FR3122185A1 - Procede de liberation de plaquettes en regime turbulent et systeme de liberation de plaquettes pour la mise en œuvre de ce procede - Google Patents

Procede de liberation de plaquettes en regime turbulent et systeme de liberation de plaquettes pour la mise en œuvre de ce procede Download PDF

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Valentin DO SACRAMENTO
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Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Francais du Sang Ets
Universite de Strasbourg
Ecole Centrale de Marseille
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Abstract

L’invention concerne un procédé de libération des plaquettes à partir de mégacaryocytes contenus dans un fluide (F), ledit procédé étant mis en œuvre au moyen d’un système (1) comprenant deux cylindres (11, 13) concentriques, un cylindre intérieur (11) comprenant une paroi (12) cylindrique et un cylindre extérieur (13) creux situé radialement externe par rapport au cylindre intérieur (11), ledit cylindre extérieur (13) comprenant une paroi (14) cylindrique d’une base (13a) au niveau de laquelle ledit deuxième cylindre est fermé, lesdits cylindres (11, 13) étant séparés par un espace (15) dépourvu de toute pièce mécanique, ledit espace (15) étant destiné à recevoir le fluide (F), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : (100) alimenter ledit espace (15) avec un fluide (F) comprenant des mégacaryocytes,(200) déplacer le cylindre intérieur (11) en rotation autour de son axe, le cylindre extérieur (13) étant fixe, ou déplacer les deux cylindres (11, 13) en sens inverse autour de leurs axes, de sorte à générer un écoulement de fluide (F) au moins partiellement turbulent dans ledit espace (15) et obtenir un deuxième fluide (F’) enrichi en plaquettes. Figure pour l’abrégé : Fig. 1a

Description

PROCEDE DE LIBERATION DE PLAQUETTES EN REGIME TURBULENT ET SYSTEME DE LIBERATION DE PLAQUETTES POUR LA MISE EN ŒUVRE DE CE PROCEDE
Domaine technique de l’invention
L’invention concerne un procédé de libération de plaquettes à partir d’un fluide comprenant notamment des progéniteurs de mégacaryocytes. Le procédé selon l’invention est mis en œuvre au moyen d’un système pour la libération de plaquettes conçu à cet effet. L’invention concerne en outre un tel système de libération des plaquettes. L’invention est plus particulièrement adaptée à la production in vitro de plaquettes sanguines à une échelle industrielle et à la production de vésicules extracellulaires.
Arrière-plan technique
Jusqu’ici, la solution usitée pour la mise en œuvre de procédés de libération des plaquettes in vitro au moyen de systèmes de petites tailles – typiquement de quelques dizaines de micromètre à quelques cm – consiste à reproduire les mécanismes naturels de libération des plaquettes se produisant dans le corps humain. Pour cette raison, ces procédés sont dits biomimétiques.
Les mécanismes menant à la libération des plaquettes se produisant dans le corps humain font encore l’objet de nombreuses recherches. On sait que la libération de plaquettes intervient au cours d’un processus de fragmentation des mégacaryocytes et/ou des extensions cytoplasmiques en plaquettes. Ce processusin vivotrès coordonné se produit de manière naturelle dans le sang lors du passage des extensions cytoplasmiques à travers la barrière endothéliale puis des proplaquettes dans la microcirculation pulmonaire au moment de la maturation, cela grâce à la force du flux sanguin. Les mégacaryocytes y jouent un rôle essentiel puisque ce sont des cellules précurseurs. Ces mécanismes sont opérés à des vitesses très lentes dans le corps humain et c’est aussi également à vitesse relativement lente que la production de plaquettes est effectuée dans les réacteurs microfluidiques biomimétiques existants.
On a ainsi proposé dans le document WO2014107240A1 des bioréacteurs microfluidiques comprenant des structures comportant des parois microperforées qui, lorsque le fluide y circule, simulent le passage endothélial. En fonctionnement normal, le régime d’écoulement du fluide est laminaire et les taux de cisaillement mesurés au niveau des parois microperforées correspondent à des taux de cisaillement physiologiques. Les durées de traitements sont généralement de plusieurs heures. Il en est de même pour le document WO2018165308 A1, dans lequel une membrane joue le rôle de la paroi microperforée du document WO2014107240A1.
