KR20180080261A - 왕복 이동 교반 장치를 사용한 혈소판의 제조 방법 - Google Patents

왕복 이동 교반 장치를 사용한 혈소판의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 혈소판의 제조 방법으로서, 배양 용기 내의 배양액 중에서 거핵구 세포를 배양하는 공정을 포함하며, 당해 배양 공정에서, 교반 블레이드가 왕복 이동하여 배양액을 교반하는 방법을 제공한다.

Description

왕복 이동 교반 장치를 사용한 혈소판의 제조 방법
본 발명은, 교반 블레이드가 왕복 이동하는 교반 장치를 사용한 혈소판의 제조 방법에 관한 것이다.
혈소판 제제는, 수술 시나 상해 시의 대량 출혈, 또는 항암제 치료 후의 혈소판 감소에 수반하는 출혈 경향을 나타내는 환자에 대하여, 그 증상의 치료 및 예방을 목적으로 투여된다. 현재 혈소판 제제의 제조는 건강한 지원자에 의한 헌혈에 의존하고 있다. 그러나, 일본에서는 인구 구성에 기인하여 헌혈자수가 감소하고 있어, 2027년에는 약 100만인 분의 헌혈이 부족하다고 추측되고 있다. 그래서, 본 발명의 기술 분야의 목적의 하나로서, 혈소판의 안정 공급을 들 수 있다.
또한, 종래의 혈소판 제제는, 세균 오염에 의한 리스크가 높기 때문에, 혈소판 제제의 이식 후에 위독한 감염증을 일으킬 가능성이 있다. 그 때문에, 임상 현장에서는, 항상, 보다 안전한 혈소판 제제가 요구되고 있다. 그 요구에 따르기 위해, 오늘날에는 in vitro에서 배양한 거핵구 세포로부터 혈소판을 생산하는 방법이 개발되고 있다.
종래, 배양 세포로부터의 혈소판 생산은, 디쉬를 사용한 정치 배양계에서 행해지고 있었다(WO2014/100779A1, Qiang Feng, et al., Stem Cell Reports). 그러나, 정치 배양계는 매우 수고로운 것이어서, 대량 배양에는 적합하지 않았다.
국제 공개 제2014/1007791호 팸플릿
Qiang Feng, et al., Stem Cell Reports 31-15 (2014)
본 발명자들은, 셰이커 플라스크를 사용한 진탕 배양계, 즉, 배양 용기 자체를 진탕하는 배양 방법을 사용함으로써, 높은 생리 활성을 갖는 혈소판을 생산하는 것에 성공하였다. 그러나, 셰이커 플라스크 배양계에서는, 배지량의 스케일업에 따라서, 혈소판(CD41a+CD42b+) 생산량과 혈소판의 생리 활성(PAC1 결합성, P-selectin 양성)의 저하가 일어나는 것으로 판명되었다.
또한, 셰이커 플라스크 배양계에서는, 쉐딩 반응 등에 기인한다고 생각되는 혈소판의 열화 반응(CD42b 양성률의 저하)이 일어나는 것이 발견되었다. 게다가, 생체로의 이식에 적합하지 않은 이상한 혈소판(아넥신 V 양성의 혈소판)이 보다 많이 포함되는 것도 알았다.
그래서, 본 발명은, 생체에 이식 가능한 고품질의 혈소판을 대규모의 양으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 검토를 거듭한 결과, 배양 용기를 진탕하는 것이 아니라, 배양 용기 내에 배치한 교반 블레이드를 왕복 이동시켜 배양액을 교반하면서 거핵구 세포를 배양함으로써, 혈소판의 생산 효율 및 생리 활성을 높게 할 수 있음과 함께, 혈소판의 열화를 낮게 억제하는 것, 이상 혈소판을 감소시킬 수 있음을 발견하였다. 또한, 왕복 이동 교반 장치를 사용한 교반 배양 시의 세포 밀도, 기타의 조건을 검토하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 혈소판의 제조 방법으로서, 배양 용기 내의 배양액 중에서 거핵구 세포를 배양하는 공정을 포함하며, 상기 배양 공정에서, 교반 블레이드가 일방향이 아니라 왕복 이동 또는 반전되는 비정상 교반 장치를 사용하여 상기 배양액을 교반하는 방법이다.
또한 본 발명에 따른 혈소판의 제조 방법에서는, 상기 배양 용기가 밀폐형 바이오리액터인 것도 바람직하다.
또한 본 발명에 따른 혈소판의 제조 방법에서는, 상기 거핵구 세포가, 거핵구 세포로부터 미분화된 세포에서, 암유전자, 폴리콤 유전자 및 아폽토시스 억제 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 유전자 중 적어도 하나를 강제 발현한 후, 당해 강제 발현을 해제한 세포인 것도 바람직하다.
또한 본 발명은 혈소판 제제의 제조 방법으로서, 이상에 기재된 방법으로 거핵구 세포에 혈소판을 산생시키고, 배양물로부터 혈소판을 회수하는 공정과, 상기 혈소판으로부터 혈소판 이외의 혈구계 세포 성분을 제거하는 공정을 포함하는 방법이다.
또한 본 발명은 혈액 제제의 제조 방법으로서, 이상에 기재된 방법으로 혈소판 제제를 제조하는 공정과, 상기 혈소판 제제를 다른 성분과 혼합하여 혈액 제제를 얻는 공정을 포함하는 방법이다.
또한 본 발명은 상기 어느 하나의 방법으로 제조된 혈소판이다.
또한 본 발명은 상기 어느 하나의 방법으로 제조된 혈소판 제제, 또는 상기 혈소판을 포함하는 혈소판 제제이다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 혈액 제제, 또는 상기 혈소판을 포함하는 혈액 제제이다.
본 발명의 방법에 의하면, 종래의 진탕 배양보다도 혈소판의 생산 효율을 향상시킬 수 있다. 또한, 생산된 혈소판은 종래의 진탕 배양에서 생산되는 혈소판보다도 높은 생리 활성을 갖는다.
또한, 본 발명의 방법에 의하면, 혈소판의 열화 반응(CD42b 양성률의 감소)을 억제할 수 있음과 함께, 이상 혈소판(아넥신 V 양성 혈소판)의 산생을 억제할 수도 있다.
