EP2670835A1 - Bioreacteur pour la culture cellulaire sur substrat tridimensionnel - Google Patents

Bioreacteur pour la culture cellulaire sur substrat tridimensionnel

Info

Publication number
EP2670835A1
EP2670835A1 EP12703095.5A EP12703095A EP2670835A1 EP 2670835 A1 EP2670835 A1 EP 2670835A1 EP 12703095 A EP12703095 A EP 12703095A EP 2670835 A1 EP2670835 A1 EP 2670835A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
flow
culture
bioreactor
culture medium
duct
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP12703095.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Valérie DEPLANO
Yannick KNAPP
Eric Bertrand
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite dAvignon et des Pays de Vaucluse
Original Assignee
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite dAvignon et des Pays de Vaucluse
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aix Marseille Universite, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite dAvignon et des Pays de Vaucluse filed Critical Aix Marseille Universite
Publication of EP2670835A1 publication Critical patent/EP2670835A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/44—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of volume or liquid level
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/12—Pulsatile flow
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation

Definitions

  • the invention relates to the field of bioreactors for cell culture.
  • the invention relates to a bioreactor (1) for cell culture on a three-dimensional substrate, comprising:
  • a culture chamber (2) whose internal walls form a vertical duct, preferably of frustoconical shape, the diameter of which widens regularly from the entrance of the duct to the outlet of the duct,
  • the invention also relates to the advantageous use of these bioreactors in tissue engineering, for the production of tissue grafts, in particular bone or cartilaginous grafts.
  • Tissue engineering aims to apply the principles of biology and engineering to develop functional substitutes for damaged tissues. Technological developments in tissue engineering should make it possible to obtain, from patient cells, tissues cultured in vitro that can be tolerated by the body and to replace damaged or defective tissue. The regenerative perspectives offered by tissue engineering affect many types of tissues including, but not limited to, cardiac tissue, certain tissues of the eye (cornea), liver tissue, pancreatic tissue, blood vessels, and tissues. musculoskeletal: muscular, bony, cartilaginous, but also tendinous and ligamentous tissues.
  • tissue or organoid graft In order to obtain a tissue or organoid graft, it is in general necessary to seed the appropriate cells, for example progenitor cells of the targeted tissues, in porous biomaterials that allow the development of a three-dimensional structure.
  • This is called cell culture on three-dimensional substrate, or cell culture in three dimensions.
  • this culture method consists in immersing the seeded substrate of cells in a nutritive liquid and placing it in an incubator regulating temperature and gaseous mixture.
  • the main disadvantage of this technology lies in the fact that the diffusive exchanges, only present here, are generally insufficient to ensure the nutrition of the cells and in particular at the heart of the substrate.
  • the porous substrates seeded with cells are subjected to a perfusion flow of nutrient liquid.
  • the substrate needs to be held in place in the bioreactor so that the flow can be forced into it. It is therefore imperative that the substrate has a minimum of mechanical strength to withstand the contrary efforts of infusion and maintenance.
  • These substrates are mainly useful in the case of bone tissue engineering; in this case, the culture substrate has mechanical performance very close to the bone in culture.
  • the main drawback of this technology lies in the fact that some substrates do not necessarily have the mechanical performance sufficient to withstand high transmural pressures (with regard to the size of the substrates provided).
  • US Pat. No. 5,320,963 discloses a conical bioreactor for suspension cell culture.
  • the device relates to cultures of isolated cells or clusters grown without substrate, the conical portion being put in place to provide a larger deposition area for harvesting cells.
  • Porous hydrogels are materials with very high potential in three-dimensional cell culture and they are expected to replace many of the usual materials used in cell culture (coral, hydroxihapatite, titanium ...) because of their similarity with native tissues (rather “soft” materials) and their very large biocompatibility (absorbable polysaccharide).
  • these materials have mechanical characteristics insufficient to be placed in the bioreactors known from the state of the art, and in particular the perfusion bioreactors described in the literature (held between "clamps” + application of a transmural pressure).
  • the objective of the invention is to overcome the shortcomings of the devices of the prior art.
  • the bioreactors according to the invention make it possible to maintain the cells grown on a three-dimensional substrate in suspension because of the equilibrium between different hydrodynamic forces (Stokes drag, gravity and Archimedean thrust).
  • Another object of the invention is the development of a device using a reduced volume of fluids while allowing adequate flow for the realization of the first objective.
  • Another object of the invention is to develop a device generating a flow of such a nature as to keep the substrates in culture away from the walls, adapted in particular for cell culture on a porous hydrogel-type substrate.
  • Yet another object of the invention is to allow perfusion of the substrates so as to obtain optimal and homogeneous growth of the grafts in the bioreactor.
  • a further object of the invention is to provide a bioreactor for cell culture on suspension substrate requiring the minimum of human intervention during a culture time of the order of a few days to several weeks.
  • bioreactor allows the culture of tissue grafts held in suspension and perfused by the culture medium. It is particularly suitable for the culturing of bone or cartilaginous grafts on soft porous substrates, in particular on porous hydrogels.
  • the inventors have made a bioreactor comprising a suitable flow device of the culture medium in the culture chamber.
  • the invention as defined in the claims, relates first of all to a bioreactor for cell culture on a three-dimensional substrate, characterized in that it comprises
  • a culture chamber whose internal walls form a vertical duct, preferably of frustoconical shape, whose diameter widens in a regular manner from the entrance of the duct (for example the low entrance) to the outlet (for example the high output) of the duct,
  • b) means allowing the flow of the culture medium (for example from bottom to top) in said vertical duct.
  • the bioreactor further comprises pumping means allowing a pulsed flow of the culture medium.
  • the bioreactor comprises means allowing an annular flow of the culture medium in the culture chamber.
  • FIG. 1 represents a schematic overview of the different parts of a bioreactor (1).
  • Figure 2 shows a detail view of a culture chamber (2).
  • Figure 3 shows an exploded detail view of an upstream flow setting device (3).
  • FIG. 4 represents a partial sectional view of a bioreactor according to the invention comprising the culture chamber (2), the upstream flow device (3) and the downstream flow device (6).
  • Figure 5 shows a detail view of an upstream flow setting device (3) and shows the flow of fluids through the device.
  • FIG. 6 represents a partial sectional view of a bioreactor according to the invention and shows the flow of the fluids through the device.
  • Figure 7 shows the cell viability revealed by Live / Dead staining of the ADSCs within the matrix, after 5 days of dynamic culture A) on the edges of the porous matrix or B) in the center (objective x10).
  • Scale bar 200 ⁇ , as well as the relative expression of mRNA specific marker levels of bone ALP (C), OPN (D), OCN (E) and Cx43 (F).
  • bioreactor is meant a device for the growth of biological cells in a preferably sterile medium.
  • the biological cells that can be cultivated in bioreactors are prokaryotic or eukaryotic cells, and in particular microorganisms, unicellular eukaryotic or prokaryotic organisms, such as bacteria, archae, yeasts or fungi, or cells of multi-cellular organisms and mammalian cells, especially embryonic or somatic cells, or cells strains, for example mammalian mesenchymal stem cells or their derivatives.
  • three-dimensional substrate or “biomaterial” (both terms being used interchangeably), is meant an artificial or natural material, allowing the three-dimensional growth of cells, and in particular the growth of organoids from stem cells comprising the differentiation of cells. strains into different cell types within the biomaterial. These biomaterials must have a porous structure, promoting the growth of cells while allowing a good infusion of nutrient liquids within the structure. For tissue engineering, it is generally considered that an average pore size between 200 and 400 ⁇ is optimal for promoting the penetration of cells into the implant but also the formation after implantation of a vascular network.
  • Biomaterials include, but are not limited to, porous biomaterials of polymeric or ceramic nature, titanium, tantalum, or nitinol metal structures.
  • porous biomaterials of polymeric type mention may be made, for example, of polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polylactic co-glycolic acid (PLAGA), hyaluronic acid or polycaprolactone ( PCL).
  • PLA polylactic acid
  • PGA polyglycolic acid
  • PLAGA polylactic co-glycolic acid
  • PCL polycaprolactone
  • Synthetic ceramics hydroxyapatite and tricalcium phosphates
  • natural ceramics coral and mother-of-pearl
  • biomaterials known as "resorbable” have been developed and include materials of biological origin (for example, alginate, collagen, or fibrin gels).
  • a preferred mode of biomaterial usable in the bioreactors according to the invention are “hydrogels” or “porous hydrogels”. These porous hydrogels are for example based on polymers chosen from Poly-Ethylene Glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA) and poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA). These materials may also include various additives, for example different collagens, chitosan, etc., promoting specific phases in the cellular development or modifying the physicochemical properties of the material (see in particular the publication “Tissue Engineering: Fundam entais and applications” , 2006 by Yoshito Ikada in the Interface Science and Technology Ed. Academy Press Series.
  • the hydrogels used chosen from polysaccharide-based hydrogels, and in particular those based on Pullulan as described in European Cells and Materials Vol. 13. Suppl. 1, 2007 (page 50).
  • organoids or "graft” is meant a three-dimensional structure consisting of at least one biomaterial and biological cells capable of proliferating on the biomaterial, for example to form a graft capable of being transplanted into a patient.
  • the grafts or organoids grown in the bioreactor according to the invention may advantageously be of small dimensions, for example having a maximum section of between 2 and 20 mm, for example between 4 and 15 mm, or even between 2 and 10 mm.
  • a culture chamber (2) whose internal walls form a vertical duct, preferably of frustoconical shape, whose diameter widens regularly from the inlet
  • a bioreactor (1) according to the invention may comprise in particular the five elements as represented in FIG.
