NaHCO3缓冲系统；所述谷氨酰胺替代物为丙氨酰谷氨酰胺和蛋氨酸脑啡肽的混合物；
所述各成分的浓度分别为：所述转铁蛋白10mg/L；所述亚硒酸钠0.01mg/L；所述丙酮酸110mg/L；所述乙醇胺1.5mg/L；所述胰岛素10mg/L；所述谷氨酰胺替代物10mg/L-30mg/L；所述脂质型牛血清蛋白300mg/L；所述硫酸铜0.001mg/L；所述偏钒酸铵0.0005mg/L；所述二氯化锰0.00005mg/；L所述硫酸锌0.8mg/L；所述维生素E2mg/L；所述植物血球凝集素(PHA)100mg/L；所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)/NaHCO3缓冲系统10-25mM，所述基础培养基为1640培养基。
2.根据权利要求1所述的淋巴细胞无血清培养基，其特征在于，所述丙氨酰谷氨酰胺和所述蛋氨酸脑啡肽的浓度比例为1:1。
3.根据权利要求1所述的淋巴细胞无血清培养基，其特征在于，所述丙氨酰谷氨酰胺的浓度为10mg/L，所述蛋氨酸脑啡肽的浓度为10mg/L。
4.一种制备权利要求1-3之一所述培养基的方法，其特征在于，按如下操作进行：取如权利要求1-3之一所述培养基的组分，加入超纯水中，使各组分充分溶解；加入超纯水定容，过滤除菌。
5.权利要求1-3之一所述培养基在淋巴细胞培养中的应用。
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Legal Events
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Denomination of invention: A serum free lymphocyte culture medium and its preparation method and application Effective date of registration: 20230724 Granted publication date: 20160217 Pledgee: Bank of China Limited Guangzhou Yuexiu Branch Pledgor: GUANGZHOU DAHUI BIO-TECH Co.,Ltd. Registration number: Y2023980049416 |