CN108473954A - 使用往复运动搅拌装置的血小板的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种方法,是血小板的制造方法,其包括在培养容器内的培养液中培养巨核细胞的工序,在该培养工序中,使搅拌叶片往复运动来搅拌培养液。
Description
技术领域
本发明涉及使用搅拌叶片往复运动的搅拌装置的血小板的制造方法。
背景技术
出于治疗和预防其症状的目的,针对随着手术时、受伤时的大量出血、或者抗癌剂治疗后的血小板减少而表现出出血趋势的患者,给予血小板制剂。目前,血小板制剂的制造依赖于由健康志愿者进行的献血。但是,在日本,因人口构成而引起献血者数量减少,推测在2027年,有大约100万人份的献血缺口。因此,作为本发明的技术领域的目的之一,可举出血小板的稳定供给。
另外,由于现有的血小板制剂因细菌污染导致的风险高,所以可能在血小板制剂的植入后引起严重的传染病。因此,在临床实践中,始终寻求更安全的血小板制剂。为了满足这种需求,如今开发了从在体外(in vitro)培养出的巨核细胞中生产血小板的方法。
以往,从培养细胞生产血小板通过使用了培养皿的静置培养系统来进行(WO2014/100779A1,Qiang Feng,et al.,StemCellReports)。但是,静置培养系统非常耗费人力,不适于大量培养。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2014/1007791号小册子
非专利文献
非专利文献1:Qiang Feng,et al.,Stem Cell Reports 3 1-15(2014)
发明内容
技术问题
本发明的发明人等通过利用使用了摇瓶的振摇培养系统,即,使用使培养容器本身振摇的培养方法,成功生产了具有高生理活性的血小板。但是,明确了在摇瓶培养系统中,随着培养基量的规模的扩大,会引起血小板(CD41a+CD42b+)生产量和血小板的生理活性(PAC1结合性,P-选择素阳性)降低。
此外,发现在摇瓶培养系统中发生了认为是由脱落反应等引起的血小板的劣化反应(CD42b阳性率降低)。此外,还发现含有大量不适于向生物体植入的异常的血小板(膜联蛋白V阳性的血小板)。
因此,本发明的课题在于提供以大规模的量生产能够向生物体植入的高品质的血小板的方法。
技术方案
本发明的发明人等为了解决上述课题反复进行了研究,其结果发现不使培养容器振摇,而是通过边使配置于培养容器内的搅拌叶片往复运动边搅拌培养液来培养巨核细胞,从而能够提高血小板的生产效率和生理活性,并且将血小板的劣化抑制得低,能够减少异常血小板。此外,对使用往复运动搅拌装置的搅拌培养时的细胞密度、其他条件进行了研究,从而完成了本发明。
即,本发明提供一种方法,是血小板的制造方法,包括在培养容器内的培养液中培养巨核细胞的工序,在上述培养工序中,使用搅拌叶片不是朝着一个方向运动而是进行往复运动或反向旋转的非常规的搅拌装置来搅拌上述培养液。
另外,在本发明的血小板的制造方法中,优选上述培养容器为密闭型生物反应器。
另外,在本发明的血小板的制造方法中,上述巨核细胞是在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中使选自癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因中的至少一个基因强制表达之后,解除该强制表达而得到的细胞。
另外,本发明提供一种方法,是血小板制剂的制造方法,包括:通过以上记载的方法使巨核细胞产生血小板,从培养物中回收血小板的工序;以及从上述血小板中除去血小板以外的血细胞系细胞成分的工序。
另外,本发明提供一种方法,是血液制剂的制造方法,包括通过以上记载的方法来制造血小板制剂的工序;以及将上述血小板制剂与其他成分混合来得到血液制剂的工序。
另外,本发明提供一种通过上述任一种方法制造的血小板。
另外,本发明提供一种血小板制剂,该血小板制剂包含通过上述任一种方法制造的血小板制剂或者上述血小板。
另外,本发明提供一种血液制剂,该血液制剂包含通过上述方法制造的血液制剂或者上述血小板。
发明效果
根据本发明的方法,与现有的振摇培养相比,能够提高血小板的生产效率。此外,生产出的血小板具有比通过现有的振摇培养生产的血小板更高的生理活性。
另外,根据本发明的方法,能够抑制血小板的劣化反应(CD42b阳性率的减少),并且能够抑制异常血小板(膜联蛋白V阳性血小板)的产生。
附图说明
图1表示作为本发明的实施方式例的生物反应器。
图2表示作为本发明的实施方式例的生物反应器中的密封件、驱动轴和搅拌叶片的设置例。
