ES2632930T3 - Biorreactor rotatorio de cámara doble: métodos y usos del mismo - Google Patents

Abstract

Un biorreactor que comprende una placa de agitación magnética multiposición sobre la que se colocan al menos dos cámaras dobles, una placa superior que se encaja a la tapa superior de cada cámara doble y al menos dos bombas de flujo independientes.

Description

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DESCRIPCION

Biorreactor rotatorio de camara doble: metodos y usos del mismo Description del campo tecnico

La presente divulgation describe un biorreactor rotatorio de camara doble que se utiliza en aplicaciones de ingenierla de tejidos (IT) y de medicina regenerativa. El aparato esta automatizado y puede controlarse a diferentes caudales, induciendo diferentes esfuerzos de cizalla, as! como diferentes velocidades rotatorias a 180°, permitiendo la difusion ajustable del medio de cultivo en los armazones, la perfusion del flujo, as! como un estlmulo diferente inducido por el movimiento rotatorio. Este nuevo sistema de biorreactor posibilita un cultivo celular controlado y homogeneo en armazones bicapa o multicapa, permitiendo el potencial desarrollo conjunto in vitro de tejidos compuestos/en capas.

Antecedentes

Un biorreactor puede referirse a un dispositivo o sistema destinado a sembrar celulas en armazones y a cultivar celulas o tejidos en condiciones bioqulmicas y/o mecanicas especlficas, en el contexto del cultivo celular. Por lo tanto, con estos biorreactores se facilita el desarrollo de tejido. En este contexto, los biorreactores son dispositivos obtenidos por ingenierla para suministrar el adecuado transporte espacial y temporal de nutrientes que tambien puede incorporar la estimulacion mecanica o de otra forma flsica en un entorno bien definido y controlado. Los biorreactores que proporcionan entornos bien definidos y controlables son utiles para estudios fundamentales y para optimizar el cultivo de tejido y estos pueden actuar como unidades de production para la fabrication de tejido y bioprocesos a gran escala. Los sistemas de biorreactor pueden proporcionar sistemas de modelo fiables para estudios fundamentales de biologla celular y tienen un papel clave en la mejora de la calidad de los tejidos obtenidos por ingenierla. En la bibliografla se ha hablado de diferentes biorreactores, incluyendo frascos mixtos [Vunjak- Novakovic et al., 1996], recipientes de rotation [Freed et al., 1998; Freed et al., 2000], cartuchos perfundidos [Carrier et al., 2002] y biorreactores con diferente estimulacion mecanica [Altman et al., 2001; Altman et al., 2002].

Los biorreactores de camara doble y los biorreactores oscilantes tambien se han descrito para su aplicacion en la IT osteocondral [Wendt et al., 2003; Chang et al., 2004; Valonen et al., 2010]. La principal limitation de los biorreactores actuales para la IT OC (ingenierla de tejidos osteocondrales) es que el/los nuevo(s) tejido(s) formado(s) no se distribuyen homogeneamente en el interior de los armazones bicapa [Chen et al., 2013]. As! mismo, no existen biorreactores adaptados para los armazones bicapa que soporten diferentes medios de cultivo para cada capa de las construcciones bicapa, permitiendo al mismo tiempo, la induction del estlmulo rotatorio, la compresion y el movimiento vertical para evitar la sedimentation celular y la indeseada malformation de tejidos OC.

Se han concedido varias patentes en funcion del uso de los biorreactores para diferentes aplicaciones. Los siguientes ejemplos deberlan tenerse en cuenta por su relevancia en el area de la presente invention:

La patente US2006141623 (A1) del 23 de junio de 2006 describe de manera general sistemas, modulos, un biorreactor y los metodos para el cultivo, proliferation, diferenciacion, produccion y mantenimiento automatizados de los productos de tejido obtenidos por ingenierla. Sin embargo, esta descripcion del sistema no se refiere a una camara doble (una camara con dos compartimentos), ni a los movimientos de rotacion independientes de cada camara, ni al movimiento de giro de todo el sistema.

El documento WO 2007/012071 del 25 de enero de 2007 se refiere a un dispositivo de biorreactor y a un metodo y sistema para fabricar tejidos y cultivar celulas y tejidos en el dispositivo del biorreactor. El dispositivo de biorreactor incluye una camara de biorreactor para contener una muestra, donde el cultivo de la muestra en respuesta a la estimulacion mecanica, electrica y del biofactor se monitoriza a traves de uno o mas puertos opticos. Se proporcionan sensores integrados para medir la presion del fluido, el pH, la temperatura y la tension del oxlgeno. El dispositivo del biorreactor puede recibir diferentes tipos de cargas mecanicas, incluyendo el cizallamiento de fluido, la presion hidrostatica, la compresion de la matriz y la rotacion. El sistema no presenta una camara doble para estructuras bicapa.