  • the bioreactor may include several culture chambers, or a culture chamber divided into several compartments, for example by grids or semi-sealed walls whose porosity allows
  • the duct whose geometric axis is vertical, has a preferably circular cross section, the diameter of which widens in a regular manner from the entrance of the duct to the outlet of the duct.
  • the inlet and the outlet of the duct are determined by the direction of flow of the culture medium in the culture chamber.
  • the advantageous form of the vertical duct of the culture chamber of the bioreactors according to the invention contributes to self-regulation of the lift of the biomaterials or grafts by making it possible to establish an equilibrium between the drag forces (flow of the fluid around the hydrogels), of gravity (weight of the substrate) and the resultant of the Archimedes force (buoyancy related to the difference in density between the solid and the fluid).
  • This equilibrium has been described for example in industrial applications of flow measurement (flowmeter type "rotameter") but in such applications, the single object in levitation has dimensions very close to those of the duct.
  • the conduit has a cross section whose diameter widens regularly from the low inlet duct to the top outlet of the duct.
  • the biomaterials grown are driven vertically by the high speeds present in the small section of the cone until they arrive in a zone of lower speeds (in the larger section) where the drag forces are proportionally lower (gravity becomes the dominant force again) which lowers the biomaterials grown towards the higher speed zone where ascents to the smaller area speed start again.
  • This is followed by a three-dimensional vertical alternating circulation phenomenon in the body of the culture chamber.
  • This movement promotes the renewal of the culture medium on the surface of the cultured biomaterials, and consequently, permanently ensures a concentration gradient between the inside and the surface of the most favorable support possible (maximized diffusive effects).
  • the porosity of the cultured biomaterial allows the passage of a fluid.
  • the convection of the fluid in the biomaterial is then ensured by the existence of a gradient of pressure between the lower and upper faces of the substrate. This convection is reinforced on the one hand by the alternating circulation movements described above and on the other hand by the application of a pulsed flow in the culture chamber.
  • the cultured biomaterial is then advantageously perfused (in proportion to its permeability and to the pressure gradient between the lower and upper walls of each biomaterial).
  • a device comprising a vertical duct having a cross section whose diameter widens in a regular manner from the upper entrance of the duct towards the low outlet of the duct.
  • This embodiment is more particularly suitable for the culture of porous substrates whose density is lower than that of the fluid (for example when the substrate contains air bubbles).
  • the culture chamber comprises a cylindrical body pierced with a frustoconical duct, in the form of a truncated cone.
  • the frustoconical duct is for example reversed as shown in FIG.
  • the cultivated biomaterials are in general of small dimensions relative to the culture chamber, for example of dimension less than 20 mm, for example between 4 and 15 mm, for a inlet diameter of the vertical duct (smaller section) which may for example be between 3cm and 10cm.
  • a culture chamber will be chosen comprising a frustoconical shaped conduit whose apex angle does not exceed 8 °.
  • the diameter of the inlet cross-section of the duct may for example, without being limiting, be between 3 cm and 10 cm, the height of the vertical duct between 5 cm and 30 cm and the diameter of the outlet cross-section. duct (larger section), between 3cm and 15cm.
  • the culture chamber may contain a culture volume of about 35 ml to 4 liters.
  • the most suitable material for the culture chamber especially from those known from the state of the art for the production of bioreactor culture chambers. These materials include glass, transparent polymers such as PE, PET, PVC, PS, PP, PMMA, PEI and ABS. It is preferably a sterilizable material.
  • the cylindrical body pierced with a conical conduit of the culture chamber is made of a sterilizable PolyEtherimide material.
  • the material is a transparent material. It thus makes it possible to adjust visually the conditions allowing the sustenance of the cultured biomaterials. Their position in the culture chamber is thus controlled. This is an advantageous aspect of the invention since it enables non-specialists to establish an adequate flow and to correct it throughout the evolution of the cell culture (in the case of the manufacture of bone grafts, the cells make an extracellular matrix and calcification that will increase the force of gravity).
  • the use of a transparent material for the culture chamber may also be an advantage in the case of using the bioreactor in other applications than cell culture for tissue engineering, in particular those requiring activation of photosynthesis.
  • the bioreactor according to the invention comprises:
  • a culture chamber (2) whose inner walls (21) define a vertical duct whose diameter widens in a regular manner from the entrance of the duct towards the outlet of the duct, preferably of conical shape,
  • an outlet grid (23) placed in the downstream part (for example the upper part) of larger diameter of the vertical duct preventing the grafts from circulating in the rest of the device,
  • the bioreactor according to the invention comprises an inlet gate (22) placed upstream of the body.
  • This is for example a perforated disk that promotes the establishment of a flow having an annular type of speed profile.
  • annular flow is meant a flow in which the flow is greater through elementary surfaces located at the periphery compared to the flow generated through elementary surfaces located in the center of the duct.
  • the type of flow thus generated contrary to the case of parabolic velocity profiles, makes it possible to maintain the substrates in the center of the conical part of the culture chamber. Indeed, in the case of parabolic velocity profiles, the substrates tend to migrate towards the walls because of the velocity gradient between the center and the periphery of the section of the flow.
  • the diameter and distribution of the perforations ensures the maintenance of the substrates during the establishment or start of the bioreactor but also more generally in case of stopping the pumping system.
  • the generation of an annular flow can be achieved using concentric cylindrical pipes replacing the perforated disk.
  • the inlet gate is a perforated grid having orifices, preferably with a diameter of less than 6 mm, for example from 2 to 5 mm, distributed in such a way that the flow is faster in the near regions. walls only in the center.
  • the bioreactor according to the invention may also comprise an upper gate (23) placed downstream of the cylindrical body pierced with a conical conduit. It is mainly a safety device designed to prevent the accidental passage of substrates in the rest of the hydrodynamic circuit.
  • it may consist of a perforated disk but without particular distribution of perforations.
  • the diameter of the perforations is, however, adapted to the size of the substrates placed in culture in order to prevent their possible circulation in the rest of the installation.
  • the pumping means (4)
  • the bioreactor comprises pumping means for obtaining a vertical flow, from the smallest section to the largest section of the vertical duct of the culture chamber, for example a pulsed flow from bottom to top in the vertical duct. Any type of pump conventionally used in dynamic bioreactors can be envisaged.
  • a pump will preferably be chosen to prevent heating of the culture medium for the control of the optimum culture temperature.
  • a pump is chosen to obtain a pulsed flow.
  • pulsed flow is meant a flow with a short and regular time interval, an acceleration phase followed by a deceleration phase.
  • the frequency of the pulses is between 0.05 and 10 Hz depending on the size of the bioreactor, for example of the order of 1 Hz, thus reproducing the frequencies observed in the cardiovascular flows of the adult.
  • the pulsed character of the flow makes it possible to intermittently apply large values of infusion rate.
  • the second phenomenon is related to the generation of a wake downstream of objects in relative displacement in a fluid. The pulsed flow makes it possible not to maintain the same wake over time and therefore prevents the appearance of these stasis zones.
  • a check valve at the outlet of the pump or any means to avoid backflow, especially at the start of the culture process. . Indeed, at startup, the three-dimensional substrates are placed on the lower grid 22 and are then likely to be sucked at the start of the pump for a pulsed flow.
  • It is a device allowing the generation of favorable conditions for the annular flow produced in the culture chamber. It is placed upstream of the culture chamber.
  • the device according to the present invention consists of a series of geometrical singularities (variations of sections and changes of direction of the flow) making it possible to transform a tangential flow at the inlet of the device to make it axial with an axially symmetrical speed profile. (90%) at the input gate of the culture chamber.
  • the upstream flow setting device (3) comprises:
  • the lower, inner and outer sides are formed of watertight walls with the exception of one or more orifices (34) allowing the flow of the culture medium in the first flow zone in a horizontal tangential direction,
  • the upper side (312) is perforated so that the culture medium arriving in the first flow zone, engages through the perforations in a substantially vertical direction from bottom to top to a second flow area (32) ,
  • the diameters of the first and second cylinders are very close so that the second cylinder can fit into the first cylinder leaving a space, for example of the order of a few millimeters for a cylinder diameter of the same order of magnitude as the lower inlet diameter of the culture chamber (2).
  • the outer diameter of the first flow zone (31) is greater than the inlet diameter of the vertical duct, for example 1.5 to 2 times greater;
  • the inside diameter (delimited by the first cylinder (36)) is substantially greater than the inlet diameter of the vertical duct forming the culture chamber (2);
  • the inside diameter of the second cylinder (38) is equal to the inlet diameter of the vertical duct forming the culture chamber (2).
  • FIG. 3 An example of such a device is shown in Figures 3, 4 and 6.
  • the path of the culture medium in the device is shown in Figures 5 and 6.
  • the device (3) is described above in the context of a vertical flow of the culture medium from bottom to top in the culture chamber. Of course, a similar device can be used in a top-down flow embodiment.
  • the essential element for transforming a horizontal centrifugal / tangential flow into a vertical homogeneous flow over a short distance is the coupled use of a perforated ring (allowing fluids to pass only on the inner radii where the fluid rotates at lower speed) and a baffle (formed by two concentric cylinders). These elements achieve speed variations and directional changes that allow the proper reorientation of the fluid.
  • the bottom wall 311 of the first flow zone has a helical shape so that said flow zone passes from a maximum section to the right of the fluid inlet orifice 34 (corresponding to the distance between the lower wall 311 and the upper wall 312) at a zero section in a revolution around the vertical axis of the device.
  • Other variants are of course conceivable leading to a reduction in the volume of the first flow zone in the main flow direction of the culture medium.
  • This device is placed downstream of the output grid. It participates in maintaining the symmetry of the flow.