도 1은, 본 발명의 실시 형태예인 바이오리액터를 나타낸다.
도 2는, 본 발명의 실시 형태예인 바이오리액터에서의 시일, 구동축 및 교반 블레이드의 설치예를 나타낸다.
도 3은, 본 발명의 실시 형태예인 바이오리액터에서의 교반 블레이드의 구조를 나타낸다.
도 4는, 본 발명의 실시예에서 사용한 VMF 배양 장치의 구조를 나타낸다.
도 5는, 거핵구 세포의 교반 배양 또는 진탕 배양을 행하여 얻어진 혈소판에 대해서, 항CD42b 항체 및 항CD41a 항체를 사용하여 플로우 사이토메트리를 행한 결과를 나타낸다.
도 6은, 거핵구 세포의 교반 배양 또는 진탕 배양을 행하여 얻어진 혈소판에 대해서, PMA 또는 ADP의 자극 전후에, 항CD42b 항체 및 항PAC-1 항체를 사용하여 플로우 사이토메트리를 행한 결과를 나타낸다.
도 7은, PMA 또는 ADP의 자극 전후에, 거핵구 세포의 교반 배양 또는 진탕 배양을 행하여 얻어진 혈소판에 대해서, 항CD42b 항체 및 항CD62p 항체를 사용하여 플로우 사이토메트리를 행한 결과를 나타낸다.
도 8은, 거핵구 세포의 교반 배양 또는 진탕 배양을 행하여 얻어진 혈소판에 대해서, 아넥신 V가 결합하는 비율을 플로우 사이토메트리로 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는, 복수단의 교반 블레이드가 설치된 바이오리액터의 구성예를 개략적으로 나타내는 도면이다.
본 발명에 따른 혈소판의 제조 방법은, 배양 용기 내의 배양액 중에서 거핵구 세포를 배양하는 공정을 포함하고, 당해 배양 공정에서, 교반 블레이드가 일방향이 아니라, 왕복 이동 또는 반전되는 비정상 교반 장치를 사용하여 배양액을 교반하는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 교반 블레이드가 그 주면에 유체로부터 저항을 받도록, 상기 교반 블레이드를 왕복 이동시킴으로써 배양액을 교반해도 된다. 바람직하게는, 교반 블레이드를 지지축 방향으로 왕복 이동시킨다. 보다 바람직하게는, 배양 용기를 정치시키고, 교반 블레이드를 지지하는 지지축을 그 축 연장 방향으로 왕복 이동시켜, 교반 블레이드를 상하 방향으로 움직이게 한다.
본 명세서에 있어서 「배양 용기」는, 왕복 이동 교반 장치에서 배양액을 교반하면서 거핵구 세포를 배양할 수 있는 용기라면 특별히 한정되지 않는다. 배양 용기는, 예를 들어 개방계 배양 디쉬, 폐쇄계 스크류 캡 부착 플라스크, 바이오리액터(밀폐형 바이오리액터를 포함함) 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「교반 블레이드」는, 배양액 중에 배치하여 배양액을 직접 교반할 수 있는 것이면 된다. 교반 블레이드는, 예를 들어 평판상 또는 절곡 구조의 것이 사용된다.
이하, 본 발명의 일 형태로서, 교반 블레이드를 구비한 바이오리액터(10)를 사용하는 예를 설명한다.
본 실시 형태의 바이오리액터(10)는, 도 1에 나타내는 대로, 배양조(11)와, 시일(12)과, 구동축(교반축)(13)과, 교반 블레이드(14)를 갖는다. 배양조(11)에 대한 구동축(13) 등의 설치 조건은, 도 2에 나타내는 대로, 배양조(11)의 저부에 설치하는 보텀 설치, 또는 배양조(11)의 측부에 설치하는 사이드 설치여도 된다. 배양조(11)는 원 또는 각(角) 등의 평면형을 세로 방향으로 늘린 3차원의 동체부를 갖고 있다. 시일(12)은, 구동축(13)의 움직임에 추종하는 고무 등의 플렉시블한 재료의 막상체, 또는 금속 또는 테플론(등록 상표) 등의 소재의 벨로우즈 구조로 이루어지며, 배양조(11)의 상단 개구부를 덮어 기밀하게 설치되어 있다. 구동축(13)은, 그 상부에서 상하 이동 장치, 예를 들어 왕복 구동식 모터(15)에 연결되어 있으며, 또한 구동축(13)의 중간부에서 시일(12)을 관통함과 함께, 시일(12)에 기밀하게 고정되어 있다. 교반 블레이드(14)는 평판상 또는 절곡 구조이며, 평면 형상은, 도 3에 나타내는 대로, 원형(도 3의 (A))에 대하여 직교하는 면적을 뺀, 예를 들어 타원(도 3의 (B)), 직사각형(도 3의 (C)), 또는 원반에 스루홀(16)이 형성된 스루홀 구조(도 3의 (D))를 갖고 있으며, 구동축(13)에 1단 이상의 교반 블레이드(14)가 고정된다. 교반 블레이드(14)를 구멍이 있게 함으로써, 해당 스루홀(16)을 통과하는 유체나 세포에의 전단 작용이 강해진다(도 9 참조). 스루홀(16)은 교반 블레이드(14)에 크게 형성된 구멍으로 구성되어 있어도 되고(도 3의 (D)), 소정의 영역에 형성된 복수의 작은 구멍으로 구성되어 있어도 된다(도 9).
교반 블레이드(14)는 복수단이어도 된다. 예를 들어, 도 9에 나타내는 바이오리액터(10)는, 구동축(13)에 설치된 상단의 교반 블레이드(14)와, 스루홀(16)이 형성된 하단의 교반 블레이드(14)를 구비한 2단 블레이드의 구성이 있고, 특히 하단의 교반 블레이드(14)에서의 전단 효과를 보다 향상시키고 있다.
또한, 본 실시 형태의 바이오리액터(10)에서는, 구동축(교반축)(13)에 수직으로 설치된 교반 블레이드를 회전시키고, 서보 모터에 의한 제어로 교반 블레이드를 정역 회전으로 해도 된다. 또한, 이 서보 모터를 드라이버로 정역 회전 제어하여 정역 구동식 모터(15)를 구성하고, 서보 모터에 의한 정역 제어(가속도ㆍ파형ㆍ속도 등의 제어)를 가능하게 하고 있다.