Récemment, on a cherché à industrialiser le procédé de libération des plaquettes et de nouveaux types de bioréacteurs ont été développés. Le document WO201909364A1 divulgue un exemple de bioréacteur destiné à ce type d’usage. Le système proposé vise à augmenter le nombre et la durée de vie de plaquettes saines. Il comprend un réservoir pour le fluide comportant des mégacaryocytes et au moins un moyen pour générer un écoulement turbulent à l’intérieur du réservoir de sorte à permettre la libération des plaquettes. Dans un mode de réalisation, le moyen consiste en une pale se déplaçant en va et vient le long du réservoir. L’inconvénient d’un tel système réside dans le fait que la pale est susceptible d’entrer en collision avec les mégacaryocytes contenus dans le fluide, ce qui a pour conséquence de détériorer une partie non négligeable des précurseurs mégacaryocytaires obtenus lors de l’utilisation du système. En effet, déjà du fait de leur présence dans le volume dans lequel le fluide se déplace, les pales sont responsables de collisions avec les précurseurs mégacaryocytaires. Ensuite, le déplacement des pales est susceptible de générer des impacts de plus fortes intensités avec les précurseurs mégacaryocytaires. Une portion non négligeable des plaquettes obtenues a donc une activité significativement réduite voire inexistante. En outre, le couvercle 1a du réservoir de culture/libération laisse passer l'axe qui permet le mouvement de va et vient de la pale. Un tel agencement est susceptible d’empêcher un maintien des conditions stériles dans le réservoir.
L’invention vise à surmonter les inconvénients précités et propose à cet effet un procédé de libération des plaquettes à partir de mégacaryocytes contenus dans un fluide, ledit procédé étant mis en œuvre au moyen d’un système comprenant deux cylindres concentriques, un cylindre intérieur comprenant une paroi cylindrique et un cylindre extérieur creux situé radialement externe par rapport au cylindre intérieur, ledit cylindre extérieur comprenant une paroi cylindrique d’une base au niveau de laquelle ledit deuxième cylindre est fermé, lesdits cylindres étant séparés par un espace dépourvu de toute pièce mécanique, ledit espace étant destiné à recevoir le fluide, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
(100) alimenter ledit espace avec un fluide comprenant des mégacaryocytes,
(200) déplacer le cylindre intérieur en rotation autour de son axe, le cylindre extérieur étant fixe, ou déplacer les deux cylindres en sens inverse autour de leurs axes, de sorte à générer un écoulement de fluide au moins partiellement turbulent dans ledit espace et obtenir un deuxième fluide enrichi en plaquettes.
Le procédé de libération des plaquettes en régime turbulent selon l’invention permet de prévenir toute dégradation des plaquettes grâce à la structure de son système de libération des plaquettes, permet ainsi d’améliorer significativement le rendement de libération des plaquettes et préfigure un procédé industriel. Les cylindres concentriques du système utilisé dans le procédé selon l’invention sont séparés par un espace dépourvu de toute pièce mécanique de sorte que lorsque le(les) cylindre(s) se déplace(nt) autour de son(leur) axe(s), les plaquettes sont libérées dans le fluide sans qu’aucune autre pièce ou élément du système situé dans l’espace inter-cylindre ne puisse les impacter.
En outre, les cylindres étant concentriques cela garantit un entrefer constant le long des parois. L’entrefer est la distance séparant les deux parois. Il constitue un paramètre opératoire sur lequel il est possible d’agir pour mieux contrôler le régime d’écoulement dans le système afin de permettre la libération des plaquettes. Parallèlement, la valeur de l’entrefer à proprement parlé, permet d’améliorer encore plus ce rendement de libération des plaquettes. Il est également possible d’agir sur la vitesse de déplacement du(des) cylindre(s) qui se déplace(nt) pour obtenir les conditions d’un régime d’écoulement turbulent du fluide. Ainsi, lors de la mise en œuvre du procédé, les paramètres opératoires peuvent être ajustés pour obtenir les conditions propres au régime d’écoulement turbulent.