La patente WO 2008/098165 del 14 de agosto de 2008 se refiere a un biorreactor de cultivo celular oscilante. El biorreactor tiene una camara permeable al gas y de lazo cerrado para el cultivo celular o de tejido y un medio oscilante para mover la camara permeable al gas y de lazo cerrado bidireccionalmente a lo largo de un eje horizontal con respecto a un eje normal de la camara de lazo cerrado, y as! forzar la convection de las celulas y del fluido en la camara permeable al gas y de lazo cerrado. El biorreactor incluye opcionalmente un armazon de ingenierla de tejidos, un medio de entrada, un medio de salida y sensores integrados. Otro aspecto proporciona un biorreactor que tiene una pluralidad de camaras permeables al gas y de lazo cerrado para el cultivo de celulas o tejidos.

La patente EP 1990402 del 12 de noviembre de 2008 describe un biorreactor para aplicar fuerzas mecanicas como

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estlmuio anabolico. La invention describe un biorreactor disenado para utilizarse en el campo de la citomecanica. El sistema comprende un accionador de pollmero electroactivo, tambien conocido como musculo artificial, que se une a un sustrato/matriz biocompatible, impermeable al agua y deformable. Esta estructura en capas es la membrana flexible del biorreactor.

La patente US 7604987 del 20 de octubre de 2009 se refiere a un biorreactor que presenta una camara para contener cultivos de celulas o tejido en el interior de un medio de cultivo. El biorreactor tambien comprende un detector capaz de detectar un cambio en uno o mas metabolitos asociados al cultivo de cultivos de celulas o tejido en el interior de la camara y un regulador de camara capaz de rotar la camara a una primera velocidad sobre un primer eje y a una segunda velocidad sobre un segundo eje, estando dispuesto el segundo eje en un angulo con respecto al primer eje. En uso, la magnitud de la primera velocidad y de la segunda velocidad son independientemente variables entre si. Sin embargo, este biorreactor solo esta compuesto por una camara para todas las muestras de estructura, impidiendo el cultivo conjunto de celulas con dos medios diferentes, por separado en cada estructura y sin tener cada estructura un deposito de camara independiente.

La patente WO 2010/040699 del 15 de abril de 2010 se refiere a un sistema de biorreactor multicultivo que puede mantener las celulas madre y diferentes tipos de celulas en entornos flsicamente aislados, pero que puede permitir la comunicacion bioqulmica entre estas celulas. A pesar de que el sistema permite el cultivo conjunto y la interaction bioqulmica entre varias camaras, estas diferentes camaras estan flsicamente aisladas, y en consecuencia, no permiten la obtencion de armazones de cultivo bicapa o multicapa integrados en entornos optimizados individuales.

La patente WO 2010/064943 del 11 de junio de 2010 describe un biorreactor de perfusion continua bidireccional para el cultivo tridimensional de sustitutos de tejido de mamlfero. El biorreactor induce estlmulos celulares mecanicos creando fuerzas de cizalla producidas por la perfusion del flujo utilizando diferentes gradientes de presion, controlados por dos bombas, una de vaclo y otra peristaltica, situadas en el interior de un sistema de flujo circular disenado para el biorreactor, y tambien mediante motores rotatorios situados en ubicaciones especlficas. Este biorreactor es capaz de cultivar tejidos de grandes dimensiones a traves del control de la perfusion y del gradiente de flujo en el interior de los armazones, obteniendo de este modo la posibilidad de que los nutrientes accedan al interior y de retirar los productos metabolicos del interior del material.

La patente EP 2236597 A1 del 6 de octubre de 2010 presenta un biorreactor sensorizado de alto rendimiento para aplicar estlmulos de presion hidrodinamica y de esfuerzo de cizalla sobre los cultivos celulares. Esta presion hidrodinamica se genera dentro de al menos una camara de cultivo, mediante la variation de la distancia media, con una velocidad controlada, de una superficie con respecto a la superficie sobre la que se situa el cultivo y por la que el medio de cultivo puede fluir libremente.