图3表示作为本发明的实施方式例的生物反应器中的搅拌叶片的结构。
图4表示在本发明的实施例中使用的VMF培养装置的结构。
图5表示针对进行巨核细胞的搅拌培养或振摇培养而得到的血小板使用抗CD42b抗体和抗CD41a抗体进行流式细胞术的结果。
图6表示针对进行巨核细胞的搅拌培养或振摇培养而得到的血小板,在PMA或ADP的刺激的前后,使用抗CD42b抗体和抗PAC-1抗体进行流式细胞术的结果。
图7表示针对在PMA或ADP的刺激的前后进行巨核细胞的搅拌培养或振摇培养而得到的血小板,使用抗CD42b抗体和抗CD62p抗体进行流式细胞术的结果。
图8表示针对进行巨核细胞的搅拌培养或振摇培养而得到的血小板,利用流式细胞术测定膜联蛋白V结合的比例的结果。
图9是示意性地表示设置有多级搅拌叶片的生物反应器的构成例的图。
具体实施方式
本发明的血小板的制造方法包括在培养容器内的培养液中培养巨核细胞的工序,其特征在于,在该培养工序中,使用搅拌叶片不是朝着一个方向运动,而是往复运动或反向旋转的非常规的搅拌装置来搅拌培养液。例如,为了使搅拌叶片在其主面承受来自流体的阻力,可以使上述搅拌叶片通过往复运动来搅拌培养液。优选使搅拌叶片沿着支撑轴方向进行往复运动。更优选使培养容器静置,使支撑搅拌叶片的支撑轴沿着该轴的延伸方向进行往复运动,使搅拌叶片沿着上下方向运动。
在本说明书中,“培养容器”只要是能够利用往复运动搅拌装置边搅拌培养液边培养巨核细胞的容器就没有特别限定。培养容器例如可举出开放系的培养皿、封闭体系的带瓶盖的烧瓶、生物反应器(包括密闭型生物反应器)等。
在本说明书中,“搅拌叶片”只要是配置在培养液内而能够直接搅拌培养液即可。搅拌叶片例如可以使用平板状、或折弯结构的叶片。
以下,作为本发明的一个方式,对使用具备搅拌叶片的生物反应器10的例子进行说明。
如图1所示,本实施方式的生物反应器10具有培养槽11、密封件12、驱动轴(搅拌轴)13和搅拌叶片14。如图2所示,针对培养槽11设置驱动轴13等的条件可以是安装于培养槽11底部的底部安装、或者是安装于培养槽11侧部的侧面安装。培养槽11具有将圆或角等平面形状沿着纵向延伸的三维的主体部。密封件12由随着驱动轴13运动的橡胶等可挠性的材料的膜状体、或者金属或特氟龙(注册商标)等材料的波纹管结构构成,覆盖培养槽11的上端开口部而被气密地设置。驱动轴13在其上部与上下运动装置例如往复驱动式马达15连结,并且,在驱动轴13的中间部贯通密封件12,且气密性地固定于密封件12。搅拌叶片14是平板状或折弯结构,平面形状如图3所示地具有减少了与圆形(图3(A))正交的面积的、例如椭圆(图3(B))、矩形(图3(C))、或在圆盘中设有冲孔16的冲孔结构(图3(D)),在驱动轴13固定有1级以上的搅拌叶片14。通过将搅拌叶片14穿孔,从而使对于通过该冲孔16的流体、细胞的剪切作用增强(参照图9)。冲孔16可以由较大地设置于搅拌叶片14的孔构成(图3(D)),也可以由设置于预定的区域的多个小孔构成(图9)。
搅拌叶片14可以为多级。例如,图9所示的生物反应器10是具备安装于驱动轴13的上级的搅拌叶片14和设置有冲孔16的下级的搅拌叶片14的两级叶片的构成,特别是使下级的搅拌叶片14的剪切效果进一步提高。
另外,在本实施方式的生物反应器10中,可以使与驱动轴(搅拌轴)13垂直地安装的搅拌叶片旋转,利用伺服马达进行的控制使搅拌叶片正向反向旋转。另外,可以利用驱动器使该伺服马达进行正反转控制而构成正反转驱动式马达15,通过伺服马达进行正反转控制(加速度/波形/速度等的控制)。
生物反应器10提供最佳的适于细胞增殖、细胞代谢、巨核细胞的分化成熟、巨核细胞的多核化、前血小板的形成、血小板生产、血小板的生理活性的维持等的物理化学的环境。因此,可以具备通气装置、排气装置、温度调节装置、pH控制装置、溶解氧压力(DOT)调节装置、挡板、喷洒器、端口等。
生物反应器10的培养槽11的形状也没有特别限定,但是例如可以采用垂直管状的形态,可以在罐的顶部和底部具有平坦的面。
培养槽11的容积至少为300mL,优选至少为1L、50L,更优选至少为200L,进一步优选至少为500L,再进一步优选至少为1000L,更进一步优选至少为2000L。
在本说明书中,“巨核细胞”是在生物体中存在于骨髄中的最大的细胞,其特征是释放出血小板。另外,巨核细胞以细胞表面标志物CD41a、CD42a、和CD42b阳性表征,此外,有时也进一步表达选自CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131和CD203c中的标志物。“巨核细胞”如果进行多核化(多倍体化),则具有普通的细胞的16~32倍的基因组,但在本说明书中,简称为巨核细胞的情况下,只要具备上述特征,就可以包括多核化的巨核细胞和多核化之前的巨核细胞这两者。“多核化前的巨核细胞”与“未成熟的巨核细胞”或“增殖期的巨核细胞”意思相同。