바이오리액터(10)는, 최적인 세포 증식, 세포 대사, 거핵구 세포의 분화 성숙, 거핵구 세포의 다핵화, 전혈소판의 형성, 혈소판 생산, 혈소판의 생리 활성의 유지 등에 최적의 물리 화학적 환경을 제공한다. 그 때문에, 통기 장치, 배기 장치, 온도 조절 장치, pH 제어 장치, 용존 산소압(DOT) 조절 장치, 배플, 스파저, 포트 등을 구비하고 있어도 된다.
바이오리액터(10)의 배양조(11)의 형상도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 세로로 긴 관상의 형태로 할 수 있고, 탱크의 정상부와 저부에 평탄한 면을 갖는 것이어도 된다.
배양조(11)의 용적은 적어도 300mL, 바람직하게는 적어도 1L, 50L, 보다 바람직하게는 적어도 200L, 보다 바람직하게는 적어도 500L, 보다 더 바람직하게는 적어도 1000L, 보다 더 바람직하게는 적어도 2000L이다.
본 명세서에 있어서 「거핵구 세포」란, 생체 내에서는 골수 중에 존재하는 최대의 세포이며, 혈소판을 방출하는 것을 특징으로 한다. 또한, 세포 표면 마커 CD41a, CD42a 및 CD42b 양성으로 특징지어지고, 이외에도 CD9, CD61, CD62p, CD42c, CD42d, CD49f, CD51, CD110, CD123, CD131 및 CD203c로 이루어지는 군에서 선택되는 마커를 더 발현하고 있는 경우도 있다. 「거핵구 세포」는, 다핵화(다배체화)되면, 통상의 세포 16 내지 32배의 게놈을 가지지만, 본 명세서에 있어서 간단히 「거핵구 세포」라 하는 경우, 상기 특징을 갖추고 있는 한, 다핵화된 거핵구 세포와 다핵화 전의 거핵구 세포의 양쪽을 포함한다. 「다핵화 전의 거핵구 세포」는 「미숙한 거핵구 세포」 또는 「증식기의 거핵구 세포」와도 동일한 의미이다.
거핵구 세포는 공지된 각종 방법으로 얻을 수 있다. 거핵구 세포의 제조 방법의 비한정적인 예로서, 국제 공개 제2011/034073호에 기재된 방법을 들 수 있다. 동 방법에서는, 「거핵구 세포로부터 미분화된 세포」에서, 암유전자와 폴리콤 유전자를 강제 발현시킴으로써, 무한히 증식하는 불사화 거핵구 세포주를 얻을 수 있다. 또한, 국제 공개 제2012/157586호에 기재된 방법에 따라, 「거핵구 세포로부터 미분화된 세포」에서, 아폽토시스 억제 유전자를 강제 발현시킴으로써도, 불사화 거핵구 세포를 얻을 수 있다. 이들 불사화 거핵구 세포는 유전자의 강제 발현을 해제함으로써, 다핵화가 진행되고, 혈소판을 방출하게 된다.
거핵구 세포를 얻기 위해서, 상기 문헌에 기재된 방법을 조합해도 된다. 그 경우, 암유전자, 폴리콤 유전자 및 아폽토시스 억제 유전자의 강제 발현은, 동시에 행해도 되고, 순차로 행해도 된다. 예를 들어, 암유전자와 폴리콤 유전자를 강제 발현시키고, 당해 강제 발현을 억제하고, 다음으로 아폽토시스 억제 유전자를 강제 발현시키고, 당해 강제 발현을 억제하여, 다핵화 거핵구 세포를 얻어도 된다. 또한, 암유전자와 폴리콤 유전자와 아폽토시스 억제 유전자를 동시에 강제 발현시키고, 당해 강제 발현을 동시에 억제하여, 다핵화 거핵구 세포를 얻을 수도 있다. 우선, 암유전자와 폴리콤 유전자를 강제 발현시키고, 이어서 아폽토시스 억제 유전자를 강제 발현시키고, 당해 강제 발현을 동시에 억제하여, 다핵화 거핵구 세포를 얻을 수도 있다.
본 명세서에 있어서 「거핵구 세포로부터 미분화된 세포」란, 거핵구로의 분화능을 갖는 세포이며, 조혈간세포계로부터 거핵구 세포에 이르는 각종 분화 단계의 세포를 의미한다. 거핵구로부터 미분화된 세포의 비한정적인 예로서는, 조혈간세포, 조혈전구세포, CD34 양성 세포, 거핵구ㆍ적아구계 전구 세포(MEP)를 들 수 있다. 이들 세포는, 예를 들어 골수, 제대혈, 말초혈로부터 단리하여 얻을 수도 있고, 보다 더 미분화된 세포인 ES 세포, iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도하여 얻을 수도 있다.
본 명세서에 있어서 「암유전자」란, 생체 내에서 세포의 암화를 유도하는 유전자를 말하며, 예를 들어 MYC 패밀리 유전자(예를 들어, c-MYC, N-MYC, L-MYC), SRC 패밀리 유전자, RAS 패밀리 유전자, RAF 패밀리 유전자, c-Kit, PDGFR, Abl 등의 프로테인 키나아제 패밀리 유전자를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「폴리콤 유전자」란, CDKN2a(INK4a/ARF) 유전자를 음성으로 제어하고, 세포 노화를 회피하기 위해 기능하는 유전자로서 알려져 있다(오구라 등, 재생 의료 vol.6, No.4, pp26-32; Jseus et al., Jseus et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology vol.7, pp667-677, 2006; Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.100, pp211-216, 2003). 폴리콤 유전자의 비한정적인 예로서, BMI1, Mel18, Ring1a/b, Phc1/2/3, Cbx2/4/6/7/8, Ezh2, Eed, Suz12, HADC, Dnmt1/3a/3b를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「아폽토시스 억제 유전자」란, 세포의 아폽토시스를 억제하는 기능을 갖는 유전자를 말하며, 예를 들어 BCL2 유전자, BCL-xL 유전자, Survivin 유전자, MCL1 유전자 등을 들 수 있다.