La patente CN 101899393 (A) del 1 de diciembre de 2010 pertenece al campo de la ingenierla de tejidos oseos y a la mecanica celular, y se refiere a una carga dinamica y a un biorreactor de perfusion recirculante y de carga dinamica, que comprende un cuerpo principal, un modulo de manguito deslizante y un modulo de cabina de cultivo tridimensional. La invencion comprende una ceramica piezoelectrica que penetra en la cabina de cultivo tridimensional a traves de un orificio. El extremo movil de la ceramica piezoelectrica esta conectado a una varilla de carga y el cuerpo principal de la cabina de cultivo tambien esta provisto de una entrada de llquido y una salida de llquido que estan conectadas externamente a una bomba peristaltica. El biorreactor ni realiza movimientos rotatorios ni esta adaptado para una camara doble.

La patente EP 2151491 A3 del 23 de noviembre de 2011 divulga un biorreactor multicamara. Sin embargo, este sistema no tiene movimiento rotatorio, lo que es una limitation en cuanto a la homogeneizacion del cultivo, ya que puede producirse sedimentation celular debido a la gravedad.

La patente CN102796664 del 28 de noviembre de 2011 se refiere a un biorreactor de ingenierla de tejidos y ligamentos del cuerpo humano que puede llevar a cabo la tension/compresion y la carga de esfuerzo multidimensional de torsion bidireccional. As! mismo, puede detectar automaticamente la condition de aflojamiento de la abrazadera y realizar la compensation en llnea del aflojamiento de la abrazadera; y ademas, presenta las caracterlsticas de una estructura simple y compacta y una gran comodidad de uso. Este biorreactor no realiza la inversion de la camara de cultivo y no se aplica a estructuras bicapa.

La patente US2012035742 (A1) del 9 de febrero de 2012 describe metodos, dispositivos y sistemas para la ingenierla de tejidos oseos utilizando un biorreactor para cultivar injertos oseos humanos. Este biorreactor esta compuesto de una unica camara sin movimientos de rotation.

La patente WO 2013103306 A1 del 11 de julio de 2013 se refiere a un biorreactor compuesto de una camara hermetica al agua y de una matriz interna para generar implantes medicos celularizados. Las matrices internas y la camara externa del biorreactor estan fabricadas simultaneamente, preferentemente mediante un rapido proceso de definition de prototipos. El sistema tambien se caracteriza por disponer de una camara externa que tiene una forma

que se adapta a la forma del implante a celularizar (matriz interna), posibilitando una mayor eficacia en la colonizacion celular y en el cultivo del implante. El biorreactor no esta adaptado,ni para llevar a cabo el estlmulo mecanico, ni para la monitorizacion en tiempo real.

La patente CN203269948 del 6 de noviembre de 2013 describe un dispositivo para la construccion de un cultivo 5 conjunto in vivo de tendones y vainas de tendones. El dispositivo comprende un biorreactor de cultivo conjunto de tendones y vainas de tendones de ingenierla de tejidos, una unidad de control y una unidad de medida, donde el biorreactor de cultivo conjunto de tendones y vainas de tendones de ingenierla de tejidos comprende unidades de cultivo de tendones y vainas de tendones de ingenierla de tejidos y un mecanismo de deslizamiento neumatico de tendones. El sistema comprende tambien sensores de monitorizacion de la presion y el flujo. El sistema no presenta 10 diferentes velocidades de rotacion para las distintas camaras.

El documento US2014030762 (A1) del 30 de enero de 2014 se refiere a un biorreactor para el cultivo celular sobre una estructura tridimensional, que comprende una camara de cultivo, cuyas paredes internas forman un conducto vertical, con un diametro que se ensancha regularmente desde la entrada del conducto hasta la salida del conducto, hecho que posibilita que el medio de cultivo fluya en dicho conducto vertical. La invencion tambien se refiere al uso 15 ventajoso de estos biorreactores en el campo de la ingenierla de tejidos para la produccion de injertos de tejido, en particular, de injertos oseos o de cartllago. Esta patente no describe ni camaras dobles, ni movimientos rotatorios, ni cultivos de estructuras bicapa.