  • this device comprises an axial output of small diameter (for example connected to a buffer tank) and does not pose a problem of pre-rotation of the flow (which would be the case in the event of a tangential exit).
  • the reservoir makes it possible to ensure the conditions of gas exchange and renewal of the nutritive liquid (culture medium).
  • the reservoir must meet the usual constraints of sterile cell culture.
  • it may include means for measuring physical quantities such as pressure, temperature or flow. It may also include catheters or other devices for sterile delivery of products into the device (culture medium, etc.).
  • One of the reservoirs may also be withdrawn from the circuit for, for example, transferring the medium into another device, for example, a device that would extract the active principles if the cultured cells are biomolecule-producing cells of interest (proteins, antibodies therapeutic, antiviral, ...) Uses of the bioreactor according to the invention and method of implementation
  • bioreactors according to the invention are particularly advantageous for the culture of cells on a three-dimensional support, in particular on porous hydrogels.
  • they can be used for:
  • tissue graft such as bone grafts, in particular vascularized bone grafts, cartilaginous grafts or any other type of tissue / cell (epithelial cells, hepatocytes, granulocytes, erythrocytes, ... without being limiting) or,
  • biopharmaceutical molecules for example for the production of antibodies or proteins.
  • tissue graft bioreactor has been described in the prior art for example in the book by Lanza, Langer and Vacanti "Principle of Tissue Engineering", published by Elsevier.
  • the bioreactor according to the invention can be used in a process for producing a tissue graft, in particular a bone or cartilaginous graft, comprising the following steps:
  • the porous biomaterial (s) are seeded with cells capable of regenerating a tissue, for example a bone or cartilaginous tissue, in order to obtain one or more organoids,
  • the one or more organoids is cultured in the bioreactor under conditions suitable for the formation of said tissue graft, for example of said bone or cartilaginous graft.
  • it will be chosen to cultivate a plurality of organoids of greater section between 2 and 20 mm, for example between 4 and 15 mm, or even between 2 and 10 mm, for example each organoid being constituted by a porous hydrogel fragment of a size of a few millimeters, for example between 2 and 20mm, for example between 4 and 15mm, or between 2 and 10mm, for their largest section.
  • a plurality of grafts are cultured in the bioreactor, preferably at least 5 grafts, for example at least 10 grafts.
  • the number and size of grafts in culture that can be adapted, in particular according to the dimensions of the bioreactor used.
  • a flow mode selected from the culture chamber will preferably be selected.
  • the flow rate of the culture medium can be advantageously controlled so that the organoid (s) cultured in the bioreactor are in suspension in the culture medium at an average vertical position, in particular which makes it possible to prevent the organoids from come in contact with the high and low parts of the duct.
  • the bioreactor allows the generation of vascularized tissues, for example vascularized bone tissue.
  • vascularized tissues for example vascularized bone tissue.
  • vascularized bone tissue can be cultivated in co-culture on a porous biomaterial, endothelial progenitor cells and osteoprogenitor cells capable of regenerating vascularized bone tissue (Unger et al 2007, Biomaterials No. 28 3965-3976).
  • a porous hydrogel for example porous hydrogels based on polysaccharides as described in European Cells and Materials Vol. 13. Suppl. 1, 2007 (page 50).
  • the culture medium will be selected according to the intended purpose.
  • Various culture media suitable for culture on a three-dimensional substrate, in particular for obtaining bone tissues, are described for example in Lanza, Langer and Vacanti "Principle of Tissue Engineering” published by Elsevier.
  • the cells grown on a three-dimensional support are biomolecule-producing cells of interest, for example proteins, in particular therapeutic antibodies.
  • the bioreactor comprises
  • FIG. 2 represents a detailed view of the culture chamber comprising the cylindrical type culture chamber (2) whose internal walls (21) form an inverted cone. At the entrance to the culture chamber is disposed a perforated grid (22) promoting the annular flow of the culture medium in the culture chamber. At the outlet, a perforated grid (23) is also placed, preventing the grafts from circulating in the rest of the device.
  • FIG. 3 represents a detail view of the device for establishing the upstream flow and comprises, in particular, a perforated ring (35) allowing the culture medium to flow in an inner radius (31), two concentric cylinders ( 36) and (38) and a perforated disk (37) and a cap ring (39), all forming the baffle promoting axial flow limiting the horizontal velocity gradient. All of these elements are located in the axis of the culture chamber upstream of the inlet gate (see Figure 4 for the arrangement of these elements in a sectional view).
  • this device makes it possible to transform the flow, over a short distance, from a horizontal centrifugal / tangential inlet to a vertical homogeneous flow.
  • the fluids engage in the inner radius of the ring in a horizontal tangential direction, in a first zone delimited by the inner walls of the perforated ring and the first concentric cylinder. It then passes into a second zone in a vertical direction through the perforations of the perforated disk and then back down between the walls of the first concentric cylinder and the second concentric cylinder to arrive in a third zone to go back to the inlet gate of the chamber of culture.
  • FIG. 6 shows the arrangement of the constituent elements
  • the bioreactor was the subject of a first test campaign during which mesenchymal stem cells derived from the bone marrow were cultured on porous hydrogels based on polysaccharides such as described in 2007 by European Cells and Materials Vol. 13. Suppl. 1, 2007 (page 50).
  • the nutrient medium (culture medium) used was EVIDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) with 10% fetal calf serum (commercially available).
  • a 5% CO 2 air mixture was maintained above the only free surface of the bioreactor circuit (buffer tank).
  • the bioreactor according to the invention was used to apply dynamic stresses to 3D hydrogel matrices seeded with adult adipose tissue derived stem cells (ADSCs) and to modulate the osteoblastic differentiation of ADSCs in 3D in the absence of osteoinductive factors.
  • the cellularized hydrogels (or substrates) were placed in the bioreactor after 48 hours of static culture. The size of the substrates is about 6mm in diameter and 2mm thick.
  • the hydrodynamic conditions of the pulsed flow generated in the culture chamber of the bioreactor ensure adequate sustenance of the 12 porous cellularized substrates placed in this room. These flow conditions result in dynamic perfusion of the porous substrates with an average flow rate of approximately 6.10 -4 4 mL / min After 5 days of dynamic culture the substrates were harvested for analysis and comparison with substrates grown only in static in the same hydrogels and in the same culture medium.

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Description

BIOREACTEUR POUR LA CULTURE CELLULAIRE SUR SUBSTRAT
TRIDIMENSIONNEL
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention se rapporte au domaine des bioréacteurs pour la culture de cellules. En particulier, l'invention concerne un bioréacteur (1) pour la culture cellulaire sur substrat tridimensionnel, comprenant :
a) une chambre de culture (2) dont les parois internes forment un conduit vertical, de préférence de forme tronconique, dont le diamètre s'élargit de façon régulière de l'entrée du conduit vers la sortie du conduit,
b) des moyens (3, 6) permettant l'écoulement du milieu de culture dans ledit conduit vertical. L'invention concerne également l'utilisation avantageuse de ces bioréacteurs dans le génie tissulaire, pour la production de greffons tissulaires, notamment de greffons osseux ou cartilagineux.
CONTEXTE DE L'INVENTION
Le génie tissulaire vise à appliquer les principes de la biologie et de l'ingénierie afin de développer des substituts fonctionnels pour les tissus lésés. Les développements technologiques dans le génie tissulaire devraient permettre d'obtenir, à partir de cellules de patients, des tissus cultivés in vitro susceptibles d'être tolérés par l'organisme et de remplacer le tissu lésé ou défaillant. Les perspectives de régénération offertes par le génie tissulaire touchent de nombreux types de tissus incluant, de manière non exhaustive, le tissu cardiaque, certains tissus de l'œil (cornée), le tissu hépatique, pancréatique, les vaisseaux sanguins ainsi que les tissus-musculo-squelettiques : tissus musculaires, osseux, cartilagineux, mais aussi tendineux et ligamentaires.
Pour l'obtention d'un greffon tissulaire ou organoïde, il est en général nécessaire d'ensemencer les cellules appropriées, par exemple des cellules progénitrices des tissus visés, dans des biomatériaux poreux permettant le développement d'une structure tridimensionnelle. On parle alors de culture cellulaire sur substrat tridimensionnel, ou culture cellulaire en trois dimensions. Pour la culture sur substrat tridimensionnel, on peut utiliser un mode de culture dit statique : ce mode de culture consiste à plonger le substrat ensemencé de cellules dans un liquide nutritif et à le placer dans un incubateur régulant température et mélange gazeux. L'inconvénient principal de cette technologie réside dans le fait que les échanges diffusifs, seuls présents ici, sont en général insuffisants pour assurer la nutrition des cellules et en particulier au cœur du substrat.
En effet, une bonne perfusion du liquide nutritif à travers les substrats tridimensionnels a été identifiée dans l'état de la technique comme étant un critère déterminant pour une croissance et un développement adéquats du greffon tissulaire en culture tridimensionnelle. Aussi, les cultures traditionnelles sur boite de pétri ou en culture statique n'étant pas adaptées aux cultures cellulaires sur substrat tridimensionnel, des processus de culture dits « dynamiques », c'est-à-dire impliquant un mouvement du milieu de culture dans le substrat, ont été développés.
Il existe différents types de bioréacteurs de culture cellulaire « dynamiques » connus dans l'état de la technique et les plus répandus sont :
- les flacons sous agitation (spinner flask, wave bioreactors). Dans un tel système, les substrats ensemencés sont "pendus" dans le liquide nutritif sous agitation. Le flacon peut avoir différentes formes afin d'améliorer les échanges de nutriments et de produits du métabolisme. Le principal inconvénient de cette technologie réside dans le fait que les substrats doivent être tenus sur un support spécifique qu'il faudra retirer avant implantation. De plus, cette méthode de culture conduit souvent à générer des écoulements turbulents dans les flacons et des niveaux de cisaillements importants à la surface des substrats, tous deux préjudiciables au bon développement des greffons.