유전자의 강제 발현 및 강제 발현의 해제는, 국제 공개 제2011/034073호, 국제 공개 제2012/157586호, 국제 공개 제2014/123242 또는 Nakamura S et al, Cell Stem Cell. 14, 535-548, 2014에 기재된 방법, 기타의 공지된 방법 또는 거기에 준하는 방법으로 행할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「혈소판」은, 혈액 내의 세포 성분의 하나이며, CD41a 양성 및 CD42b 양성으로 특징지어진다. 혈소판은 혈전 형성과 지혈에서 중요한 역할을 행함과 함께, 손상 후의 조직 재생이나 염증의 병태 생리에도 관여한다. 출혈 등에 의해 혈소판이 활성화되면, 그의 막 상에 Integrin αIIBβ3(glycoprotein IIb/IIIa; CD41a와 CD61의 복합체) 등의 세포 접착 인자의 수용체가 발현된다. 그 결과, 혈소판끼리가 응집되고, 혈소판으로부터 방출되는 각종 혈액 응고 인자에 의해 피브린이 응고됨으로써, 혈전이 형성되고, 지혈이 진행된다.
혈소판의 기능은 공지된 방법에 의해 측정하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 활성화한 혈소판막 상의 Integrin αIIBβ3에 특이적으로 결합하는 PAC-1에 대한 항체를 사용하여, 활성화한 혈소판량을 측정할 수 있다. 또한, 동일하게 혈소판의 활성화 마커인 CD62P(P-selectin)를 항체로 검출하고, 활성화한 혈소판량을 측정해도 된다. 예를 들어, 플로우 사이토메트리를 사용하여, 활성화 비의존성 혈소판 마커 CD61 또는 CD41에 대한 항체로 게이팅을 행하고, 그 후 항PAC-1 항체나 항CD62P 항체의 결합을 검출함으로써 행할 수 있다. 이들 공정은 아데노신이인산(ADP) 존재 하에서 행해도 된다.
또한, 혈소판의 기능의 평가는, ADP 존재 하에서 피브리노겐과 결합하는지 여부를 보아 행할 수도 있다. 혈소판이 피브리노겐과 결합함으로써, 혈전 형성의 초기에 필요한 인테그린의 활성화가 일어난다.
또한, 혈소판의 기능의 평가는, 국제 공개 제2011/034073호의 도 6에 도시된 바와 같이, in vivo에서의 혈전 형성능을 가시화하여 관찰하는 방법으로 행할 수도 있다.
한편, 혈소판의 CD42b의 발현율이 낮은 경우나, 아넥신 V 양성률이 낮은 경우에는, 혈소판이 열화 또는 이상하다고 평가된다. 이들 혈소판은 혈전 형성이나 지혈 기능을 충분히 갖지 않아, 임상적으로 유용하지 않다.
본 명세서에 있어서 「혈소판의 열화」란, 혈소판 표면의 CD42b(GPIbα)가 감소하는 것을 말한다. 따라서, 열화된 혈소판에는, CD42b의 발현이 저하된 혈소판이나, 쉐딩 반응에 의해 CD42b의 세포외 영역이 절단된 혈소판이 포함된다. 혈소판 표면의 CD42b가 없어지면, 폰ㆍ윌브랜드 인자(von Willebrand factor: VWF)와의 회합을 할 수 없게 되고, 결과적으로, 혈소판의 혈액 응고 기능이 상실된다. 혈소판의 열화는, 혈소판 분획 중의 CD42b 양성률(또는 CD42b 양성 입자수)에 대한 CD42b 음성률(또는 CD42b 음성 입자수)을 지표로서 평가할 수 있다. CD42b 양성률에 대한 CD42b 음성률이 높을수록 또는 CD42b 양성 입자수에 대한 CD42b 음성 입자수가 많을수록, 혈소판은 열화되고 있다. CD42b 양성률이란, 혈소판 분획에 포함되는 혈소판 중, 항CD42b 항체를 결합할 수 있는 혈소판의 비율을 의미하고, CD42b 음성률이란, 혈소판 분획에 포함되는 혈소판 중, 항CD42b 항체가 결합하지 않는 혈소판의 비율을 의미한다.
본 명세서에 있어서 「이상한 혈소판」이란, 음성 전하 인지질인 포스파티딜세린이 지질 이중층의 내측에서 외측으로 노출된 혈소판을 말한다. 생체 내에서는, 포스파티딜세린은 혈소판의 활성화에 따라 표면에 노출되고, 거기에 많은 혈액 응고 인자가 결합함으로써, 혈액 응고 캐스케이드 반응이 증폭되는 것으로 알려져 있다. 한편, 이상한 혈소판에서는, 항상 많은 포스파티딜세린이 표면에 노출되어 있으며, 이러한 혈소판이 환자에게 투여되면, 과잉의 혈액 응고 반응을 야기하여, 파종성 혈관내 응고 증후군 등의 위독한 병태로 연결될 가능성이 있다. 포스파티딜세린에는 아넥신 V가 결합하므로, 혈소판 표면 상의 포스파티딜세린은, 형광 표지된 아넥신 V의 결합량을 지표로 하여 플로우 사이토메트리를 사용하여 검출할 수 있다. 따라서, 이상한 혈소판의 양은, 혈소판 분획 중의 아넥신 V 양성률, 즉, 아넥신이 결합하는 혈소판의 비율 또는 수로 평가할 수 있다. 아넥신 V 양성률이 높을수록 또는 아넥신 V 입자수가 많을수록, 이상한 혈소판은 많다.
본 발명에 있어서의 거핵구 세포의 배양 조건은 통상의 조건으로 할 수 있다. 예를 들어, 온도는 약 35℃ 내지 약 42℃, 약 36℃ 내지 약 40℃, 또는 약 37℃ 내지 약 39℃로 할 수 있고, 5 내지 15％ CO2 및/또는 20％ O2로 해도 된다.
거핵구 세포를 배양할 때의 배지는 특별히 한정되지 않고, 거핵구 세포로부터 혈소판이 산생되기에 바람직한 공지된 배지나 그것에 준하는 배지를 적절히 사용할 수 있다. 예를 들어, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로 하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어 IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, Neurobasal Medium(라이프 테크놀로지스) 및 이들의 혼합 배지를 들 수 있다.