Sumario

La presente divulgacion proporciona un biorreactor rotatorio de camara doble adaptado para el cultivo conjunto de 20 celulas en armazones bicapa o multicapa. Por primera vez se permite el cultivo en camara doble, lo que desarrolla tejidos homogeneos bicapa o multicapa mediante la aplicacion del movimiento rotatorio en un eje horizontal y vertical. El movimiento horizontal con dos o mas velocidades distintas programables, que oscilan desde cero hasta 0,12 seg/grados sin carga, puede aplicarse de manera independiente en cada camara doble, lo que puede utilizarse como una estimulacion mecanica sobre las celulas cultivadas en un armazon colocado en esa camara, a la vez que 25 se aplica movimiento vertical con un retardo temporal programable en todas las camaras dobles a la vez, para evitar la sedimentation celular debido a la gravedad. Este biorreactor, que tambien puede inducir diferentes flujos de cizalla de dos medios de cultivo diferentes que circulan por cada camara de manera independiente, acoplando dos o mas bombas de flujo diferentes al biorreactor, es util para el desarrollo simultaneo de diferentes tejidos maduros in vitro, es decir, tejidos osteocondrales. As! mismo, puede acoplarse una placa superior que encaja con las tapas 30 superiores de cada camara doble, proporcionando la compresion y la torsion mecanicas automaticas de acuerdo con el movimiento rotatorio realizado por cada camara. El movimiento rotatorio programado tambien ajustara directamente la velocidad de compresion.

Asl, la presente divulgacion describe un biorreactor que comprende una placa de agitation magnetica multiposicion sobre la que se colocan al menos dos camaras dobles, una placa superior que encaja con la tapa superior de cada 35 camara doble y al menos dos bombas de flujo independientes.

En una realization preferente de la presente invencion, las camaras dobles se fijan a la placa de agitacion por atraccion magnetica y la mencionada placa de agitacion presenta un movimiento rotatorio, que es un movimiento rotatorio horizontal y/o vertical.

En otra realizacion de la presente invencion, el movimiento rotatorio horizontal se aplica de manera independiente en 40 cada camara doble, oscilando de 0° a 180°.

En una realizacion preferente de la presente invencion, el movimiento rotatorio comprende dos o mas escalas de velocidad programables que oscilan de cero a 0,12 seg/grados.

En otra realizacion de la presente invencion, el movimiento rotatorio vertical se aplica a todas las camaras a la vez, oscilando de 0° a 180°.

45 En una realizacion preferente de la presente invencion, la camara doble comprende una barrera central con un orificio en el que se insertan los armazones multicapa, las entradas y salidas independientes del medio de cultivo; un iman en la parte inferior de la camara; tapas superiores comprimibles y/o desmontables; y microsensores para registrar parametros bioqulmicos y flsicos.

En otra realizacion de la presente invencion, la camara doble es una camara de cultivo doble cuya dimension esta 50 adaptada a la dimension de la placa de cultivo, preferentemente de 38,4 mm de diametro y de 17,5 mm de alto.

Tambien es un objetivo de la presente invencion describir el uso del biorreactor anteriormente descrito en el contexto de la medicina o la medicina regenerativa, en particular, en los campos de la biotecnologla, la industria farmaceutica,

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la biologla o la ingenierla de tejidos.

Otro objeto de la invencion es describir el uso del biorreactor anteriormente descrito para el desarrollo de modelos de tejido in vitro y para la ingenierla de tejidos de diferentes organos, la identificacion de farmacos y/o para imitar el movimiento articular de las articulaciones y otros estlmulos mecanicos del cuerpo.

Description general

La tecnologla representa un biorreactor mas realista que imita los diferentes estlmulos flsicos. El sistema esta adaptado para armazones multicapa cultivados con dos medios de cultivo diferentes. As! mismo, el biorreactor supera las desventajas del cultivo estatico, pues es posible girarlo a 180°, evitando la sedimentation celular y estando tal movimiento impulsado por un servomotor.

Con respecto a la dinamica del biorreactor, este sistema se proyecta hacia las camaras dobles, realizando la compresion y torsion de la tapa superior sobre los armazones, y en consecuencia, sobre las celulas, anadiendo la placa superior al sistema. Estas camaras tienen dos compartimentos para los armazones bicapa o multicapa. Cada position de la camara puede realizar una agitation horizontal de 180° para imitar, por ejemplo, el movimiento articular de las articulaciones y mejorar la difusion del medio de cultivo. Ademas, las camaras dobles de cultivo presentan dos entradas y salidas de un medio de cultivo independientes, que permiten la induction de flujos de cizalla independientes y diferentes. Todas las piezas que componen las camaras dobles pueden esterilizarse en autoclave. La placa de agitacion esta controlada por un teclado vinculado a una placa Arduino (Atmel®) y a una pantalla LCD. La placa Arduino tambien esta vinculada a un modulo de servocontrol. La placa de agitacion tambien puede incorporar un sistema WiFi para controlar la agitacion a distancia, utilizando un soporte logico informatico.