- les bioréacteurs rotatifs (Rotating Wall Vessels). Issus de développements de bioréacteurs embarqués dans des vols spatiaux, ces bioréacteurs sont susceptibles de simuler des conditions de microgravité et permettent l'étude du développement de tissus dans l'espace. Dans ces dispositifs, les substrats ensemencés de cellules sont maintenus en équilibre dans l'entrefer de deux cylindres contrarotatifs contenant le liquide nutritif. Les mouvements de convection assurés par la rotation de ces parois permettent le renouvellement du liquide nutritif. Les principaux inconvénients de cette technologie résident dans le fait que :
a) on constate une mort prématurée des cellules du fait de chocs entre les substrats et entre les substrats et la paroi (centrifugation),
b) Elle présente des contraintes d'ingénierie (contrôle précis des mouvements de rotation nécessitant un asservissement, joints...) et d'ergonomie d'usage (montage, démontage, prélèvements, stérilisation), souvent rédhibitoires pour un usage de routine car conduisant à de trop nombreux paramètres de réglages et de fonctionnement.
- les bioréacteurs de perfusion. Dans ces systèmes, les substrats poreux ensemencés de cellules sont soumis à un flux de perfusion de liquide nutritif. Le substrat nécessite d'être maintenu en place dans le bioréacteur de sorte que l'écoulement puisse y être forcé. Il est donc impératif que le substrat ait un minimum de résistance mécanique pour supporter les efforts contraires de perfusion et de maintien. Ces substrats sont principalement utiles dans le cas de l'ingénierie tissulaire osseuse ; dans ce cas, le substrat de culture a des performances mécaniques très proches de l'os en culture. Le principal inconvénient de cette technologie réside dans le fait que certains substrats n'ont pas nécessairement les performances mécaniques suffisantes pour supporter d'importantes pressions transmurales (eu égard à la taille des substrats prévus).
En outre, le brevet américain US 5,320,963 décrit un bioréacteur conique pour la culture cellulaire en suspension. Le dispositif concerne les cultures de cellules isolées ou en amas cultivées sans substrat, la partie conique étant mise en place pour offrir une surface de dépôt plus importante permettant la récolte des cellules.
Par ailleurs, Singh et al (2007, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 97, No 5, ppl291- 1299) ont également proposé un bioréacteur conique qui permettrait, selon les auteurs, de maintenir en suspension un biomatériau, indépendamment de son poids. Toutefois ce dernier aspect n'est pas démontré puisque l'objectif du travail présenté dans cette publication est de déterminer l'écoulement autour d'un seul biomatériau maintenu par une tige et de démontrer l'existence d'un écoulement à l'intérieur dudit biomatériau tridimensionnel tissés avec différents types de tissages. Le biomatériau a plutôt une grande dimension au regard de la lumière du conduit et est maintenu artificiellement dans une position fixe dans la chambre conique. Ainsi, il convient de noter :
qu'aucune démonstration de culture cellulaire n'est faite dans cette étude, que le bioréacteur décrit ne comporte qu'un substrat dans la chambre de culture, - et que ce substrat n'est pas en suspension dans la chambre de culture.
Les hydrogels poreux sont des matériaux ayant de très grands potentiels en matière de culture cellulaire en trois dimensions et ils sont appelés à remplacer nombre de matériaux habituellement utilisés en culture cellulaire (corail, hydroxihapatite, titane...) du fait de leur similitude avec les tissus natifs (matériaux plutôt "mous") et de leur très grande biocompatibilité (polysaccharide résorbable). Toutefois, ces matériaux ont des caractéristiques mécaniques insuffisantes pour être placés dans les bioréacteurs connus de l'état de la technique, et notamment les bioréacteurs de perfusion décrits dans la littérature (tenu entre "pinces" + application d'une pression transmurale). OBJECTIFS DE L'INVENTION
L'objectif de l'invention est de pallier les carences des dispositifs de l'art antérieur. En particulier, les bioréacteurs selon l'invention permettent le maintien en suspension des cellules cultivées sur substrat tridimensionnel du fait de l'équilibre entre différentes forces hydrodynamiques (traînée de Stokes, gravité et poussée d'Archimède). En effet, il est du mérite des inventeurs d'avoir développé un bioréacteur capable de générer un écoulement particulier dans la chambre de culture ; typiquement en maîtrisant le gradient de vitesse horizontal, permettant d'obtenir le maintien en suspension des biomatériaux ou greffons en culture.
En particulier, la génération d'un écoulement homogène et symétrique nécessite en principe d'amener le fluide nutritif dans des conduits de grandes dimensions pour s'éloigner de toute singularité dans l'écoulement, aussi bien dues aux parois que les singularités géométriques telles que les coudes, les variations de section ou encore les systèmes de génération de l'écoulement. De telles dimensions ne sont alors pas réalistes dans le cas de dispositifs de culture cellulaire du fait du coût élevé des fluides nutritifs. Un autre objectif de l'invention est donc le développement d'un dispositif utilisant un volume réduit de fluides tout en permettant un écoulement adéquat pour la réalisation du premier objectif.
Par ailleurs, des essais, transcrits dans la littérature sur d'autres bioréacteurs utilisant la sustentation des substrats (bioréacteurs rotatifs), ont montré que la culture cellulaire était potentiellement dégradée par des interactions (chocs) entre les substrats et les parois du bioréacteur. Ainsi, afin de limiter de telles interactions, un autre objectif de l'invention consiste à développer un dispositif générant un écoulement de nature à maintenir les substrats en culture loin des parois, adapté notamment pour la culture cellulaire sur substrat de type hydrogel poreux.
Encore un autre objectif de l'invention consiste à permettre une perfusion des substrats de sorte à obtenir une croissance optimale et homogène des greffons dans le bioréacteur. Un objectif supplémentaire de l'invention consiste à fournir un bioréacteur pour la culture cellulaire sur substrat en suspension nécessitant le minimum d'intervention humaine pendant un temps de culture de l'ordre de quelques jours à plusieurs semaines. BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION
Il est du mérite des inventeurs d'avoir développé un bioréacteur satisfaisant à l'ensemble des objectifs identifiés ci-dessus. En particulier, un tel bioréacteur permet la culture de greffons tissulaires maintenus en suspension et perfusés par le milieu de culture. Il est particulièrement adapté pour la culture de greffons osseux ou cartilagineux sur substrats poreux mous, notamment sur hydrogels poreux.
Afin de mettre en place cette technologie, les inventeurs ont réalisé un bioréacteur comprenant un dispositif d'écoulement approprié du milieu de culture dans la chambre de culture.
Us ont également choisi une forme judicieuse de la chambre de culture, qui, combinée avec le mode d'écoulement, permet d'empêcher les matériaux en suspension (greffons) de choquer les parois de la chambre de culture.
Ainsi, l'invention, telle que définie dans les revendications, concerne en premier lieu un bioréacteur pour la culture cellulaire sur substrat tridimensionnel, caractérisé en ce qu'il comprend
a) une chambre de culture dont les parois internes forment un conduit vertical, de préférence de forme tronconique, dont le diamètre s'élargit de façon régulière de l'entrée du conduit (par exemple l'entrée basse) vers la sortie (par exemple la sortie haute) du conduit,
b) des moyens permettant l'écoulement du milieu de culture (par exemple de bas en haut) dans ledit conduit vertical.
Selon un mode de réalisation préféré, le bioréacteur comprend en outre des moyens de pompage permettant un écoulement puisé du milieu de culture.
Selon un second mode de réalisation préféré, le bioréacteur comprend des moyens permettant un écoulement annulaire du milieu de culture dans la chambre de culture. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 représente une vue schématique d'ensemble des différentes parties d'un bioréacteur (1).
La figure 2 représente une vue de détail d'une chambre de culture (2).
La figure 3 représente une vue éclatée de détail d'un dispositif d'établissement de l'écoulement amont (3).
La figure 4 représente une vue en coupe partielle d'un bioréacteur selon l'invention comprenant la chambre de culture (2), le dispositif d'écoulement amont (3) et le dispositif d'écoulement aval (6).
La figure 5 représente une vue de détail d'un dispositif d'établissement de l'écoulement amont (3) et montre le cheminement des fluides au travers du dispositif.
La figure 6 représente une vue en coupe partielle d'un bioréacteur selon l'invention et montre le cheminement des fluides au travers du dispositif.
La figure 7 montre la viabilité cellulaire révélé par coloration live / Dead des ADSCs à l'intérieur de la matrice, après 5 jours de culture dynamique A) sur les bords de la matrice poreuse ou B) au centre (objectif xlO). Barre d'échelle: 200 μπι, ainsi que l'expression relative des taux de mRNA marqueurs spécifiques de l'os ALP (C), OPN (D), l'OCN (E) et Cx43 (F).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
L'invention va maintenant être décrite en référence aux figures mentionnées ci-dessus, essentiellement dans le cas d'un bioréacteur approprié pour la culture de cellules de mammifères sur substrat tridimensionnel poreux, tels que des hydrogels poreux. Bien entendu, d'autres types de cellules et de substrats tridimensionnels sont utilisables dans le bioréacteur selon l'invention.
Par « bioréacteur », on désigne un dispositif permettant la croissance de cellules biologiques dans un milieu de préférence stérile.