巨核细胞可以通过公知的各种方法得到。作为巨核细胞的制造方法的非限定性例子,可举出国际公开第2011/034073号中记载的方法。在该方法中,在“与巨核细胞相比分化程度低的细胞(cells less differentiated than megakaryocytes)”中,通过使癌基因和多梳基因强制表达,能够得到无限增殖的永生化巨核细胞株。另外,根据国际公开第2012/157586号中记载的方法,在“与巨核细胞相比分化程度低的细胞”中,通过使细胞凋亡抑制基因强制表达,也能够得到永生化巨核细胞。这些永生化巨核细胞通过解除基因的强制表达,进行多核化,从而释放出血小板。
为了得到巨核细胞,可以组合上述的文献中记载的方法。在这种情况下,癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因的强制表达可以同时进行,也可以按顺序进行。例如,可以使癌基因和多梳基因强制表达,抑制该强制表达,接着使细胞凋亡抑制基因强制表达,并抑制该强制表达而得到多核化巨核细胞。另外,也可以使癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因同时强制表达,将这些强制表达同时抑制而得到多核化巨核细胞。还可以首先使癌基因和多梳基因强制表达,接下来使细胞凋亡抑制基因强制表达,并同时抑制这些强制表达而得到多核化巨核细胞。
在本说明书中,“与巨核细胞相比分化程度低的细胞”是指具有向巨核细胞的分化能力的细胞,表示从造血干细胞系到巨核细胞为止的各种分化阶段的细胞。作为与巨核细胞相比分化程度低的细胞的非限定性例子,可举出造血干细胞、造血前体细胞、CD34阳性细胞、巨核细胞-红细胞前体细胞(MEP)。这些细胞例如可以从骨髄、脐带血、外周血分离而得到,也可以进一步从作为分化程度更低的细胞的ES细胞、iPS细胞等多能性干细胞分化诱导而得到。
在本说明书中,“癌基因”是指在生物体中诱导细胞癌化的基因,例如可举出MYC家族基因(例如c-MYC、N-MYC、L-MYC)、SRC家族基因、RAS家族基因、RAF家族基因、c-Kit、PDGFR、Abl等蛋白激酶家族基因。
在本说明书中,“多梳基因”已知是指对CDKN2a(INK4a/ARF)基因进行负调控,为了避免细胞老化而发挥功能的基因(小仓等,再生医疗vol.6,No.4,pp26-32;Jseus et al.,Jseus et al.,Nature Reviews Molecular Cell Biology vol.7,pp667-677,2006;Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.100,pp211-216,2003)。作为多梳基因的非限定性例子,可举出BMI1、Mel18、Ring1a/b、Phc1/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、Eed、Suz12、HADC、Dnmt1/3a/3b。
在本说明书中,“细胞凋亡抑制基因”是指具有抑制细胞的细胞凋亡的功能的基因,例如可举出BCL2基因、BCL-xL基因、存活素(Survivin)基因、MCL1基因等。
基因的强制表达和强制表达的解除可以通过国际公开第2011/034073号、国际公开第2012/157586号、国际公开第2014/123242或Nakamura S et al,Cell Stem Cell.14,535-548,2014中记载的方法、其他公知的方法或以此为基准的方法来进行。
在本说明书中,“血小板”是血液中的细胞成分之一,以CD41a阳性和CD42b阳性表征。血小板在血栓形成和止血中起到重要的作用,并且与损伤后的组织再生、炎症的病理生理也有关系。如果血小板因出血等被激活,则在其膜上表达IntegrinαIIBβ3(糖蛋白IIb/IIIa;CD41a和CD61的复合体)等细胞粘附因子的受体。其结果,血小板彼此聚集,利用从血小板释放出的各种凝血因子而使血纤维蛋白(Fibrin)凝固,从而形成血栓,进行止血。
血小板的功能可以通过公知的方法测定和评价。例如,可以使用对于经激活的血小板膜上的IntegrinαIIBβ3特异性结合的PAC-1的抗体,测定经激活的血小板量。另外,同样地可以用抗体检测作为血小板的激活标记物的CD62p(P-选择素)来测定经激活的血小板量。例如,可以通过如下方式来进行:使用流式细胞术,用针对激活非依赖性的血小板标记物CD61或CD41的抗体进行分选(gating),其后,检测抗PAC-1抗体和/或抗CD62p抗体与血小板的结合。这些工序也可以在二磷酸腺苷(ADP)存在下进行。