El biorreactor presenta la posibilidad de disponer de un numero determinado de muestras en un numero igual de posiciones de cultivo o camaras independientes. Estas camaras de dos compartimentos permiten el flujo de dos medios de cultivo diferentes y su rotation independiente con dos o mas velocidades programables distintas. As! mismo, todo el sistema tiene un movimiento de giro de 180° impulsado por el servomotor para evitar la sedimentacion celular.

En cuanto a la recopilacion de datos y las caracterlsticas intuitivas, el tamano de la camara doble esta adaptado para cumplir con los requisitos del usuario en cuanto a los tamanos de las placas de cultivo existentes que se colocan por atraccion magnetica, caracterlstica que facilita la retirada y sustitucion de las camaras dobles, as! como el analisis de las camaras individuales sin afectar a las camaras restantes en cultivo.

La tecnologla descrita puede utilizarse para desarrollar diferentes plataformas de modelos de tejido in vitro, lo que permite la sustitucion o disminucion del uso de modelos animales para la investigation cientlfica, y en el campo farmaceutico, para la identificacion y evaluation de farmacos, haciendo que disminuya el tiempo de los procedimientos, as! como el uso innecesario de animales y los costes que esto implica (descubrimiento y analisis de farmacos y desarrollo de productos de tejido obtenidos por ingenierla).

Hoy en dla, en los campos de la biotecnologla, biologla e ingenierla de tejidos, la difusion del medio de cultivo en armazones porosos en 3D es un desaflo que ha de superarse para desarrollar tejido en 3D que pueda ser utilizado en los centros cllnicos. Aplicando la tecnologla de biorreactor, como el biorreactor rotatorio de camara doble, este problema se solucionarla. As! mismo, la tecnologla de la invencion podrla imitar, por ejemplo, el movimiento articular de las articulaciones, lo que contribuirla a disponer de una plataforma para desarrollar la investigacion de las articulaciones articulares, abriendo nuevos caminos para estudiar trastornos como la osteoartritis o la osteoporosis.

Innovaciones, ventajas y algunas aplicaciones:

• Multiples posiciones independientes que pueden ser estimuladas por el movimiento rotatorio con hasta 10 escalas de velocidad programables.

Esta caracterlstica puede ser util con dos objetivos diferentes: primero, la mejora de la difusion del medio de cultivo en los armazones de cultivo en 3D; y segundo, puede estimular, por ejemplo, el movimiento articular realizado por nuestras articulaciones, ya que la rotacion es de 180° horizontalmente.

• Todo el sistema puede girar automaticamente a 180° hacia arriba y hacia abajo, con un retardo temporal especlfico.

o La sedimentacion celular puede producirse en el cultivo celular en 3D. Con este movimiento de giro, esto se evitarla. As! mismo, en un estudio especlfico, si el movimiento de giro no es deseable, la presente caracterlstica puede inhabilitarse.

• Camaras dobles adaptadas para estructuras bicapa en 3D que pueden soportar el cultivo de dos linajes celulares diferentes (o destino de celulas madre)

o Hoy en dla, en los campos de la ingenierla de tejidos y en la medicina regenerativa, esta aumentando la

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complejidad de las estructuras desarrolladas a implantar. Existe ademas la necesidad de imitar los tejidos nativos, tales como el movimiento articular de las articulaciones, para el desarrollo apropiado de modelos de tejido in vitro utilizados en la identification de farmacos. Asl, el objetivo es desarrollar estructuras mas complejas que puedan incluir dos tipos de tejido diferentes (por ejemplo, en el tejido osteocondral, incluir cartllago y hueso). Para obtenerlo, han de utilizarse y cultivarse conjuntamente llneas celulares o cultivos primarios diferentes (por ejemplo, celulas madre adultas de origen diferente).

• Cada una de las camaras dobles puede presentar diferentes condiciones y puede revisarse sin interferir en las otras camaras en cultivo

o El cultivo conjunto de celulas podrla mejorarse estudiando el secretoma de ambas llneas celulares a lo largo del tiempo (bajo el efecto de un farmaco especlfico).