배지에는, 혈청 또는 혈장이 함유되어 있어도 되거나, 또는 무혈청일 수도 있다. 필요에 따라서, 배지는, 예를 들어 알부민, 인슐린, 트란스페린, 셀레늄, 지방산, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 티올글리세롤, 모노티오글리세롤(MTG), 지질, 아미노산(예를 들어 L-글루타민), 아스코르브산, 헤파린, 비필수 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류, 사이토카인 등의 1개 이상의 물질도 함유할 수 있다. 사이토카인이란, 혈구계 분화를 촉진시키는 단백질이며, 예를 들어 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF), 트롬보포이에틴(TPO), 각종 TPO 유사 작용 물질, Stem Cell Factor(SCF), ITS(인슐린-트란스페린-셀레나이트) 서플리먼트, ADAM 저해제 등이 예시된다. 본 발명에 있어서 바람직한 배지는 혈청, 인슐린, 트란스페린, 세린, 티올글리세롤, 아스코르브산, TPO를 포함하는 IMDM 배지이다. 추가로 SCF를 포함하고 있어도 되고, 추가로 헤파린을 포함하고 있어도 된다. 각각의 농도도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 TPO는, 약 10ng/mL 내지 약 200ng/mL, 또는 약 50ng/mL 내지 약 100ng/mL로 할 수 있고, SCF는 약 10ng/mL 내지 약 200ng/mL, 또는 약 50ng/mL로 할 수 있으며, 헤파린은 약 10U/mL 내지 약 100U/mL, 또는 약 25U/mL로 할 수 있다. 포르볼에스테르(예를 들어, 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트; PMA)를 첨가해도 된다.
혈청을 사용하는 경우에는 인간 혈청이 바람직하다. 또한, 혈청 대신에 인간 혈장 등을 사용해도 된다. 본 발명에 따른 방법에 의하면, 이들 성분을 사용해도, 혈청을 사용했을 때와 동등한 혈소판이 얻어진다.
유전자의 강제 발현 및 그의 해제를 위해 Tet-On(등록 상표) 또는 Tet-Off(등록 상표) 시스템과 같은 약제 응답성의 유전자 발현 유도 시스템을 사용하는 경우, 강제 발현하는 공정에 있어서는, 대응하는 약제, 예를 들어 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 배지에 함유시키고, 이들을 배지로부터 제거함으로써 강제 발현을 억제해도 된다.
본 발명에 있어서의 거핵구 세포의 배양 공정은 부유 배양에 의해 행해지므로, 피더 세포없이 실시할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 제조한 혈소판도 포함한다.
본 발명에 따른 혈소판 제제의 제조 방법은, 본 발명에 따른 방법에 의해 거핵구 세포를 배양하여 혈소판을 산생시키고, 배양물로부터 혈소판이 풍부하게 존재하는 분획을 회수하는 공정과, 당해 혈소판 분획으로부터 혈소판 이외의 혈구계 세포 성분을 제거하는 공정을 포함한다. 혈구계 세포 성분을 제거하는 공정은, 백혈구 제거 필터(예를 들어, 데루모사제, 아사히 가세이 메디컬사제) 등을 사용하여, 거핵구 세포를 포함하는 혈소판 이외의 혈구계 세포 성분을 제거함으로써 행할 수 있다. 혈소판 제제의 보다 구체적인 제조 방법은, 예를 들어 국제 공개 제2011/034073호에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 혈액 제제의 제조 방법은, 본 발명에 따른 방법으로 혈소판 제제를 제조하는 공정과, 당해 혈소판 제제를 다른 성분과 혼합하는 공정을 포함한다. 다른 성분으로서는, 예를 들어 적혈구 세포를 들 수 있다.
혈소판 제제 및 혈액 제제에는, 그 외, 세포의 안정화에 이바지하는 다른 성분을 첨가해도 된다.
본 명세서에서 인용되는 모든 특허문헌 및 비특허문헌의 개시는, 전체로서 본 명세서에 참조에 의해 도입된다.
실시예 1
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 전혀 아니다. 당업자는, 본 발명의 의의를 일탈하지 않고 각종 양태로 본 발명을 변경할 수 있으며, 이러한 변경도 본 발명의 범위에 포함된다.
1. 불사화 거핵구 세포의 제작
1-1. iPS 세포로부터의 조혈전구세포의 제조
인간 iPS 세포(TKDN SeV2: 센다이 바이러스를 사용하여 수립된 인간 태아 피부 섬유아세포 유래 iPS 세포)로부터, 문헌 [Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830 (2010)]에 기재된 방법에 따라, 혈구 세포로의 분화 배양을 실시하였다. 즉, 인간 ES/iPS 세포 콜로니를 20ng/mL VEGF(R&D SYSTEMS) 존재 하에서 C3H10T1/2 피더 세포와 14일간 공배양하여 조혈전구세포(Hematopoietic Progenitor Cells; HPC)를 제작하였다. 배양 조건은 20％ O2, 5％ CO2로 실시하였다(특별히 기재되지 않는 한, 이하 동일한 조건).
1-2. 유전자 도입 시스템
유전자 도입 시스템은 렌티바이러스 벡터 시스템을 이용하였다. 렌티바이러스 벡터는 Tetracycline 제어성의 Tet-On(등록 상표) 유전자 발현 유도 시스템 벡터이다. LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G(Kobayashi, T., et al. Cell 142, 787-799 (2010))의 mOKS 카세트를 c-MYC, BMI1, BCL-xL에 재조합함으로써 제작하였다. 각각 LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G, LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G 및 LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G로 하였다.
바이러스 입자는, 293T 세포에 상기 렌티바이러스 벡터를 임의의 방법으로 유전자 도입함으로써 제작하였다.
이러한 바이러스 입자를 목적 세포에 감염시킴으로써, BMI1, MYC 및 BCL-xL의 유전자가 목적 세포의 게놈 서열에 도입된다. 안정적으로 게놈 서열에 도입된 이들 유전자는, 배지에 독시사이클린(clontech #631311)을 첨가함으로써 강제 발현시킬 수 있다.