Par exemple, les cellules biologiques cultivables en bioréacteurs sont des cellules procaryotes ou eucaryotes, et notamment des micro-organismes, des organismes eucaryotes ou procaryotes unicellulaires, tels que des bactéries, archae, levures ou champignons, ou des cellules d'organismes pluri cellulaires et notamment des cellules de mammifères, notamment des cellules embryonnaires ou somatiques, ou des cellules souches, par exemple des cellules souches mésenchymateuses de mammifères ou leurs dérivés.
Par « substrat tridimensionnel » ou « biomatériau » (les deux termes étant utilisés indifféremment), on entend un matériau artificiel ou naturel, permettant la croissance tridimensionnelle des cellules, et notamment la croissance d'organoïdes à partir de cellules souches comprenant la différenciation des cellules souches en différents types cellulaires au sein du biomatériau. Ces biomatériaux doivent présenter une structure poreuse, favorisant la croissance des cellules tout en permettant une bonne perfusion des liquides nutritifs au sein de la structure. Pour le génie tissulaire, on considère en général qu'une taille de pore moyenne comprise entre 200 et 400 μπι est optimale pour favoriser la pénétration des cellules dans l'implant mais aussi la formation après implantation d'un réseau vasculaire. Les biomatériaux incluent, sans être restrictif, les biomatériaux poreux de nature polymériques ou céramiques, des structures métalliques de type titane, tantale, ou nitinol. Parmi les biomatériaux poreux de type polymérique, on peut citer par exemple, l'acide polylactique (PLA), l'acide polyglycolique (PGA), l'acide polylactique co-glycolique (PLAGA), l'acide hyaluronique ou encore de polycaprolactone (PCL). Les céramiques synthétiques (hydroxyapatite et phosphates tricalciques) ou naturelles (corail et nacre) sont également utilisables en tant que biomatériau, notamment pour la culture d'organoïdes osseux.
D'autres biomatériaux dits « résorbables » ont été développés et comprennent les matériaux d'origine biologique (par exemple, alginate, collagène, ou encore gels de fibrine).
Un mode préféré de biomatériau utilisable dans les bioréacteurs selon l'invention sont les « hydrogels » ou « hydrogels poreux ». Ces hydrogels poreux sont par exemple à base de polymères choisi parmi les Poly-Ethylène Glycol (PEG), le poly(vinyl alcohol) (PVA) et le poly(2-hydroxy ethyl methacrylate) (pHEMA). Ces matériaux peuvent comprendre également différents additifs, par exemple différents collagènes, le chitosan, etc., favorisant des phases spécifiques dans le développement cellulaire ou modifiant les propriétés physico-chimiques du matériau (voir notamment la publication « Tissue Engineering : Fundam entais and applications », 2006 par Yoshito Ikada dans la collection Interface Science and Technology Ed. Académie Press. Chapitre 3 Section 4 Surface Modification of Biomaterials and Cell Interactions). Dans un mode de réalisation préféré, les hydrogels utilisés choisis parmi des hydrogels à base de polysaccharides, et notamment ceux à base de Pullulan tels que décrits dans European Cells and Materials Vol. 13. Suppl. 1, 2007 (page 50).
Par « organoïdes » ou « greffon », on entend une structure tridimensionnelle constituée d'au moins un biomatériau et des cellules biologiques capables de proliférer sur le biomatériau, par exemple pour former un greffon apte à être transplanté chez un patient. Les greffons ou organoïdes cultivés dans le bioréacteur selon l'invention peuvent avantageusement être de petites dimensions, par exemple, présentant une section maximale comprise entre 2 et 20mm, par exemple entre 4 et 15mm, voire entre 2 et 10mm.
Le bioréacteur selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend :
a) une chambre de culture (2) dont les parois internes forment un conduit vertical, de préférence de forme tronconique, dont le diamètre s'élargit de façon régulière de l'entrée
(par exemple l'entrée basse) du conduit vers la sortie (par exemple la sortie haute) du conduit,
b) des moyens (3, 4) permettant l'écoulement (par exemple de bas en haut) du milieu de culture dans ledit conduit vertical.
Typiquement, un bioréacteur (1) selon l'invention peut comprendre en particulier les cinq éléments tels que représentés à la figure 1 :
- une chambre de culture (2),
- un dispositif d'établissement de l'écoulement amont (3),
- des moyens de pompage (4),
- un réservoir de milieu de culture (5),
- un dispositif d'établissement de l'écoulement aval (6),
les différentes parties étant reliées entre elles par des conduits. Il est également possible d'envisager une métrologie en option (pression/débit/température).
Naturellement, des variantes sont possibles, le bioréacteur peut notamment comprendre plusieurs chambres de cultures, ou une chambre de culture divisée en plusieurs compartiments, par exemple par des grilles ou parois semi-étanches dont la porosité permet
- de laisser circuler le milieu nutritif,
- de retenir les greffons ou biomatériaux dans des compartiments séparés,
- et ainsi de cultiver séparément différents types cellulaires ou greffons. La chambre de culture (2)
Elle comprend un corps principal dont les parois internes forment un conduit vertical par lequel s'écoule le milieu de culture. Le conduit dont l'axe géométrique est vertical, présente une section transversale de préférence circulaire, dont le diamètre s'élargit de façon régulière de l'entrée du conduit vers la sortie du conduit.
L'entrée et la sortie du conduit sont déterminées par le sens d'écoulement du milieu de culture dans la chambre de culture.
La forme avantageuse du conduit vertical de la chambre de culture des bioréacteurs selon l'invention, participe à Γ autorégulation de la sustentation des biomatériaux ou greffons en permettant d'établir un équilibre entre les forces de traînée (écoulement du fluide autour des hydrogels), de pesanteur (poids du substrat) et la résultante de la force d'Archimède (flottabilité liée à la différence de masse volumique entre le solide et le fluide). Cet équilibre a été décrit par exemple dans des applications industrielles de débitmétrie (débitmètre type "rotamètre") mais dans de telles applications, l'unique objet en sustentation a des dimensions très proches de celles du conduit. Dans un mode de réalisation spécifique et préféré, approprié pour l'utilisation de substrats en culture dont la densité est supérieure à celle du milieu de culture, le conduit présente une section transversale dont le diamètre s'élargit de façon régulière de l'entrée basse du conduit vers la sortie haute du conduit. En conditions normales de culture dans un tel mode de réalisation, les biomatériaux cultivés (biomatériaux, greffons, etc..) sont entraînés verticalement par les vitesses élevées présentes dans la petite section du cône jusqu'à ce qu'ils arrivent dans une zone de plus faibles vitesses (dans la plus grande section) où les forces de traînées sont proportionnellement plus faibles (la gravité redevient la force prépondérante) ce qui fait chuter les biomatériaux cultivés vers la zone de plus grande vitesse où les ascensions vers la zone de plus petite vitesse recommencent. Il s'en suit ainsi un phénomène de circulation alternée verticale en trois dimensions dans le corps de la chambre de culture. Ce mouvement favorise le renouvellement du milieu de culture à la surface des biomatériaux cultivés, et par conséquent, assure en permanence un gradient de concentration entre l'intérieur et la surface du support le plus favorable possible (effets diffusifs maximisés). Par ailleurs, la porosité du biomatériau cultivé autorise le passage d'un fluide. La convection du fluide dans le biomatériau est alors assurée par l'existence d'un gradient de pression entre les faces inférieure et supérieure du substrat. Cette convection est renforcée d'une part, par les mouvements de circulation alternée décrits ci-dessus et d'autre part, par l'application d'un écoulement puisé dans la chambre de culture. Le biomatériau cultivé est alors avantageusement perfusé (proportionnellement à sa perméabilité et au gradient de pression entre les parois inférieure et supérieure de chaque biomatériau).
Alternativement, on peut également envisager un dispositif comprenant un conduit vertical présentant une section transversale dont le diamètre s'élargit de façon régulière de l'entrée haute du conduit vers la sortie basse du conduit. Ce mode de réalisation est plus particulièrement approprié pour la culture de substrats poreux dont la densité est inférieure à celle du fluide (par exemple lorsque le substrat renferme des bulles d'air).
Dans un mode de réalisation préféré, la chambre de culture comprend un corps cylindrique percé d'un conduit tronconique, en forme de tronc de cône. Le conduit tronconique est par exemple inversé tel que représenté à la figure 2.
Dans les procédés de culture mis en œuvre avec les bioréacteurs de la présente invention, les biomatériaux cultivés sont en général de petites dimensions par rapport à la chambre de culture, par exemple de dimension inférieure à 20mm, par exemple entre 4 et 15mm, pour un diamètre d'entrée du conduit vertical (plus petite section) qui peut par exemple être compris entre 3cm et 10cm.
Dans un mode de réalisation préféré, on choisira une chambre de culture comprenant un conduit de forme tronconique dont l'angle au sommet n'excède pas 8°.
Le diamètre de la section transversale d'entrée du conduit (plus petite section) peut par exemple, sans être limitatif, être compris entre 3cm et 10cm, la hauteur du conduit vertical comprise entre 5cm et 30cm et le diamètre de la section transversale de sortie du conduit (plus grande section), compris entre 3cm et 15cm. Ainsi, la chambre de culture peut contenir un volume de culture d'environ 35 ml à 4 litres.
L'homme du métier sélectionnera le matériau le plus approprié pour la chambre de culture, notamment parmi ceux connus de l'état de la technique pour la réalisation de chambres de culture de bioréacteurs. Ces matériaux incluent notamment, le verre, les polymères transparents tels que les PE, PET, PVC, PS, PP, PMMA, PEI et ABS. Il s'agit de préférence d'un matériau stérilisable. Par exemple, le corps cylindrique percé d'un conduit conique de la chambre de culture est fabriqué dans un matériau de type PolyEtherlmide, stérilisable.