• Permite el flujo de dos medios de cultivo diferentes en las dos partes de cada camara doble.

o Las superficies de nuestro cuerpo podrlan analizarse en un sistema dinamico, como por ejemplo, la barrera hematoencefalica.

o Podrlan aplicarse dos farmacos diferentes que fluyeran en la misma camara doble o se podrla analizar la difusion entre uno y otro compartimento de cada camara doble a traves de una lamina celular. o Utilizando el biorreactor rotatorio de camara doble, definitivamente es posible la optimization de dos medios de cultivo diferentes utilizados en cultivos conjuntos de dos tejidos o llneas celulares diferentes que se cultivan simultaneamente. Los biorreactores existentes permiten cultivos en 3D, pero solo utilizando un medio de cultivo especlfico.

• El biorreactor se adaptara para realizar los movimientos de compresion clclicos

o En nuestro cuerpo, existen una gran variedad de estlmulos flsicos que afectan a nuestra salud. Por ejemplo, la osteoartritis se genera debido a mediadores qulmicos, pero tambien debido a cargas flsicas. Aplicando este tipo de presion, pueden crearse modelos para este tipo de enfermedades, permitiendo el desarrollo de una plataforma mas realista para estudiar los efectos de los farmacos, evitando los problemas eticos y tecnicos asociados con los modelos animales.

Estos son solo algunos ejemplos de algunas de las aplicaciones interesantes que son posibles con el presente biorreactor. En resumen, se presenta un nuevo concepto de biorreactor con una gran variedad de variables que pueden habilitarse y inhabilitarse independientemente, aunque todas ellas pueden contribuir a disponer de un entorno mas realista, controlado, rapido y accesible. El mayor numero de caracterlsticas del presente biorreactor hace que sea una valiosa herramienta, tanto para estudios cientlficos fundamentales como para los campos farmaceutico y medico/quirurgico aplicados.

Breve description de los dibujos

Sin intention de limitar la divulgation del presente documento, esta solicitud presenta dibujos adjuntos de realizaciones ilustradas para que sea mas facil comprenderla.

Figura 1. Vista en perspectiva de la camara doble (con una vista abierta al interior), donde a) hay una tapa superior para cada camara doble, b) se representa la parte central de la camara doble donde estan comprendidos los dos compartimentos con el orificio central para la insertion de la estructura, y c) se representa la parte inferior adaptada para la insercion de una barra magnetica que fije la camara doble a la placa de agitation gracias a la atraccion magnetica.

Figura 2. Section transversal de la camara doble. Figura 3. Vista lateral del retenedor del biorreactor, constituido por d) el tornillo del soporte para fijar la placa de agitacion y e) el empalme de la placa de agitacion. Figura 4. Vista en perspectiva del retenedor del biorreactor.

Figura 5. Vista en perspectiva (desde la parte inferior) de la placa superior que se utiliza para permitir la compresion mecanica. La placa comprende las siguientes caracterlsticas: f) adaptadores que entran en las tapas superiores de las camaras dobles y g) soportes que se acoplan elasticamente a la plataforma dinamica.

Figura 6. La plataforma dinamica del biorreactor que realiza los movimientos rotatorios (horizontales y verticales). Esta plataforma esta acoplada a y suspendida por el retenedor.

Figura 7. Estructuras bicapa de goma gellan-goma gellan/hidroxiapatita; a la derecha: hidratadas y tenidas con carmln alizarina. En la estructura tenida con carmln alizarina, la parte inferior se tino de rojo (opaco en la imagen) debido a la presencia de partlculas de hidroxiapatita. La parte superior y mas clara se refiere a la parte transparente de goma gellan.

Figura 8. Perfil de estructuras bicapa para el % de distribution y porosidad de la hidroxiapatita. La parte izquierda de cada estructura se refiere a la parte de goma gellan, y la parte derecha, a la goma gellan con partlculas de hidroxiapatita. Figura 9. Celulas madre procedentes de tejido adiposo de conejo de bolsas de grasa cultivadas sobre

estructuras bicapa con gelatina en la composicion. DAPI/faloidina y tincion viva/muerta de las celulas en los puntos temporales de 24 h y 21 dlas de cultivo. A la izquierda, es posible observar las celulas tenidas con faloidina (partes blancas de la imagen). A la derecha, es posible observar las celulas sanas vivas (color blanco).

Description de las realizaciones preferentes

5 La presente invention se refiere a un biorreactor rotatorio de camara doble que esta compuesto de un conjunto de camaras de cultivo dobles, una placa de agitation magnetica multiposicion y bomba(s) de flujo.