另外,血小板的功能的评价可以通过观察在ADP存在下是否与纤维蛋白原结合来进行。通过血小板与纤维蛋白原结合,从而发生在血栓形成的初期所必需的整联蛋白(integrin)的活化。
此外,血小板的功能的评价还可以如国际公开第2011/034073号的图6所示,通过可视化地观察在体外(in vivo)的血栓形成能力的方法进行。
另一方面,在血小板的CD42b的表达率低的情况下,或者膜联蛋白V阳性率低的情况下,评价为血小板劣化或异常。这些血小板不足以具有血栓形成、止血功能,临床上没有用。
在本说明书中,“血小板的劣化”是指血小板表面的CD42b(GPIbα)减少的情况。因此,劣化的血小板包括CD42b的表达减少的血小板、因脱落(shedding)反应而导致CD42b的细胞外区域被剪切了的血小板。如果血小板表面的CD42b消失,则无法进行与冯·维勒布兰德因子(von Willebrand factor:VWF)的结合,其结果丧失血小板的凝血功能。血小板的劣化可以以血小板组分中的CD42b阴性率(或CD42b阴性粒子数)相对于CD42b阳性率(或CD42b阳性粒子数)的情况为指标来评价。CD42b阴性率相对于CD42b阳性率越高,或者CD42b阴性粒子数相对于CD42b阳性粒子数越多,则血小板越劣化。CD42b阳性率是指血小板组分所含的血小板中的能够与抗CD42b抗体结合的血小板的比例,CD42b阴性率是指血小板组分所含的血小板中的不与抗CD42b抗体结合的血小板的比例。
在本说明书中,“异常的血小板”是指作为负电荷磷脂质的磷脂酰丝氨酸从脂质双分子层的内侧向外侧露出的血小板。在生物体中,已知磷脂酰丝氨酸随着血小板的激活而在表面露出,在此结合了大量的凝血因子,由此凝血级联反应扩大。另一方面,在异常的血小板中,大量的磷脂酰丝氨酸始终在表面露出,如果向患者给予该血小板,则可能引起过度的血液凝固反应,导致弥散性血管内凝血综合征等严重的疾病。由于膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸结合,所以血小板表面上的磷脂酰丝氨酸可以通过以荧光标记的膜联蛋白V的结合量为指标,使用流式细胞仪来检测。因此,异常的血小板的量可以用血小板组分中的膜联蛋白V阳性率,即膜联蛋白结合的血小板的比例或数目来评价。膜联蛋白V阳性率越高,或膜联蛋白V粒子数越多,则异常的血小板越多。
本发明中的巨核细胞的培养条件可以采用通常的条件。例如,温度可以设为约35℃~约42℃、约36℃~约40℃或约37℃~约39℃,还可以为5~15%的CO2和/或20%的O2。
培养巨核细胞时的培养基没有特别限定,可以适当使用从巨核细胞产生血小板所适宜的公知的培养基和/或以此为基准的培养基。例如,可以将动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基来制备。作为基础培养基,例如可举出IMDM培养基、Medium 199培养基、伊格尔氏基本成分培养基(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM)培养基、αMEM培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's Medium)(DMEM)培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、Neurobasal培养基(LifeTechnologies公司)和它们的混合培养基。
培养基中可以含有血清或血浆,或者可以没有血清。根据需要,培养基例如可以含有白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油(thiolglycerol)、单硫代甘油(MTG)、脂质、氨基酸(例如L-谷氨酰胺)、抗坏血酸、肝素、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等中的1种以上的物质。细胞因子是指促进血细胞类分化的蛋白质,例如例示有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板生成素(TPO)、各种TPO类活性物质、干细胞因子(SCF:StemCellFactor)、ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)添加剂、ADAM抑制剂等。在本发明中优选的培养基是含有血清、胰岛素、转铁蛋白、丝氨酸、硫代甘油、抗坏血酸、TPO的IMDM培养基。此外,可以含有SCF,还可以含有肝素。各自的浓度也没有特别限定,但例如,TPO可以为约10ng/mL~约200ng/mL或约50ng/mL~约100ng/mL,SCF可以为约10ng/mL~约200ng/mL或约50ng/mL,肝素可以为约10U/mL~约100U/mL,或约25U/mL。可以加入佛波酯(例如,佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯;PMA)。