Dans un mode de réalisation préféré, le matériau est un matériau transparent. Il permet ainsi de régler visuellement les conditions permettant la sustentation des biomatériaux cultivés. Leur position dans la chambre de culture est ainsi contrôlée. C'est un aspect avantageux de l'invention car il permet à des non spécialistes d'établir un écoulement adéquat et de le corriger tout au long de l'évolution de la culture cellulaire (dans le cas de la fabrication de greffons osseux, les cellules fabriquent une matrice extracellulaire et une calcification qui aura pour conséquence d'accroître la force de pesanteur). L'usage d'un matériau transparent pour la chambre de culture peut également être un avantage dans le cas de l'utilisation du bioréacteur dans d'autres applications que la culture cellulaire pour ingénierie tissulaire, en particulier celles nécessitant l'activation de processus de photosynthèse.
Dans un mode de réalisation spécifique, le bioréacteur selon l'invention comprend :
• une chambre de culture (2) dont les parois internes (21) délimitent un conduit vertical dont le diamètre s'élargit de façon régulière de l'entrée du conduit vers la sortie du conduit, de préférence de forme conique,
• une grille d'entrée (22) placée dans la partie amont (par exemple la partie inférieure) de plus petit diamètre du conduit vertical favorisant un écoulement annulaire du milieu de culture,
• le cas échéant, une grille de sortie (23) placée dans la partie aval (par exemple la partie supérieure) de plus gros diamètre du conduit vertical empêchant les greffons de circuler dans le reste du dispositif,
• un dispositif d'établissement d'un écoulement amont (3) en amont de la grille d'entrée favorisant l'écoulement annulaire dans le conduit vertical,
• des moyens de pompage (4), de préférence pour un écoulement puisé,
• le cas échéant, un réservoir de milieu de culture (5) en aval de la chambre de culture (et/ou en amont de la pompe),
• le cas échéant, un dispositif d'établissement d'un écoulement aval (6) en aval de la grille de sortie.
Dans un mode de réalisation spécifique, le bioréacteur selon l'invention comprend une grille d'entrée (22) placée en amont du corps. Il s'agit par exemple d'un disque perforé qui favorise l'établissement d'un écoulement ayant un profil de vitesse de type annulaire. Par « écoulement annulaire », on entend un écoulement dans lequel le débit est plus important au travers de surfaces élémentaires situées en périphérie comparativement au débit généré au travers de surfaces élémentaires situées au centre du conduit.
Le type d'écoulement ainsi généré, contrairement au cas des profils de vitesse parabolique, permet de maintenir les substrats au centre de la partie conique de la chambre de culture. En effet, dans le cas de profils de vitesses paraboliques, les substrats ont tendance à migrer vers les parois du fait du gradient de vitesse entre le centre et la périphérie de la section de l'écoulement. Le diamètre et la répartition des perforations assure le maintien des substrats lors de la mise en place ou du démarrage du bioréacteur mais aussi plus généralement en cas d'arrêt du système de pompage.
De manière alternative, la génération d'un écoulement annulaire peut être réalisée à l'aide de conduites cylindriques concentriques en remplacement du disque perforé. Dans un mode de réalisation préféré, la grille d'entrée est une grille perforée présentant des orifices, de préférence de diamètre inférieur à 6mm, par exemple de 2 à 5mm, répartis de telle sorte que l'écoulement soit plus rapide dans les régions proches des parois qu'au centre. Le bioréacteur selon l'invention peut comprendre également une grille supérieure (23) placée à l'aval du corps cylindrique percé d'un conduit conique. Il s'agit principalement d'un dispositif de sécurité visant à empêcher le passage accidentel des substrats dans le reste du circuit hydrodynamique. Par exemple, il peut être constitué d'un disque perforé mais sans répartition particulière des perforations. Le diamètre des perforations est toutefois adapté à la taille des substrats mis en culture afin d'empêcher leur éventuelle circulation dans le reste de l'installation.
Les moyens de pompage (4) Le bioréacteur comprend des moyens de pompage permettant d'obtenir un écoulement vertical, de la plus petite section vers la plus grande section du conduit vertical de la chambre de culture, par exemple un écoulement puisé de bas en haut dans le conduit vertical. Tout type de pompe classiquement utilisé dans des bioréacteurs dynamiques, peut être envisagé.
On choisira de préférence une pompe permettant d'éviter échauffement du milieu de culture pour le contrôle de la température de culture optimale. Dans un mode particulièrement avantageux, on choisit une pompe permettant d'obtenir un écoulement puisé. Par « écoulement puisé », on entend un écoulement présentant à intervalle de temps court et régulier, une phase d'accélération suivie d'une phase de décélération. Dans un mode préférentiel la fréquence des pulsations est comprise entre 0,05 et 10 Hz suivant la taille du bioréacteur, par exemple de l'ordre de 1Hz reproduisant ainsi les fréquences observées dans les écoulements cardiovasculaires de l'adulte.
La pulsation de l'écoulement :
- permet d'éviter la stagnation, dans une zone particulière de la chambre de culture, du biomatériau cultivé, par exemple, le greffon tissulaire, en empêchant l'établissement d'un écoulement permanent,
- renforce la perfusion du biomatériau par les effets combinés de deux phénomènes : le premier concerne l'amplitude même de l'écoulement qui ne peut être maintenu à de grandes valeurs de façon permanente ; dans un tel cas il faudrait un bioréacteur de grandes dimensions ce qui est contraire aux contraintes de faibles volumes déjà discutées plus haut. Ainsi du fait de l'inertie des greffons en sustentation dans le bioréacteur, le caractère puisé de l'écoulement permet d'appliquer de façon intermittente de grandes valeurs de débit de perfusion. Le second phénomène est lié à la génération d'un sillage à l'aval des objets en déplacement relatif dans un fluide. L'écoulement puisé permet de ne pas maintenir le même sillage au cours du temps et empêche par conséquent l'apparition de ces zones de stase.
- homogénéise la morphologie des greffons, l'écoulement puisé ayant tendance à retourner régulièrement le greffon en culture dans le bioréacteur,
- est de nature à simuler ce qui se passe dans les organismes vivants.
Dans un mode de réalisation spécifique, dans lequel on utilise un écoulement puisé, il peut être avantageux de prévoir un clapet anti -retour à la sortie de la pompe ou tout moyen permettant d'éviter des écoulements rétrogrades, notamment au démarrage du procédé de culture. En effet, au démarrage, les substrats tridimensionnels sont posés sur la grille inférieure 22 et sont alors susceptibles d'être aspirés lors de la mise en route de la pompe en vue d'un écoulement puisé. Le dispositif d'établissement de l'écoulement amont (3)
C'est un dispositif permettant la génération de conditions favorables à l'écoulement annulaire produit dans la chambre de culture. Il est placé à l'amont de la chambre de culture.
Le dispositif selon la présente invention consiste en une série de singularités géométriques (variations de sections et changements de direction de l'écoulement) permettant de transformer un écoulement tangentiel à l'entrée du dispositif pour le rendre axial avec un profil de vitesse à symétrie axiale (à 90%) au niveau de la grille d'entrée de la chambre de culture.
Dans un mode de réalisation spécifique dans lequel il est prévu un flux vertical du bas vers le haut du milieu de culture dans la chambre de culture, le dispositif d'établissement d'un écoulement en amont (3) comprend :
a) une première zone d'écoulement (31) en forme d'anneau dont l'axe est placé dans l'axe longitudinal de la chambre de culture, ledit anneau (31) présentant une section transversale sensiblement carrée ou rectangulaire et comprenant des cotés inférieur (311) et supérieur (312), et des cotés intérieur et extérieur (313),
i. les cotés inférieur, intérieur et extérieur sont formés de parois étanches à l'exception d'un ou plusieurs orifices (34) permettant l'écoulement du milieu de culture dans la première zone d'écoulement dans une direction tangentielle horizontale,
ii. le coté supérieur (312) est perforé de sorte que le milieu de culture arrivant dans la première zone d'écoulement, s'engage au travers des perforations dans une direction sensiblement verticale de bas en haut vers une seconde zone d'écoulement (32),
b) une seconde zone d'écoulement (32) en forme d'anneau à section transversale sensiblement carrée ou rectangulaire, superposée à la première zone d'écoulement (31) et comportant des cotés supérieur (323) et extérieur (324) étanches, un coté intérieur formé des parois (321, 322) de deux cylindres concentriques, un premier cylindre (36) formant un bord intérieur (321) qui ne rejoint pas le coté supérieur (323), et un deuxième cylindre (38) de diamètre inférieur au premier cylindre et formant un bord intérieur (322) qui ne rejoint pas le coté inférieur, de sorte que le milieu de culture s'engage dans l'espace délimité par les parois des deux cylindres concentriques dans une direction verticale du haut vers le bas, pour arriver dans une troisième zone d'écoulement (33), c) une troisième zone d'écoulement (33) délimitée par les parois (322) du deuxième cylindre (38), un coté inférieur étanche (331) et un coté supérieur formé par la grille d'entrée (22) dans la chambre de culture (2), favorisant un écoulement annulaire du milieu de culture dans la chambre de culture.
Les diamètres du premier et du deuxième cylindre sont très proches de sorte que le deuxième cylindre puisse s'emboiter dans le premier cylindre en laissant un espace, par exemple de l'ordre de quelques millimètres pour un diamètre des cylindres du même ordre de grandeur que le diamètre d'entrée inférieur de la chambre de culture (2).
Dans un mode de réalisation spécifique :
le diamètre extérieur de la première zone d'écoulement (31) est supérieur au diamètre d'entrée du conduit vertical, par exemple 1,5 à 2 fois supérieur ;
le diamètre intérieur (délimité par le premier cylindre (36)) est sensiblement supérieur au diamètre d'entrée du conduit vertical formant la chambre de culture (2); et
le diamètre intérieur du deuxième cylindre (38) est égal au diamètre d'entrée du conduit vertical formant la chambre de culture (2).