Selon différentes caractéristiques de l’invention prises ensemble ou séparément :
- lorsqu’on déplace le cylindre intérieur alors que le cylindre extérieur est fixe, le cylindre intérieur est déplacé de sorte à définir un nombre de Reynolds supérieur ou égal à 1400, oùr i est le rayon du cylindre intérieur, est la vitesse angulaire du cylindre intérieur,dest une distance séparant le cylindre intérieur du cylindre extérieur et est la viscosité cinématique du fluide entre lesdits cylindres intérieur et extérieur ;
- lorsqu’on déplace les deux cylindres en sens inverse, le cylindre intérieur et le cylindre extérieur sont déplacés de sorte à définir respectivement un nombre de Reynolds supérieur à 1000et un nombre de Reynolds supérieur à 1000 , oùr i est le rayon du cylindre intérieur,r o est le rayon du cylindre extérieur, est la vitesse angulaire du cylindre intérieur, est la vitesse angulaire du cylindre extérieur,dest une distance séparant le cylindre intérieur du cylindre extérieur et est la viscosité cinématique du fluide entre lesdits cylindres intérieur et extérieur ;
- les deux cylindres sont séparés par une distance d inférieure à 5 mm ;
- les deux cylindres sont séparés par une distance d comprise entre 2 mm et 4 mm ;
- les deux cylindres sont séparés par une distance d d’environ 3 mm ;
- lors de l’étape 100, l’espace est alimenté continuellement avec le fluide, le système comprenant une entrée pour remplir l’espace dudit fluide et une ouverture pour évacuer le fluide enrichi en plaquettes, ladite ouverture étant située au niveau de la base ;
- lors de l’étape 200, le temps de résidence du fluide dans ledit espace est compris entre 4 minutes et 6 minutes, de préférence est d’environ 5 minutes ;
- le cylindre intérieur et le cylindre extérieur comprennent d’autres parois internes périphériques formant respectivement une première empreinte et une deuxième empreinte, lesdites première et deuxième empreintes étant imbriquées l’une dans l’autre de sorte que lesdites autres parois du cylindre intérieur et autres parois du cylindre extérieur sont concentriques les unes par rapport aux autres et au moins partiellement en vis-à-vis les unes des autres ;
- procédé dans lequel on libère en outre des vésicules extracellulaires.
Selon un mode de réalisation alternatif de la présente invention, le procédé concerne un procédé de libération des plaquettes à partir de mégacaryocytes contenus dans un fluide, ledit procédé étant mis en œuvre au moyen d’un système comprenant deux parois planes parallèles séparées par un espace dépourvu de toute pièce mécanique, ledit espace étant destiné à recevoir le fluide, lesdites parois étant apte à se déplacer, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
(100) alimenter ledit espace avec un fluide comprenant des mégacaryocytes,
(200) déplacer une desdites parois planes dans un plan de ladite paroi plane, l’autre desdites parois étant fixe, ou déplacer les deux parois en sens inverse, chaque paroi étant déplacée dans son plan, de sorte à générer un écoulement de fluide au moins partiellement turbulent dans ledit espace et obtenir un deuxième fluide enrichi en plaquettes.
Selon différentes caractéristiques de l’invention prises ensemble ou séparément :
- la première paroi plane est la paroi d’un premier tapis roulant et la deuxième paroi plane est la paroi d’un deuxième tapis roulant ;
- lorsque les deux parois se déplacent en sens inverse, les deux parois se déplacent en sens inverse à la même vitesse ;
- les deux parois se déplacent à une vitesse d’environ 1 mètre par seconde ;
- lorsque les deux parois se déplacent en sens inverse, dans lequel les deux parois se déplacent avec un écart de vitesse d’au plus 10% par rapport à une valeur moyenne ;
- on libère en outre des vésicules extracellulaires.
Brève description des figures
La illustre de manière schématique, en perspective, un système de libération de plaquettes permettant la mise en œuvre du procédé selon un premier mode de réalisation de l’invention ;
La illustre de manière schématique, en coupe, un système de libération de plaquettes permettant la mise en œuvre du procédé selon un premier mode de réalisation de l’invention ;
La illustre de manière schématique, en vue de dessus, le système de libération de plaquettes de la figure 1 avec le profil des vitesses entre le cylindre intérieur et le cylindre extérieur, lorsque les deux cylindres tournent. La figure du bas illustre le profil de vitesse radial du fluide dans l’espace ;
La illustre de manière schématique, en vue de dessus, le système de libération de plaquettes de la figure 1 avec le profil des vitesses entre le cylindre intérieur et le cylindre extérieur, lorsque le cylindre intérieur tourne. La figure du bas illustre le profil de vitesse radial du fluide dans l’espace ;
La illustre de manière schématique, en perspective, une variante de réalisation du système de libération de plaquettes illustré à la figure 1 ;
La illustre de manière schématique, en coupe, une variante de réalisation du système de libération de plaquettes illustré à la figure 1 ;
La illustre de manière schématique, en perspective, un système de libération de plaquettes permettant la mise en œuvre du procédé selon un deuxième mode de réalisation de l’invention ;
La illustre de manière schématique, en coupe, un système de libération de plaquettes permettant la mise en œuvre du procédé selon un deuxième mode de réalisation de l’invention ;