在使用血清的情况下优选人血清。另外,可以使用人血浆等代替血清。根据本发明的方法,即使使用这些成分,也能够得到与使用血清时同等的血小板。
为了进行基因的强制表达及其解除,可以使用Tet-on(注册商标)或Tet-off(注册商标)系统那样的药剂反应性的基因表达诱导系统。在这种情况下,在强制表达的工序中,可以在培养基中含有对应的药剂,例如四环素或多西环素,将它们通过从培养基中除去而抑制强制表达。
本发明中的巨核细胞的培养工序可以通过悬浮培养来进行,因此可以在无饲养细胞的情况下实施。
本发明还包括用本发明的方法制造的血小板。
本发明的血小板制剂的制造方法包括通过本发明的方法培养巨核细胞来产生血小板,从培养物中回收富含血小板的组分的工序;以及从该血小板组分中除去血小板以外的血细胞系细胞成分的工序。除去血细胞系细胞成分的工序可以通过使用去白细胞过滤器(例如泰尔茂公司制、旭化成医疗公司制)等,将含有巨核细胞的血小板以外的血细胞系细胞成分除去来进行。血小板制剂的更具体的制造方法例如记载在国际公开第2011/034073号中。
本发明的血液制剂的制造方法包括通过本发明的方法来制造血小板制剂的工序;以及将该血小板制剂与其他成分混合的工序。作为其他成分,例如可举出红细胞。
在血小板制剂和血液制剂中还可以加入有助于细胞稳定化的其他成分。
在本说明书中,所引用的所有专利文献和非专利文献的公开内容可以作为整体通过参照援引到本说明书中。
实施例1
以下,基于实施例具体地说明本发明,但本发明不受其任何限定。本领域技术人员可以在不脱离本发明的主旨的情况下将本发明改变为各种方式,该改变也包括在本发明的范围内。
1.永生化巨核细胞的制作
1-1.从iPS细胞制备造血前体细胞
根据Takayama N.,et al.J Exp Med.2817-2830(2010)中记载的方法,实施从人类iPS细胞(TKDN SeV2:来自于使用仙台病毒建立的人胎儿皮肤成纤维细胞的iPS细胞)向血细胞的分化培养。即,在20ng/mL的VEGF(R&DSYSTEMS)存在下,将人类ES/iPS细胞集落与C3H10T1/2饲养细胞共培养14天来制作造血前体细胞(Hematopoietic Progenitor Cells;HPC)。在20%的O2、5%的CO2的培养条件下实施(只要没有特别记载,以下就为相同条件)。
1-2.基因导入系统
基因导入系统利用慢病毒载体系统。慢病毒载体是四环素控制性的Tet-On(注册商标)基因表达诱导系统载体。是通过将LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G(Kobayashi,T.,etal.Cell142,787-799(2010))的mOKS盒改组为c-MYC、BMI1、BCL-xL而制作的。分别为LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G、LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G和LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G。
病毒粒子是通过利用上述任意的方法将慢病毒载体向293T细胞进行基因导入而制作的。
通过使上述病毒粒子感染目的细胞,从而将BMI1、MYC和BCL-xL的基因导入到目的细胞的基因组序列。稳定地导入到基因组序列的这些基因可以通过向培养基加入多西环素(clontech#631311)来强制表达。
1-3.c-MYC和BMI1病毒向造血前体细胞的感染
在预先接种了C3H10T1/2饲养细胞的6孔板上,以5×104个细胞/孔的方式分别接种按照上述方法得到的HPC,通过慢病毒法使c-MYC和BMI1强制表达。此时,对每1种细胞株各使用6个孔。即,以分别成为MOI 20的方式在培养基中添加病毒粒子,通过自旋感染(32℃、900rpm,离心60分钟)进行感染。本操作每12小时实施2次。