Las camaras de cultivo dobles presentan dos entradas y salidas de medio de cultivo independientes que permiten la induction de flujos de cizalla independientes y diferentes, y un separador central con un orificio para la insertion del armazon, de modo que las dos camaras se intengren. Las camaras dobles tienen una barra magnetica acoplada en 10 la parte inferior.

La placa de agitacion magnetica multiposicion tiene 12 posiciones adaptadas para dos placas de cultivo de tejido de 6 pocillos, que controlan el movimiento horizontal independiente de cada position y el movimiento vertical de toda la placa.

Biorreactor rotatorio de camara doble:

15 El biorreactor de camara doble esta compuesto de una placa de agitacion que puede rotar verticalmente hasta 180°. Ademas, la placa de agitacion tiene 12 posiciones donde pueden colocarse, por atraccion magnetica, 12 camaras dobles. Cada una de las 12 posiciones puede controlarse de manera independiente para que roten hasta 180° a 10 velocidades distintas, que oscilan de 0 a 0,12 seg/grados sin carga.

Camaras dobles de cultivo:

20 El biorreactor puede incorporar 12 camaras de cultivo dobles. Las camaras de cultivo dobles tienen una barrera central con un orificio para insertar el armazon bicapa. Este tipo de pocillo sirve para cultivar celulas con diferentes condiciones en cada camara. El diseno de las camaras de cultivo dobles permite evitar que se mezclen los medios de cultivo. En la parte inferior de la camara de cultivo doble hay acoplada una barra magnetica que se atrae con la posicion de rotation de la placa de agitacion. Cada camara tiene tapas desprendibles para las partes superior e 25 inferior de las camaras. La tapa superior presenta la posibilidad de comprimir el armazon, lo que permite analizar un estlmulo de compresion. Las camaras dobles tienen dimensiones para adaptarse a las placas comerciales de cultivo de tejido de 6 pocillos (38,4 mm de diametro, 17,5 mm de altura). De esta manera, y siendo desprendible la parte superior e inferior de las camaras, el cultivo puede observarse por microscopia. Pueden anadirse microsensores al sistema para monitorizar varios parametros bioqulmicos, tales como la tension del oxlgeno, el pH, la temperatura o 30 la concentration de glucosa y urea, y parametros flsicos como la presion. Todas las piezas que componen las camaras dobles pueden esterilizarse en autoclave.

Placa de agitacion:

La placa de agitacion de 12 posiciones multiples esta adaptada dimensionalmente a dos placas estandar de cultivo de tejido de 6 pocillos. En cada una de las 12 posiciones se puede insertar una de las camaras de cultivo dobles por 35 atraccion magnetica. En cada posicion, pueden rotar hasta 180° (horizontal), estando controladas las rotaciones por minuto de manera independiente. La rotacion esta impulsada por la agitacion magnetica, ejerciendo los imanes la atraccion entre la parte inferior del pocillo y la posicion de agitacion de la placa.

El movimiento vertical a 180° tambien puede aplicarse a todas las camaras de manera conjunta.

La placa de agitacion esta controlada por un teclado vinculado a una pantalla LCD. El sistema esta coordinado por 40 una placa Arduino (Atmel®) sincronizada con un modulo de servocontrol. La placa de agitacion tambien puede incorporar un sistema WiFi para controlar la agitacion a distancia, utilizando un soporte logico informatico.

Todo el sistema puede colocarse dentro de una incubadora.

Desarrollo del tejido osteocondral utilizando el biorreactor rotatorio de camara doble

Para desarrollar un analogo OC, que puede utilizarse ademas como un modelo tisular en 3D in vitro, se cultivan 45 celulas madre sin diferenciar obtenidas a partir de tejido adiposo (ASC, por sus siglas en ingles) aisladas de las bolsas de grasa en un armazon bicapa, procurando diferenciar in situ las celulas de tipo condrocito y osteoblasto. Los armazones bicapa comprenden las capas de tipo cartllago y hueso, que estan compuestas de goma gellan (GG) y de GG con partlculas de hidroxiapatita (HAp) dispersadas, respectivamente.