La illustre de manière schématique une variante de réalisation du système de libération de plaquettes illustré aux figures 4a et 4b ;
La illustre de manière schématique une variante de réalisation du système de libération de plaquettes illustré aux figures 4a et 4b ;
La illustre le diagramme d’Andereck (1986) ;
La illustre le nombre de plaquettes double positives pour un échantillon de référence, pour un échantillon traité avec le procédé selon l’invention avec un système de libération des plaquettes selon le mode de réalisation illustré aux figures 1a et 1b avec un entrefer de 3 mm, de 4 mm et de 5 mm (de la gauche vers la droite), les cylindres tournant en sens inverse ;
La illustre le nombre de plaquettes double positives pour un échantillon de référence (point de gauche), pour un échantillon traité avec le procédé selon l’invention avec un système de libération des plaquettes tel qu’illustré aux figures 1a et 1b avec un entrefer de 3 mm, les cylindres tournant en sens inverse (point central), le cylindre intérieur étant le seul à tourner (point à droite) ;
La est un exemple de dispositif à deux cylindres pour la mise en œuvre du procédé de la présente ;
La illustre le nombre de plaquettes CD41+ et CD42+ libérées pour a) le passage de 5 000 billes en cytométrie en flux, b) pour le nombre de plaquettes par cellule au 7èmejour de culture, et c) pour le nombre de plaquettes par CD34+ ensemencées, les colonnes en blanc représentants les résultats obtenus avec une pipette, les colonnes en gris représentant les résultats obtenus dans une configuration où les deux cylindres tournent en sens inverse et les colonnes en noir représentant les résultats obtenus dans une configuration où seul le cylindre intérieur tourne ;
La illustre le nombre de plaquettes exprimant les glycoprotéines majeures à leur surface, en fonction du mode de libération. Sur la figure 11a, il s’agit d’une comparaison du pourcentage de plaquettes positives entre une configuration où les deux cylindres tournent en sens inverse (colonnes grises) et une configuration où seul le cylindre intérieur tourne (colonnes noires). Sur la figure 11b, il s’agit d’une comparaison entre une configuration où les deux cylindres tournent en sens inverse (colonnes grises) et une utilisation d’une pipette (colonnes blanches). Sur la figure 11c, il s’agit d’une comparaison entre une configuration où seul le cylindre intérieur tourne (colonnes noires) et une utilisation d’une pipette (colonnes blanches) ;
La illustre l’état pré-activé (au repos) des plaquettes libérées et leur capacité d’activation lorsqu’elles sont mises en présence d’un antagoniste (thrombine), les colonnes en blanc représentants les résultats obtenus avec une pipette, les colonnes en gris représentant les résultats obtenus dans une configuration où les deux cylindres tournent en sens inverse et les colonnes en noir représentant les résultats obtenus dans une configuration où seul le cylindre intérieur tourne. La figure de gauche correspond aux résultats obtenus en analysant un marqueur de pré-activation GPIIb-IIIa tandis que la figure de droite correspond aux résultats obtenus en analysant l’expression de la P-Sélectine à la surface des plaquettes ;
La illustre du phénomène de recirculation des plaquettes (rapport du nombre de plaquettes par le nombre de plaquettes à 3 minutes en fonction du temps) pour des plaquettes de culture dans un organisme murin obtenues avec le procédé de l’invention dans le cas où seul le cylindre intérieur tourne (Figure de gauche, carrés) en comparaison d’un mélange de concentré plaquettaire (Figure de gauche, cercles pleins) et des plaquettes de culture obtenues avec le procédé de l’invention dans le cas où les deux cylindres tournent en sens inverse (Figure de droite, carrés) en comparaison d’un mélange de concentré plaquettaire (Figure de droite, cercles pleins) ;
La illustre des images d’immunofluorescence des plaquettes libérées par pipetage manuel (Figure 14a)), avec le procédé de l’invention dans le cas où seul le cylindre intérieur tourne (Figure 14b)), avec le procédé de l’invention dans le cas où les deux cylindres tournent en sens inverse.

Claims (15)

  1. Procédé de libération des plaquettes à partir de mégacaryocytes contenus dans un fluide (F), ledit procédé étant mis en œuvre au moyen d’un système (1) comprenant deux cylindres (11, 13) concentriques, un cylindre intérieur (11) comprenant une paroi (12) cylindrique et un cylindre extérieur (13) creux situé radialement externe par rapport au cylindre intérieur (11), ledit cylindre extérieur (13) comprenant une paroi (14) cylindrique d’une base (13a) au niveau de laquelle ledit deuxième cylindre est fermé, lesdits cylindres (11, 13) étant séparés par un espace (15) dépourvu de toute pièce mécanique, ledit espace (15) étant destiné à recevoir le fluide (F), ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
    (100) alimenter ledit espace (15) avec un fluide (F) comprenant des mégacaryocytes,
    (200) déplacer le cylindre intérieur (11) en rotation autour de son axe, le cylindre extérieur (13) étant fixe, ou déplacer les deux cylindres (11, 13) en sens inverse autour de leurs axes, de sorte à générer un écoulement de fluide (F) au moins partiellement turbulent dans ledit espace (15) et obtenir un deuxième fluide (F’) enrichi en plaquettes.