使用如下的培养基:向基本培养基(含有15%的胎牛血清(GIBCO)、1%的青霉素-链霉素-谷氨酰胺(GIBCO)、1%的胰岛素、转铁蛋白、硒溶液(ITS-G)(GIBCO)、0.45mM的1-硫代甘油(Sigma-Aldrich)、50μg/mL的L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)的IMDM(Iscove'smodified Dulbecco's medium:伊思考夫改良的杜尔贝科培养基)(Sigma-Aldrich))中加入50ng/mL的人血小板生成素(TPO)(R&D SYSTEMS)、50ng/mL的人类干细胞因子(SCF)(R&DSYSTEMS)和2μg/mL的多西环素(Dox),向所得到的培养基(以下,称为分化培养基)中进一步加入鱼精蛋白,以使得最终浓度成为10μg/mL。
1-4.巨核细胞自体增殖株的制作和维持培养
将通过上述方法实施了cMYC和BMI1病毒感染的日期作为感染第0天,如下,通过培养cMYC和BMI1基因导入型巨核细胞,分别制作巨核细胞自增殖株。BMI1基因、c-MYC基因的强制表达通过在培养基中加入1μg/mL的多西环素(clontech#631311)来进行。
·感染第2天~感染第11天
利用移液器回收通过上述方法得到的病毒感染完毕的血细胞,进行1200rpm、5分钟离心操作并除去上清液后,在新的分化培养基悬浮地接种于新的C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。通过在感染第9天进行同样的操作来实施传代。在测量细胞数之后,以1×105个细胞/2mL/孔接种于C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。
·感染第12天~感染第13天
实施与感染第2天同样的操作。在测量细胞数之后,以3×105个细胞/10mL/100mmdish的条件接种在C3H10T1/2饲养细胞上(100m培养皿)。
·感染第14天
回收病毒感染完毕的血球细胞,针对每1.0×105个细胞,使用抗人类CD41a-APC抗体(BioLegend)、抗人类CD42b-PE抗体(eBioscience)、抗人类CD235ab-pacific blue(BioLegend)抗体分别为2μL、1μL、1μL进行抗体反应。在反应后,使用FACS Verse(BD)进行解析。在感染第14天,将CD41a阳性率为50%以上的细胞作为巨核细胞自体增殖株。
1-5.BCL-xL病毒向巨核细胞自体增殖株的感染
通过慢病毒法向上述感染第14天的巨核细胞自增殖株基因导入BCL-xL。以成为MOI 10的方式向培养基中添加病毒粒子,通过自旋感染(32℃、900rpm,60分钟离心)进行感染。BCL-xL基因的强制表达通过向培养基加入1μg/mL的多西环素(clontech#631311)来进行。
1-6.巨核细胞永生化株的制作和维持培养
·感染第14天~感染第18天
回收通过上述方法得到的进行了BCL-xL基因导入的巨核细胞自体增殖株,进行1200rpm、5分钟离心操作。在离心后,在用新的分化培养基将沉淀的细胞悬浮之后,以2×105个细胞/2mL/孔的条件接种在新的C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。
·感染第18天:传代
在测量细胞数之后,以3×105个细胞/10mL/100mm培养皿的条件进行接种。
·感染第24天:传代
在测量细胞数之后,以1×105个细胞/10mL/100mm培养皿的条件进行接种。之后,每4-7天进行传代,进行维持培养。
在感染第24天回收进行了BCL-xL基因导入的巨核细胞自体增殖株,针对每1.0×105个细胞,使用抗人类CD41a-APC抗体(BioLegend)、抗人类CD42b-PE抗体(eBioscience)、抗人CD235ab-Pacific Blue(Anti-CD235ab-PB;BioLegend)抗体分别为2μL、1μL、1μL进行免疫染色之后,使用FACS Verse(BD)进行解析,将在感染第24天,CD41a阳性率仍为50%以上的株作为永生化巨核细胞株。将能够在感染后24天以上增殖完成之后的这些细胞作为永生化巨核细胞株SeV2-MKCL。
将得到的SeV2-MKCL在10cm培养皿(10mL/dish)中静置培养。培养基以IMDM作为基本培养基,并加入了以下成分(浓度为最终浓度)。
培养条件为37℃、5%的CO2。
2.血小板的生产
接下来,通过用不含有多西环素的培养基进行培养,从而解除强制表达。具体而言,用PBS(-)对利用1.的方法得到的永生化巨核细胞株(SeV2-MKCL)进行2次洗涤,以1.0×105个细胞/mL的接种密度悬浮于下述的培养基。