La formacion in vitro de tejido OC homogeneo y maduro se consigue cultivando las ASC en el interior del armazon bicapa de GG-HAp/GG mediante el uso del biorreactor rotatorio de camara doble. Se proporciona una mediacion qulmica optimizada en cada compartimento de la camara doble, es decir, en un compartimento se proporciona el medio osteogenico y en el segundo compartimento se proporciona el medio condrogenico. La diferenciacion 5 condrogenica de la mezcla de cultivo se realiza basandose en protocolos bien establecidos. A pesar de que la diferenciacion osteogenica de las ASC puede requerir factores de crecimiento adicionales, debido a la presencia de la hidroxiapatita en la parte del armazon de tipo hueso, las condiciones para mantener ambos tipos de celulas en el cultivo conjunto han de optimizarse. La optimizacion, que se beneficia del sistema de cultivo dinamico, cuenta con la presencia e influencia de mediadores osteogenicos/condrogenicos, tales como la dexametasona, acido-2-fosfato L- 10 ascorbico, p-glicerofosfato, protelnas BMP, FGF, GF obtenidos a partir de plaquetas y TGF-p.

La mezcla de los diferentes medios de cultivo se impide debido al flujo independiente a traves de los dos compartimentos de la camara. Esto aumenta el potencial de diferenciacion de las ASC hacia cada linaje en las respectivas capas del armazon. El sistema caracterizado por el biorreactor rotatorio de camara doble y el tejido vivo producido tiene el objetivo de ser utilizado como un modelo OC in vitro en 3D. Estos modelos de tejido en 3D hacen 15 posible el analisis continuo de la produccion de los factores de crecimiento y permiten la optimizacion de las condiciones de cultivo, siendo as! muy prometedores para su aplicacion en la ingenierla de tejidos y en la medicina regenerativa, y para la identificacion de moleculas bioactivas o farmacos (figuras 7, 8 y 9).

La presente divulgacion no esta restringida de ninguna manera a las realizaciones descritas, y un experto habitual en la materia prevera muchas posibilidades de modification de las mismas sin desviarse de la idea basica de la 20 invention, tal y como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Las siguientes reivindicaciones establecen realizaciones particulares de la invencion.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un biorreactor que comprende una placa de agitacion magnetica multiposicion sobre la que se colocan al menos dos camaras dobles, una placa superior que se encaja a la tapa superior de cada camara doble y al menos dos bombas de flujo independientes.
2. 2. El biorreactor de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde las camaras dobles estan fijadas a la placa de agitacion por atraccion magnetica.
3. 3. El biorreactor de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la placa de agitacion tiene un movimiento rotatorio.
4. 4. El biorreactor de acuerdo con la reivindicacion anterior, en donde el movimiento rotatorio es horizontal y/o vertical.
5. 5. El biorreactor de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde el movimiento rotatorio horizontal se aplica de manera independiente para cada camara doble.
6. 6. El biorreactor de acuerdo con la reivindicacion anterior, en donde el movimiento rotatorio horizontal oscila de 0° a 180°.
7. 7. El biorreactor de acuerdo con la reivindicacion anterior, en donde el movimiento rotatorio comprende dos o mas escalas de velocidad programables que oscilan de cero a 0,12 seg/grados.
8. 8. El biorreactor de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde el movimiento rotatorio vertical se aplica simultaneamente a todas las camaras dobles.
9. 9. El biorreactor de acuerdo con la reivindicacion anterior, en donde el movimiento rotatorio vertical oscila de 0° a 180°.
10. 10. El biorreactor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la camara doble comprende:

    - una barrera central con un orificio en el que se insertan los armazones multicapa;

    - entradas y salidas de medio de cultivo independientes;

    - un iman en la parte inferior de la camara;

    - tapas superiores comprimibles y/o desprendibles; y

    - microsensores para registrar los parametros bioqulmicos y/o flsicos.
11. 11. El biorreactor de acuerdo con la reivindicacion anterior, donde la camara doble es una camara de cultivo doble cuya dimension esta adaptada a la dimension de la placa de cultivo, preferentemente de 38,4 mm de diametro y 17,5 mm de altura.
12. 12. Un uso del biorreactor descrito en las reivindicaciones 1-11 en medicina o medicina regenerativa, en particular, en los campos de la biotecnologla, industria farmaceutica, biologla y/o ingenierla de tejidos.
13. 13. El uso del biorreactor de acuerdo con la reivindicacion anterior, para el desarrollo de modelos de tejido in vitro y/o la ingenierla de tejidos de diferentes organos.
14. 14. El uso del biorreactor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-13, para el cribado farmacologico.
15. 15. El uso del biorreactor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, para imitar el movimiento articular de las articulaciones y otros estlmulos mecanicos del cuerpo.