Un exemple d'un tel dispositif est représenté aux figures 3, 4 et 6. Dans ce mode de réalisation particulier, le cheminement du milieu de culture dans le dispositif est représenté aux figures 5 et 6.
Le dispositif (3) est décrit ci-dessus dans le cadre d'un flux vertical du milieu de culture du bas vers le haut dans la chambre de culture. Bien entendu, un dispositif similaire peut être utilisé dans un mode de réalisation à flux du haut vers le bas.
On notera que l'élément essentiel pour transformer sur une courte distance un écoulement centrifuge/tangentiel horizontal en un écoulement homogène vertical, réside dans l'utilisation couplée d'un anneau perforé (ne laissant passer les fluides que sur les rayons intérieurs où le fluide tourne à plus faible vitesse) et d'une chicane (formée par deux cylindres concentriques). Ces éléments réalisent des variations de vitesse et des changements de direction qui permettent la réorientation adéquate du fluide.
Aussi, dans un autre mode de réalisation, il n'existe pas de séparation entre la première et la seconde zone d'écoulement. Dans un autre mode de réalisation la paroi inférieure 311 de la première zone d'écoulement possède une forme hélicoïdale de sorte que ladite zone d'écoulement passe d'une section maximale au droit de l'orifice d'entrée du fluide 34 (correspondant à la distance entre la paroi 311 inférieure et la paroi supérieure 312) à une section nulle en une révolution autour de l'axe vertical du dispositif. D'autres variantes sont bien sûr envisageables conduisant à une réduction du volume de la première zone d'écoulement dans le sens principal d'écoulement du milieu de culture.
Le dispositif d'établissement de l'écoulement aval (6)
Ce dispositif est placé à l'aval de la grille de sortie. Il participe au maintien de la symétrie de l'écoulement. Dans un mode de réalisation spécifique, ce dispositif comprend une sortie axiale de faible diamètre (par exemple connecté à un réservoir tampon) et ne posant pas de problème de pré-rotation de l'écoulement (ce qui serait le cas dans l'éventualité d'une sortie tangentielle).
Le réservoir de milieu de culture (5)
Le réservoir permet d'assurer les conditions d'échanges gazeux et de renouvellement du liquide nutritif (milieu de culture). Le réservoir doit répondre aux contraintes habituelles de la culture cellulaire stérile.
Le cas échéant, il peut comprendre des moyens de mesure des grandeurs physiques telles que la pression, la température ou le débit. Il peut également comprendre des cathéters ou autres dispositifs pour amener de manière stérile des produits dans le dispositif (milieu de culture, etc.).
Il est possible par ailleurs de mettre en place plusieurs réservoirs de milieu de culture identiques (ce qui facilite alors le renouvellement de ce milieu de culture après un certain temps d'utilisation) ou différents (ce qui permet par exemple d'alterner le milieu de culture en favorisant l'un ou l'autre des phénotypes au cours de la culture). Un des réservoirs peut aussi être extrait du circuit pour, par exemple, transférer le milieu dans un autre dispositif, par exemple, un dispositif qui en extrairait les principes actifs si les cellules cultivées sont des cellules productrices de biomolécules d'intérêt (protéines, anticorps thérapeutiques, antiviraux, ...) Utilisations du bioréacteur selon l'invention et procédé de mise en œuvre
Les bioréacteurs selon l'invention sont particulièrement avantageux pour la culture de cellules sur support tridimensionnel, notamment sur hydrogels poreux. Ds sont en particulier utilisables pour :
a) la production de greffon tissulaire, tels que des greffons osseux, notamment de greffons osseux vascularisés, des greffons cartilagineux ou tout autre type de tissus/cellules (cellules epitheliales, hepatocytes, granulocytes, erythrocytes, ... sans être limitatifs) ou,
b) la production de molécules biologiques, en particulier de molécules biopharmaceutiques, par exemple pour la production d'anticorps ou de protéines.
La production de greffon tissulaire en bioréacteur a été décrite dans l'art antérieur par exemple dans l'ouvrage de Lanza, Langer et Vacanti « Principle of Tissue Engineering », aux éditions Elsevier.
Le bioréacteur selon l'invention peut être utilisé dans un procédé de production d'un greffon tissulaire, notamment d'un greffon osseux ou cartilagineux, comprenant les étapes suivantes :
a) on ensemence le ou les biomatériaux poreux avec des cellules capables de régénérer un tissu, par exemple un tissu osseux ou cartilagineux, afin d'obtenir un ou plusieurs organoïdes,
b) on place le ou les organoïdes dans le bioréacteur selon l'invention contenant un milieu de culture approprié,
c) on cultive le ou les organoïdes dans le bioréacteur dans des conditions appropriées pour la formation dudit greffon tissulaire, par exemple dudit greffon osseux ou cartilagineux.
De préférence, on choisira de cultiver un ou plusieurs organoïdes de petites dimensions dans la chambre de culture. Par exemple, on choisira de cultiver une pluralité d' organoïdes de plus grande section comprise entre 2 et 20mm, par exemple entre 4 et 15mm, voire entre 2 et 10mm, par exemple chaque organoïde étant constitué par un fragment d'hydrogel poreux d'une taille de quelques millimètres, par exemple comprise entre 2 et 20mm, par exemple entre 4 et 15mm, voire entre 2 et 10mm, pour leur plus grande section.
Dans un mode de réalisation préféré, on cultive une pluralité de greffons dans le bioréacteur, de préférence au moins 5 greffons, par exemple au moins 10 greffons. Le nombre et la dimension des greffons en culture pouvant être adaptés, notamment en fonction des dimensions du bioréacteur utilisé. Dans ce mode de culture préféré, on choisira de préférence un mode d'écoulement puisé dans la chambre de culture. On peut contrôler avantageusement la vitesse d'écoulement du milieu de culture de sorte que le ou les organoïdes en culture dans le bioréacteur, sont en sustentation dans le milieu de culture à une position verticale moyenne, en particulier qui permet d'éviter aux organoïdes de rentrer en contact avec les parties hautes et basses du conduit.
Dans un mode de réalisation particulier, le bioréacteur permet la génération de tissus vascularisés, par exemple de tissus osseux vascularisés. On peut cultiver par exemple en co-culture sur un biomatériau poreux, des cellules progénitrices endothéliales et des cellules ostéoprogénitrices capables de régénérer un tissu osseux vascularisé (Unger et al 2007, Biomaterials N°28 3965-3976). Pour les procédés de culture selon l'invention, on choisira de préférence un hydrogel poreux, par exemple des hydrogels poreux à base de polysaccharides tels que décrits dans European Cells and Materials Vol. 13. Suppl. 1, 2007 (page 50).
Le milieu de culture sera sélectionné en fonction de l'objectif visé. Différents milieux de culture appropriés pour la culture sur substrat tridimensionnel, notamment pour l'obtention de tissus osseux, sont décrits par exemple dans Lanza, Langer et Vacanti « Principle of Tissue Engineering » aux éditions Elsevier.
Dans un autre mode de réalisation, les cellules cultivées sur support tridimensionnel sont des cellules productrices de biomolécules d'intérêt, par exemple de protéines, notamment d'anticorps thérapeutiques.
EXEMPLES A- PROTOTYPE D'UN BIOREACTEUR SELON L'INVENTION
Les inventeurs ont réalisé le prototype suivant, tel que représenté aux figures 2 à 6. Le bioréacteur comprend
- une chambre de culture (représentée à la figure 2),
- un dispositif d'établissement de l'écoulement amont,
- un dispositif d'établissement de l'écoulement aval,
des moyens de pompage et un réservoir. La figure 2 représente une vue de détail de la chambre de culture comprenant la chambre de culture de type cylindrique (2) dont les parois internes (21) forment un cône inversé. A l'entrée de la chambre de culture est disposée une grille perforée (22) favorisant l'écoulement annulaire du milieu de culture dans la chambre de culture. En sortie, on place également une grille perforée (23) empêchant les greffons de circuler dans le reste du dispositif.
La figure 3 représente une vue de détail du dispositif d'établissement de l'écoulement amont et comprend, en particulier, un anneau perforé (35) laissant s'écouler le milieu de culture dans un rayon intérieur (31), deux cylindres concentriques (36) et (38) et un disque perforé (37) et un anneau chapeau (39), le tout formant la chicane favorisant un écoulement axial limitant le gradient de vitesse horizontal. L'ensemble de ces éléments est situé dans l'axe de la chambre de culture en amont de la grille d'entrée (voir figure 4 pour l'agencement de ces éléments dans une coupe en vue partielle).
Comme représenté à la figure 5, ce dispositif permet de transformer l'écoulement, sur une courte distance, depuis une entrée centrifuge/tangentielle horizontale vers un écoulement homogène vertical. Les fluides s'engagent dans le rayon intérieur de l'anneau dans une direction tangentielle horizontale, dans une première zone délimitée par les parois internes de l'anneau perforé et du premier cylindre concentrique. Il passe ensuite dans une deuxième zone dans une direction verticale au travers des perforations du disque perforé puis redescend entre les parois du premier cylindre concentrique et du deuxième cylindre concentrique pour arriver dans une troisième zone pour remonter vers la grille d'entrée de la chambre de culture.