1-3. 조혈전구세포로의 c-MYC 및 BMI1 바이러스 감염
미리 C3H10T1/2 피더 세포를 파종한 6 well plate 상에, 상기 방법으로 얻어진 HPC를 5x104cells/well씩 파종하고, 렌티바이러스법으로 c-MYC 및 BMI1을 강제 발현시켰다. 이 때, 세포주 1종류에 대해서 6 well씩 사용하였다. 즉, 각각 MOI 20이 되도록 배지 중에 바이러스 입자를 첨가하고, 스핀 인펙션(32℃ 900rpm, 60분간 원심)으로 감염시켰다. 본 조작은 12시간 간격으로 2회 실시하였다.
배지는, 기본 배지(15％ Fetal Bovine Serum(GIBCO), 1％ Penicillin-Streptomycin-Glutamine(GIBCO), 1％ Insulin, Transferrin, Selenium Solution(ITS-G)(GIBCO), 0.45mM 1-Thioglycerol(Sigma-Aldrich), 50μg/mL L-Ascorbic Acid(Sigma-Aldrich)를 함유하는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(Sigma-Aldrich))에 50ng/mL Human thrombopoietin(TPO)(R&D SYSTEMS), 50ng/mL Human Stem Cell Factor(SCF)(R&D SYSTEMS) 및 2μg/mL Doxycycline(Dox)을 첨가한 배지(이하, 분화 배지)에, 추가로 Protamine를 최종 농도 10μg/mL 첨가한 것을 사용하였다.
1-4. 거핵구 자기 증식주의 제작 및 유지 배양
상기 방법으로 cMYC 및 BMI1 바이러스 감염을 실시한 날을 감염 0일째로 하고, 이하와 같이 cMYC 및 BMI1 유전자 도입형 거핵구 세포를 배양함으로써, 거핵구 자기 증식주를 각각 제작하였다. BMI1 유전자, c-MYC 유전자의 강제 발현은, 배지에 독시사이클린(clontech #631311) 1μg/mL를 가함으로써 행하였다.
ㆍ감염 2일째 내지 감염 11일째
피펫팅으로써 상기 방법에서 얻어진 바이러스 감염 완료 혈구 세포를 회수하고, 1200rpm, 5분간 원심 조작을 행하여 상청을 제거한 후, 새로운 분화 배지로 현탁시켜 새로운 C3H10T1/2 피더 세포 상에 파종하였다(6 well plate). 감염 9일째에 동일한 조작을 행함으로써 계대를 실시하였다. 세포수를 계측 후 1×105cells/2mL/well로 C3H10T1/2 피더 세포 상에 파종하였다(6 well plate).
ㆍ감염 12일째 내지 감염 13일째
감염 2일째와 동일한 조작을 실시하였다. 세포수를 계측 후 3×105cells/10mL/100mm dish로 C3H10T1/2 피더 세포 상에 파종하였다(100mm dish).
ㆍ감염 14일째
바이러스 감염 완료 혈구 세포를 회수하고, 세포 1.0×105개당, 항인간 CD41a-APC 항체(BioLegend), 항인간 CD42b-PE 항체(eBioscience), 항인간 CD235ab-pacificblue(BioLegend) 항체를 각각 2μL, 1μL, 1μL씩을 사용하여 항체 반응시켰다. 반응 후에, FACS Verse(BD)를 사용하여 해석하였다. 감염 14일째에서, CD41a 양성률이 50％ 이상이었던 세포를, 거핵구 자기 증식주로 하였다.
1-5. 거핵구 자기 증식주로의 BCL-xL 바이러스 감염
상기 감염 14일째의 거핵구 자기 증식주에, 렌티바이러스법으로 BCL-xL을 유전자 도입하였다. MOI 10이 되도록 배지 중에 바이러스 입자를 첨가하고, 스핀 인펙션(32℃ 900rpm, 60분간 원심)으로 감염시켰다. BCL-xL 유전자의 강제 발현은, 배지에 독시사이클린(clontech #631311) 1μg/mL를 가함으로써 행하였다.
1-6. 거핵구 불사화주의 제작 및 유지 배양
ㆍ감염 14일째 내지 감염 18일째
전술한 방법으로 얻어진 BCL-xL을 유전자 도입한 거핵구 자기 증식주를 회수하고, 1200rpm, 5분간 원심 조작을 행하였다. 원심 후, 침전된 세포를 새로운 분화 배지로 현탁시킨 후, 새로운 C3H10T1/2 피더 세포 상에 2×105cells/2mL/well로 파종하였다(6 well plate).
ㆍ감염 18일째: 계대
세포수를 계측 후, 3×105cells/10mL/100mm dish로 파종하였다.
ㆍ감염 24일째: 계대
세포수를 계측 후, 1×105cells/10mL/100mm dish로 파종하였다. 이후, 4 내지 7일마다 계대를 행하고, 유지 배양을 행하였다.
감염 24일째에 BCL-xL을 유전자 도입한 거핵구 자기 증식주를 회수하고, 세포 1.0×105개당, 항인간 CD41a-APC 항체(BioLegend), 항인간 CD42b-PE 항체(eBioscience), 항인간 CD235ab-Pacific Blue(Anti-CD235ab-PB; BioLegend) 항체를 각각 2μL, 1μL, 1μL씩을 사용하여 면역 염색한 후에 FACS Verse(BD)를 사용하여 해석하고, 감염 24일째에서도, CD41a 양성률이 50％ 이상인 주를 불사화 거핵구 세포주로 하였다. 감염 후 24일 이상 증식할 수 있었던 이들 세포를, 불사화 거핵구 세포주 SeV2-MKCL로 하였다.
얻어진 SeV2-MKCL을 10cm 디쉬(10mL/디쉬)에서 정치 배양하였다. 배지는 IMDM을 기본 배지로 하여, 이하의 성분을 첨가하였다(농도는 최종 농도).
FBS(시그마 #172012 lot.12E261) 15％
L-Glutamin(Gibco #25030-081) 2mM
ITS(Gibco #41400-045) 100배 희석
MTG(monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μM
아스코르브산(sigma #A4544) 50μg/mL
Puromycin(sigma #P8833-100MG) 2μg/mL
SCF(와코 쥰야쿠 #193-15513) 50ng/mL
TPO 유사 작용 물질 200ng/mL
배양 조건은 37℃, 5％ CO2로 하였다.