培养基是在IMDM含有以下成分的培养基(浓度为最终浓度)。
将通过上述1.的方法得到的永生化巨核细胞株(SeV2-MKCL)悬浮于上述培养基并调整细胞悬浮液。将该细胞悬浮液2.4L添加到生物反应器10中,将该细胞悬浮液25mL添加到125mL容积摇瓶。生物反应器10使用至少具有1级以上的搅拌叶片14,且能够使该搅拌叶片14沿着上下方向进行往复运动的3.0L容积的VMF培养装置(以下,记为VMF)。
VMF规格如下。主体外尺寸(mm):300W×485D×890H,培养槽11的尺寸(mm):内径140×深度203,培养槽11的液体量:3.0L,搅拌叶片14:下段椭圆形折弯结构+上段平板椭圆形2级安装,直线运动传动方式:直线轴驱动无密封式,温度调节范围:室温+5~20℃,上下运动振幅:10~30mm,上下运动最大叶片速度:80~150mm/s,测量控制:搅拌、温度、pH、溶解氧、等级、进料。在图4中示出VMF。
在VMF中,进行2.4L的永生化巨核细胞株悬浮液的培养。培养环境为37℃和5%的CO2。搅拌速度为1.6Hz,搅拌行程长度为3cm。
在125mL容积摇瓶中,进行25mL的永生化巨核细胞株悬浮液的培养。使用振摇培养器(N-BIOTEK,AniCell),在37℃和5%的CO2环境下,以100rpm速度进行振摇培养。
3.血小板的测定
为了对通过上述2.的方法生产的血小板进行测定,在强制表达解除之后,回收培养6天后的培养上清样品,利用各种抗体进行染色,并且使用流式细胞仪进行分析。将CD41a阳性CD42b阳性的粒子数作为正常血小板数,将CD41a阳性CD42b阴性的粒子数作为劣化血小板数。将膜联蛋白V阳性的粒子数作为异常血小板数。另外,利用PMA或ADP/凝血酶刺激样品,算出刺激前后的PAC-1和CD62p的阳性率,测定生理活性。
详细测定方法和结果如下。
3-1.血小板的测定
为了测定正常血小板、劣化血小板、血小板的生理活性,向1.5mL微管中添加稀释液900mL,向其中添加培养上清液100mL,进行混合。将经稀释混合的培养上清200mL分注到FACS管中,添加以下的标记抗体或者蛋白质进行染色。为了测定异常血小板,将培养上清液100mL分注到FACS管,添加以下的标记抗体或者蛋白质进行染色,在即将进行流式细胞仪分析之前,用膜联蛋白V binding buffer(BD)稀释5倍,进行了分析。
使用的抗体如下。
正常血小板和劣化血小板的测定
0.5μL的抗CD41抗体APC标记(Bio Legend 303710)
0.5μL的抗CD42a抗体PB标记(eBioscience 48-0428-42)
0.5μL的抗CD42b抗体PE标记(eBioscience 12-0428-42)
血小板的生理活性的测定
0.5μL的抗CD42a抗体PB标记(eBioscience 48-0428-42)
0.5μL的抗CD42b抗体PE标记(eBioscience 12-0428-42)
0.5μL的抗CD62p抗体APC标记(Bio Legend 304910)
10μL的抗PAC-1抗体FITC标记(BD 303704)
异常血小板数的测定
0.5μL的抗CD41抗体APC标记(Bio Legend 303710)
0.5μL的抗CD42a抗体PB标记(eBioscience 48-0428-42)
5(L膜联蛋白V FITC标记(BD,556419)
3-2.正常血小板生产量的测定
将结果示于图5。在由VMF进行的培养中,正常血小板生产量比在摇瓶中进行的培养高(图5(B))。另外,将每个巨核细胞数的正常血小板数算出为正常血小板生产效率的情况下,与在摇瓶中进行的培养相比,在VMF中进行的培养中,该正常血小板生产效率高约6.0~7.7倍(图5(C))。即,与在现有的摇瓶中进行的培养相比,在VMF中进行的培养能够增加每个巨核细胞数的正常血小板生产量。
3-3.劣化血小板的测定
在测定劣化血小板时,利用上述3-1.的方法,使用流式细胞仪对各处理样品进行分析,对CD41a阳性CD42b阳性以及CD41a阳性CD42b阴性分别测定粒子数。并且,将CD41a阳性CD42b阳性的粒子数作为正常血小板数,将CD41a阳性CD42b阴性的粒子数作为劣化血小板数,算出劣化血小板数相对于正常血小板数的比例。
将结果示于图5。在VMF中进行的培养中的劣化血小板数相对于正常血小板数的比例减少到在摇瓶中进行的培养中的劣化血小板数相对于正常血小板数的比例的约0.31~0.39倍(图5(A))。即,利用在VMF中进行的培养,与在现有的摇瓶中进行的培养相比,能够将劣化血小板的生产量抑制得低。