La figure 6 représente l'agencement des éléments constitutifs
de la chambre de culture,
du dispositif d'écoulement amont,
du dispositif d'écoulement aval,
et le cheminement du fluide au travers de ces trois éléments. B - ESSAIS DU BIOREACTEUR
Le bioréacteur, tel que décrit au paragraphe précédent, a fait l'objet d'une première campagne d'essais au cours de laquelle des cellules souches mésenchymateuses issues de la moelle osseuse ont été mises en culture sur des hydrogels poreux à base de polysaccharides tels que décrits en 2007 par dans European Cells and Materials Vol. 13. Suppl. 1, 2007 (page 50). Le liquide nutritif (milieu de culture) utilisé était l'EVIDM (Iscove's Modified Dulbecco's Médium) avec 10% de sérum de veau fœtal (disponible commercialement). Un mélange d'air à 5% C02 était maintenu au-dessus de la seule surface libre du circuit du bioréacteur (réservoir tampon).
Les essais ont été menés en parallèle d'une culture statique similaire. On a utilisé les conditions de culture habituelles en matière de culture cellulaire. Les résultats après 24h et 48h de culture ont montré que les cellules ont une meilleure conformation et une meilleure répartition dans les hydrogels. Il a également été observé une absence de mort cellulaire précoce en culture dans le bioréacteur selon l'invention, notamment au cœur des biomatériaux, contrairement à ce qui est observé avec les essais en bioréacteur statique. Ces résultats démontrent une meilleure perfusion des biomatériaux appropriée pour la culture tissulaire sur substrat tridimensionnel.
C - APPLICATION DU BIOREACTEUR A LA DIFFERENCIATION OSTEOBLASTIQUE DES CELLULES SOUCHES DU TISSU ADIPEUX (ADSCs) Le bioréacteur selon l'invention a été utilisé pour appliquer des contraintes dynamiques à des matrices hydrogels 3D ensemencées de cellules souches adultes provenant du tissu adipeux (ADSCs) et moduler la différenciation ostéoblastique des ADSCs en 3D et ce en l'absence de facteurs ostéoinducteurs. Les hydrogels (ou substrats) cellularisées ont été placés dans le bioréacteur après 48h de culture en statique. La dimension des substrats est d'environ 6mm de diamètre et de 2mm d'épaisseur. Les conditions hydrodynamiques du flux puisé généré dans la chambre de culture du bioréacteur, (fréquence de 2Hz, débit puisé variant de 0 à 6.8L/min avec un débit moyen 3.5L/min) assurent une sustentation adéquate des 12 substrats poreux cellularisés placés dans cette chambre. Ces conditions d'écoulement entraînent une perfusion dynamique des substrats poreux avec un débit moyen d'environ 6.10"4 mL/min. Après 5 jours de culture dynamique les substrats ont été récoltés pour analyse et comparaison avec des substrats cultivés uniquement en statique dans de mêmes hydrogels et dans le même milieu de culture.
Les résultats de cette première étude ont montré que la différenciation des ADSCs vers la voie ostéogénique sans adjonction de facteurs ostéoinducteurs au milieu de culture est augmentée de façon très importante après seulement 5 jours de culture en conditions dynamiques au sein du bioréacteur, en absence de tous facteurs ostéogènes, à une vitesse de flux de perfusion extrêmement faible (voir figure 7 et Thèse de doctorat de Charlotte LALANDE, intitulée : « Développement d'un nouveau produit d'ingénierie tissulaire osseuse à base de polymères et de cellules souches du tissu adipeux » (23.11.2011)). Les cellules cultivées sont capables d'exprimer les marqueurs osseux spécifiques précoces (ALP, Col 1 Al) ou tardifs (OCN, OPN) et présentent une minéralisation de la matrice extracellulaire, même en absence de facteurs ostéoinducteurs. L'utilisation du bioréacteur pourrait également renforcer les interactions cellule-cellule, comme le prouve l'expression augmentée de la connexine 43 dans ces conditions dynamiques de culture.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Bioréacteur (1) pour la culture cellulaire sur substrat tridimensionnel, caractérisé en ce qu'il comprend
a) une chambre de culture (2) dont les parois internes (21) forment un conduit vertical, de préférence de forme tronconique, dont le diamètre s'élargit de façon régulière de l'entrée du conduit vers la sortie du conduit,
b) des moyens (3, 4) permettant l'écoulement du milieu de culture dans ledit conduit vertical.
2. Bioréacteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que qu'il comprend en outre des moyens de pompage (4) permettent un écoulement puisé du milieu de culture, par exemple avec une fréquence de pulsation comprise en 0,05 Hz et 10 Hz. 3. Bioréacteur selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens permettent un écoulement annulaire du milieu de culture dans la chambre de culture.
4. Bioréacteur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une chambre de culture (2) dont les parois internes (21) délimitent un conduit vertical dont le diamètre s'élargit de façon régulière de l'entrée basse du conduit vers la sortie haute du conduit, de préférence de forme conique, b) une grille d'entrée (22) placée dans la partie inférieure de plus petit diamètre du conduit vertical favorisant un écoulement annulaire du milieu de culture, c) le cas échéant, une grille de sortie (23) placée dans la partie supérieure du conduit vertical,
d) un dispositif d'établissement de l'écoulement amont (3), en amont de la grille d'entrée favorisant l'écoulement annulaire dans le conduit vertical, e) des moyens de pompage (4), de préférence pour un écoulement puisé, f) le cas échéant, un réservoir de milieu de culture (5) en amont de la chambre de culture,
g) le cas échéant, un dispositif d'établissement de l'écoulement aval (6), en aval de la grille de sortie. 5. Bioréacteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif d'établissement de l'écoulement amont (3), en amont de la chambre de culture, constitués de moyens permettant de transformer un écoulement tangentiel horizontal vers un écoulement axial vertical du milieu de culture.
6. Bioréacteur selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif d'établissement de l'écoulement amont (3), en amont de la chambre de culture comprenant :
a) une première zone d'écoulement (31) en forme d'anneau dont l'axe est placé dans l'axe longitudinal de la chambre de culture, ledit anneau (31) présentant une section transversale sensiblement carrée ou rectangulaire et comprenant des cotés inférieur (311) et supérieur (312), et des cotés intérieur et extérieur (313), i. les cotés inférieur, intérieur et extérieur sont formés de parois étanches à l'exception d'un ou plusieurs orifices (34) permettant l'écoulement du milieu de culture dans la première zone d'écoulement dans une direction tangentielle horizontale,
ii. le coté supérieur (312) est perforé de sorte que le milieu de culture arrivant dans la première zone d'écoulement s'engage au travers des perforations dans une direction sensiblement verticale de bas en haut vers une second zone d'écoulement (32),
b) une seconde zone d'écoulement (32) en forme d'anneau à section transversale sensiblement carrée ou rectangulaire, superposée à la première zone d'écoulement (31) et comportant des cotés supérieur (323) et extérieur (324) étanches, un coté intérieur formé des parois (321, 322) de deux cylindres concentriques , un premier cylindre (36) formant un bord intérieur (321) qui ne rejoint pas le coté supérieur (323), et un deuxième cylindre (38) de diamètre inférieur au premier cylindre et formant un bord intérieur (322)qui ne rejoint pas le coté inférieur, de sorte que le milieu de culture s'engage dans l'espace délimité par les parois des deux cylindres concentriques dans une direction verticale du haut vers le bas, pour arriver dans une troisième zone d'écoulement (33),
c) une troisième zone d'écoulement (33) délimitée par les parois (322) du deuxième cylindre ( 38), un coté inférieur étanche (331) et un coté supérieur formé par une grille d'entrée (22) dans la chambre de culture (2), favorisant un écoulement annulaire du milieu de culture dans la chambre de culture. 7. Bioréacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le conduit vertical de la chambre de culture est de forme tronconique et l'angle au sommet du cône du conduit vertical n'excède pas 8°.
8. Bioréacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une grille d'entrée (22) placée dans la partie de plus petit diamètre du conduit vertical favorisant un écoulement annulaire du milieu de culture, la grille présentant des orifices, de préférence de diamètre inférieur à 6mm, par exemple de 2 à 5mm, répartis de telle sorte que l'écoulement soit plus rapide dans les régions proches des parois qu'au centre.
9. Utilisation du bioréacteur tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la culture de cellules sur support tridimensionnel, notamment sur hydrogel poreux.
10. Utilisation selon la revendication 9, pour
a) la production de greffon tissulaire, tels que des greffons osseux, notamment de greffons osseux vascularisés ou de greffons cartilagineux ou,
b) la production de molécules biologiques, en particulier de molécules biopharmaceutiques, par exemple pour la production d'anticorps ou de protéines.
11. Procédé de production d'un greffon tissulaire, notamment d'un greffon osseux ou cartilagineux, comprenant les étapes suivantes :
a) on ensemence un ou plusieurs biomatériaux poreux avec des cellules capables de régénérer un tissu, par exemple un tissu osseux ou cartilagineux, afin d'obtenir un organoïde,
b) on place le ou les organoïdes dans un bioréacteur selon l'une des revendications 1 à 8 contenant un milieu de culture approprié,
c) on cultive le ou les organoïdes dans le bioréacteur dans des conditions appropriées pour la formation dudit greffon tissulaire, par exemple dudit greffon osseux ou cartilagineux.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le milieu de culture présente un écoulement annulaire puisé dans la chambre de culture.
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que l'on contrôle la vitesse d'écoulement du milieu de culture dans la chambre de culture de sorte que le ou les organoïdes en culture dans le bioréacteur sont en sustentation dans le milieu de culture sans entrer en contact avec l'entrée ou la sortie de la chambre de culture.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que l'on co-cultive sur un biomatériau poreux des cellules progénitrices endothéliales et des cellules ostéoprogénitrices capables de régénérer un tissu osseux vascularisé. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que le biomatériau est un hydrogel poreux et notamment un hydrogel poreux à base de polysaccharides.
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