  2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, lorsqu’on déplace le cylindre intérieur (11) alors que le cylindre extérieur (13) est fixe, le cylindre intérieur est déplacé de sorte à définir un nombre de Reynolds supérieur ou égal à 1400, oùr i est le rayon du cylindre intérieur (11), est la vitesse angulaire du cylindre intérieur (11),dest une distance séparant le cylindre intérieur (11) du cylindre extérieur (13) et est la viscosité cinématique du fluide entre lesdits cylindres intérieur et extérieur.
  3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, lorsqu’on déplace les deux cylindres (11, 13) en sens inverse, le cylindre intérieur (11) et le cylindre extérieur (13) sont déplacés de sorte à définir respectivement un nombre de Reynolds supérieur à 1000 et un nombre de Reynolds supérieur à 1000 , oùr i est le rayon du cylindre intérieur (11),r o est le rayon du cylindre extérieur (13), est la vitesse angulaire du cylindre intérieur (11), est la vitesse angulaire du cylindre extérieur (13),dest une distance séparant le cylindre intérieur (11) du cylindre extérieur (13) et est la viscosité cinématique du fluide entre lesdits cylindres intérieur et extérieur.
  4. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les deux cylindres (11, 13) sont séparés par une distance (d) inférieure à 5 mm.
  5. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les deux cylindres (11, 13) sont séparés par une distance (d) comprise entre 2 mm et 4 mm.
  6. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les deux cylindres (11, 13) sont séparés par une distance (d) d’environ 3 mm.
  7. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, lors de l’étape (100), l’espace (15) est alimenté continuellement avec le fluide (F), le système (1) comprenant une entrée (2) pour remplir l’espace (15) dudit fluide (F) et une ouverture (3) pour évacuer le fluide (F’) enrichi en plaquettes, ladite ouverture (3) étant située au niveau de la base (13a).
  8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel, lors de l’étape (200), le temps de résidence du fluide (F) dans ledit espace (15) est compris entre 4 minutes et 6 minutes, de préférence est d’environ 5 minutes.
  9. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le cylindre intérieur (11) et le cylindre extérieur (13) comprennent d’autres parois (122, 142) internes périphériques formant respectivement une première empreinte (120) et une deuxième empreinte (140), lesdites première et deuxième empreintes (120, 140) étant imbriquées l’une dans l’autre de sorte que lesdites autres parois (122) du cylindre intérieur (11) et autres parois (142) du cylindre extérieur (13) sont concentriques les unes par rapport aux autres et au moins partiellement en vis-à-vis les unes des autres.
  10. Procédé de libération des plaquettes à partir de mégacaryocytes contenus dans un fluide (F), ledit procédé étant mis en œuvre au moyen d’un système (1) comprenant deux parois (12, 14) planes parallèles séparées par un espace (15) dépourvu de toute pièce mécanique, ledit espace (15) étant destiné à recevoir le fluide (F), lesdites parois (12, 14) étant apte à se déplacer, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
    (100) alimenter ledit espace (15) avec un fluide (F) comprenant des mégacaryocytes,
    (200) déplacer une desdites parois (12, 14) planes dans un plan de ladite paroi plane, l’autre desdites parois (12, 14) étant fixe, ou déplacer les deux parois (12, 14) en sens inverse, chaque paroi étant déplacée dans son plan, de sorte à générer un écoulement de fluide (F) au moins partiellement turbulent dans ledit espace (15) et obtenir un deuxième fluide (F’) enrichi en plaquettes.
  11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel la première paroi (12) plane est la paroi d’un premier tapis roulant et la deuxième paroi (14) plane est la paroi d’un deuxième tapis roulant.
  12. Procédé selon l’une quelconque des revendications 10 ou 11, lorsque les deux parois (12, 14) se déplacent en sens inverse, dans lequel les deux parois (12, 14) se déplacent en sens inverse à la même vitesse.
  13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel les deux parois (12, 14) se déplacent à une vitesse d’environ 1 mètre par seconde.
  14. Procédé selon l’une quelconque des revendications 10 ou 11, lorsque les deux parois (12, 14) se déplacent en sens inverse, dans lequel les deux parois (12, 14) se déplacent avec un écart de vitesse d’au plus 10% par rapport à une valeur moyenne.
  15. Procédé de libération des plaquettes selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on libère en outre des vésicules extracellulaires.
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