2. 혈소판의 생산
이어서, 독시사이클린을 포함하지 않는 배지에서 배양함으로써 강제 발현을 해제하였다. 구체적으로는, 1.의 방법에서 얻은 불사화 거핵구 세포주(SeV2-MKCL)를 PBS(-)로 2회 세정하고, 1.0x105cells/mL의 파종 밀도로 다음 배지에 현탁시켰다.
배지는, IMDM에 이하의 성분이 포함된 것이다(농도는 최종 농도).
FBS 15％
L-Glutamine(Gibco #25030-081) 2mM
ITS(Gibco #41400-045) 100배 희석
MTG(monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μM
아스코르브산(sigma #A4544) 50μg/mL
SCF(와코 쥰야쿠 #193-15513) 50ng/mL
TPO 유사 작용 물질 200ng/mL
ADAM 저해제 15μM
SR1 750nM
ROCK 저해제 10μM
전술한 1.의 방법으로 얻은 불사화 거핵구 세포주(SeV2-MKCL)를 상기 배지에 현탁시켜 세포 현탁액을 조정하였다. 당해 세포 현탁액 2.4L를 바이오리액터(10)에 첨가하고, 당해 세포 현탁액 25mL를 125mL 용적 셰이커 플라스크에 첨가하였다. 바이오리액터(10)는 적어도 1단 이상의 교반 블레이드(14)를 가지고, 동일한 교반 블레이드(14)를 상하 방향으로 왕복 이동시킬 수 있는 3.0L 용적의 VMF 배양 장치(이하, VMF라 기재함)를 사용하였다.
VMF의 사양은 다음과 같다. 본체 외형 치수법(mm): 300W×485D×890H, 배양조(11)의 치수(mm): 내경 140×깊이 203, 배양조(11)의 액량: 3.0L, 교반 블레이드(14): 하단 타원 형상 절곡 구조+상단 평판 타원 형상 2단 설치, 직동 전달 방식: 리니어 샤프트 드라이브 논시일식, 온도 조절 범위: 실온+5 내지 20℃, 상하 이동 진폭: 10 내지 30mm, 상하 이동 최대 날개 속도: 80 내지 150mm/s, 계측 제어: 교반, 온도, pH, 용존 산소, 레벨, 피드. 도 4에 VMF를 나타낸다.
VMF에서는, 2.4L의 불사화 거핵구 세포주 현탁액의 배양을 행하였다. 배양 환경은 37℃ 및 5％ CO2로 하였다. 교반 속도는 1.6Hz로 하고, 교반 스트로크 길이는 3cm로 하였다.
125mL 용적 셰이커 플라스크에서는, 25mL의 불사화 거핵구 세포주 현탁액의 배양을 행하였다. 진탕 배양기(N-BIOTEK, AniCell)를 사용하여, 37℃ 및 5％ CO2 환경 하에 100rpm 속도로 진탕 배양하였다.
3. 혈소판의 측정
상기 2.의 방법에서 생산된 혈소판을 측정하기 위해서, 강제 발현 해제 후, 배양 6일 후의 배양 상청 샘플을 회수하고, 각종 항체에 의한 염색과 함께, 플로우 사이토메트리를 사용한 분석을 하였다. CD41a 양성 CD42b 양성의 입자수를 정상 혈소판수로 하고, CD41a 양성 CD42b 음성인 입자수를 열화 혈소판수로 하였다. 아넥신 V 양성의 입자수를 이상 혈소판수로 하였다. 또한, 샘플을 PMA 또는 ADP/Thrombin으로 자극하고, 자극 전후의 PAC-1 및 CD62p의 양성률을 산출하여 생리 활성을 측정하였다.
자세한 측정 방법과 결과는 이하와 같다.
3-1. 혈소판의 측정
정상 혈소판, 열화 혈소판, 혈소판의 생리 활성의 측정을 위해서, 1.5mL 마이크로튜브에 희석액 900mL를 첨가하고, 거기에 배양 상청 100mL를 첨가하여 혼합하였다. 희석 혼합한 배양 상청 200mL를 FACS 튜브에 분주하고, 이하의 표지 항체 또는 단백질을 첨가하여 염색을 행하였다. 이상 혈소판의 측정을 위해서, 배양 상청 100mL를 FACS 튜브에 분주하고, 이하의 표지 항체 또는 단백질을 첨가하여 염색을 행하고, 플로우 사이토메트리 분석 직전에 아넥신 V binding buffer(BD)로 5배 희석하여 분석하였다.
사용한 항체는 이하와 같다.
정상 혈소판 및 열화 혈소판의 측정
0.5μL 항CD41 항체 APC 표지(Bio Legend 303710)
0.5μL 항CD42a 항체 PB 표지(eBioscience 48-0428-42)
0.5μL 항CD42b 항체 PE 표지(eBioscience 12-0428-42)
혈소판의 생리 활성의 측정
0.5μL 항CD42a 항체 PB 표지(eBioscience 48-0428-42)
0.5μL 항CD42b 항체 PE 표지(eBioscience 12-0428-42)
0.5μL 항CD62p 항체 APC 표지(Bio Legend 304910)
10μL 항PAC-1 항체 FITC 표지(BD 303704)
이상 혈소판수의 측정
0.5μL 항CD41 항체 APC 표지(Bio Legend 303710)
0.5μL 항CD42a 항체 PB 표지(eBioscience 48-0428-42)
5μL Annexin V FITC 표지(BD, 556419)
3-2. 정상 혈소판 생산량의 측정
결과를 도 5에 도시한다. 정상 혈소판 생산량은, VMF에 의한 배양에서는, 셰이커 플라스크에 의한 배양에 비교하여 높았다(도 5의 (B)). 또한, 거핵구 세포수당 정상 혈소판수를 정상 혈소판 생산 효율로서 산출한 경우, 셰이커 플라스크에 의한 배양에 비해, VMF에 의한 배양에서는, 당해 정상 혈소판 생산 효율이 약 6.0 내지 7.7배 높았다(도 5의 (C)). 즉, VMF에 의한 배양에 의해, 종래의 셰이커 플라스크에 의한 배양보다도, 거핵구 세포수당 정상 혈소판 생산량을 증가시킬 수 있었다.