3-3.血小板生理活性的测定
血小板的刺激利用0.2mM的PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯,sigma#P1585-1MG)或100μM的ADP(sigma#A2754)和0.5U/mL的凝血酶(sigma)在室温下进行。在刺激30分钟之后,利用BD公司FACSverce实施测定。测定CD42a阳性的血小板组分中的、刺激前后的PAC-1阳性率和CD62p阳性率,进行比较评价。
将结果示于图6和图7。在VMF中进行的培养与在摇瓶中进行的培养相比,PMA或ADP/凝血酶刺激时的PAC-1阳性率高达约1.9~3.1倍(图6)。另外,在VMF中进行的培养与在摇瓶中进行的培养相比,CD62p阳性率高达约1.8~2.7倍以上(图7)。即,与在摇瓶中进行的培养相比,利用在VMF中进行的培养能够增加生理活性高的血小板的生产量。
3-4.异常血小板的测定
根据上述3-1.的方法,使用流式细胞仪对各处理样品进行分析,对膜联蛋白V阳性的粒子数进行测定。将CD42b阳性膜联蛋白V阳性的粒子数作为异常血小板数。
将结果示于图8。在VMF中进行的培养与在摇瓶中进行的培养相比,CD42b阳性膜联蛋白V阳性的粒子数减少到小于约0.31~0.34倍(图8)。即,与在摇瓶中进行的培养相比,利用在VMF中进行的培养能够将异常血小板的生产量抑制得更低。
产业上的可利用性
根据本发明,可知能够得到在摇瓶中进行的振摇培养中无法得到的高品质的血小板。因此,本发明能够对血小板的工业级别的大量生产的实现做出贡献。
Claims (13)
1.一种血小板的制造方法,其特征在于,
包括在培养容器内的培养液中培养巨核细胞的培养工序,
在所述培养工序中,利用往复运动的搅拌叶片来搅拌所述培养液。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,使用使所述培养工序中使用的所述搅拌叶片沿着上下方向或左右方向或正反旋转方向进行往复运动来非常规地搅拌培养液的生物反应器。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养工序中使用的所述搅拌叶片为椭圆形,在所述培养工序中使用使所述搅拌叶片沿着上下方向进行往复运动来搅拌培养液的生物反应器。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养工序中使用的所述搅拌叶片为椭圆形折弯结构,在所述培养工序中使用使所述搅拌叶片沿着上下方向进行往复运动来搅拌培养液的生物反应器。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养工序中使用的所述搅拌叶片为折弯椭圆形,与平板椭圆形的搅拌叶片正交地在搅拌轴安装一级以上的搅拌叶片,在所述培养工序中使用使所述搅拌叶片沿着上下方向进行往复运动来搅拌培养液的生物反应器。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的方法,其特征在于,作为所述搅拌叶片,使用设置有冲孔的搅拌叶片。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养容器为密闭型生物反应器。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的方法,其特征在于,所述巨核细胞是在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中使选自癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因中的至少一个基因强制表达之后,解除该强制表达而得到的细胞。
9.一种血小板制剂的制造方法,其特征在于,包括:
通过权利要求1~8中任一项所述的方法使巨核细胞产生血小板,从培养物中回收血小板的工序;以及
从所述血小板中除去血小板以外的血细胞系细胞成分的工序。
10.一种血液制剂的制造方法,其特征在于,包括:
通过权利要求9所述的方法制造血小板制剂的工序;以及
将所述血小板制剂与其他成分混合来得到血液制剂的工序。
11.一种血小板,其特征在于,通过权利要求1~8中任一项所述的方法制造而成。
12.一种血小板制剂,其特征在于,包含通过权利要求8所述的方法制造的血小板制剂或者权利要求11所述的血小板。
13.一种血液制剂,其特征在于,包含通过权利要求10所述的方法制造的血液制剂或者权利要求11所述的血小板。
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