3-3. 열화 혈소판의 측정
열화 혈소판을 측정할 때, 상기 3-1.의 방법에 의해, 각 처리 샘플을 플로우 사이토메트리를 사용하여 분석하고, CD41a 양성 CD42b 양성 및 CD41a 양성 CD42b 음성, 각각의 입자수를 측정하였다. 그리고, CD41a 양성 CD42b 양성의 입자수를 정상 혈소판수, 및 CD41a 양성 CD42b 음성인 입자수를 열화 혈소판수로 하여, 정상 혈소판수에 대한 열화 혈소판수의 비율을 산출하였다.
결과를 도 5에 도시한다. VMF에 의한 배양에서의 정상 혈소판수에 대한 열화 혈소판수의 비율은, 셰이커 플라스크에 의한 배양에서의 정상 혈소판수에 대한 열화 혈소판수의 비율의 약 0.31 내지 0.39배로 감소하였다(도 5의 (A)). 즉, VMF에 의한 배양에 의해, 종래의 셰이커 플라스크에 의한 배양보다도, 열화 혈소판의 생산량을 낮게 억제할 수 있었다.
3-3. 혈소판 생리 활성의 측정
혈소판의 자극은, PMA 0.2mM(포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트, sigma #P1585-1MG), 또는 ADP 100μM(sigma #A2754) 및 Thrombin 0.5U/mL(sigma)로 실온에서 행하였다. 자극 30분 후에 BD사 FACSverce로 측정을 실시하였다. CD42a 양성의 혈소판 분획에 있어서의, 자극 전후의 PAC-1 양성률 및 CD62p 양성률을 측정하고, 비교 평가하였다.
결과를 도 6 및 도 7에 나타낸다. VMF에 의한 배양에서는, 셰이커 플라스크에 의한 배양에 비교하여, PMA 또는 ADP/Thrombin 자극 시의 PAC-1 양성률이 약 1.9 내지 3.1배 높았다(도 6). 또한, VMF에 의한 배양에서는, 셰이커 플라스크에 의한 배양에 비교하여, CD62p 양성률이 약 1.8 내지 2.7배 이상 높았다(도 7). 즉, VMF에 의한 배양에 의해, 종래의 셰이커 플라스크에 의한 배양보다도, 생리 활성이 높은 혈소판의 생산량을 증가시킬 수 있었다.
3-4. 이상 혈소판의 측정
상기 3-1.의 방법에 의해, 각 처리 샘플을 플로우 사이토메트리를 사용하여 분석하고, 아넥신 V 양성의 입자수를 측정하였다. CD42b 양성 아넥신 V 양성의 입자수를 이상 혈소판수로 하였다.
결과를 도 8에 나타낸다. VMF에 의한 배양에서는, 셰이커 플라스크에 의한 배양에 비교하여, CD42b 양성 아넥신 V 양성의 입자수가 약 0.31 내지 0.34배 미만으로 감소하였다(도 8). 즉, VMF에 의한 배양에 의해, 종래의 셰이커 플라스크에 의한 배양보다도, 이상 혈소판의 생산량을 낮게 억제할 수 있었다.
본 발명에 의해, 셰이커 플라스크에 의한 진탕 배양에서는 달성할 수 없는 고품질의 혈소판을 얻을 수 있음은 명백하다. 따라서, 본 발명은 혈소판의 공업 레벨의 대량 생산의 실현에 공헌할 수 있는 것이다.

Claims (13)

  1. 혈소판의 제조 방법으로서,
    배양 용기 내의 배양액 중에서 거핵구 세포를 배양하는 배양 공정을 포함하며,
    상기 배양 공정에서, 상기 배양액을 왕복 이동하는 교반 블레이드로 교반하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양 공정에 사용되는 상기 교반 블레이드를 상하 방향 또는 좌우 방향 또는 정역 회전 방향으로 왕복 이동하여 배양액을 비정상 교반하는 바이오리액터를 사용하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배양 공정에 사용되는 상기 교반 블레이드는 타원 형상이며, 상기 배양 공정에서 상기 교반 블레이드를 상하로 왕복하여 배양액을 교반하는 바이오리액터를 사용하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배양 공정에 사용되는 상기 교반 블레이드는 타원 형상 절곡 구조이며, 상기 배양 공정에서 상기 교반 블레이드를 상하로 왕복하여 배양액을 교반하는 바이오리액터를 사용하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배양 공정에 사용되는 상기 교반 블레이드는 절곡 타원 형상이며, 평판 타원 형상의 교반 블레이드와 직교하여 교반축에 1단 이상 설치되어 있고, 상기 배양 공정에서 상기 교반 블레이드를 상하로 왕복하여 배양액을 교반하는 바이오리액터를 사용하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교반 블레이드로서, 스루홀이 형성된 것을 사용하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 배양 용기가 밀폐형 바이오리액터인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 거핵구 세포가,
    거핵구 세포로부터 미분화된 세포에서, 암유전자, 폴리콤 유전자 및 아폽토시스 억제 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 유전자의 적어도 하나를 강제 발현한 후, 당해 강제 발현을 해제한 세포인, 방법.
  9. 혈소판 제제의 제조 방법으로서,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 거핵구 세포에 혈소판을 산생시키고, 배양물로부터 혈소판을 회수하는 공정과,
    상기 혈소판으로부터 혈소판 이외의 혈구계 세포 성분을 제거하는 공정을 포함하는, 방법.
  10. 혈액 제제의 제조 방법으로서,
    제9항에 기재된 방법으로 혈소판 제제를 제조하는 공정과,
    상기 혈소판 제제를 다른 성분과 혼합하여 혈액 제제를 얻는 공정을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 혈소판.
  12. 제8항에 기재된 방법으로 제조된 혈소판 제제, 또는 제11항에 기재된 혈소판을 포함하는, 혈소판 제제.
  13. 제10항에 기재된 방법으로 제조된 혈액 제제, 또는 제11항에 기재된 혈소판을 포함하는, 혈액 제제.
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