CN101119735A - 超低强度电场网络介导的向离体细胞内递送基因、蛋白质和药物 - Google Patents

超低强度电场网络介导的向离体细胞内递送基因、蛋白质和药物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了采用超低强度LSEFN向大量的各种类型细胞、细胞集落或组织细胞内离体递送基因、蛋白质或药物的方法，此方法中将经生物工程改造的细胞和组织随后全身输入、递送或植入各种器官或组织中以治疗疾病。所用LSEFN腔室的形状和尺寸能将所述细胞、细胞集落或组织紧密容纳在输注室安置有横跨电极阵列的能施加LSEFN脉冲的两层相对膜之间。

Description

超低强度电场网络介导的向离体细胞内递送基因、蛋白质和药物
发明背景
本发明申请与2005年3月19日提交的美国临时专利申请No.60/663,562相关，该专利申请的内容纳入本文作为参考，并按照35USC 119要求其优先权。
1.发明领域
本发明涉及利用超低强度电场网络促进向大量各种类型细胞或细胞集落(例如胰岛)或各种离体组织细胞内递送基因、蛋白质和药物的方法学领域。
2.现有技术说明
电穿孔是一种向细胞或组织施加时间短强度高电脉冲的技术。电刺激可导致细胞膜不稳定继而形成纳米大小的孔洞。在此可渗透状态，细胞膜允许DNA、酶、抗体和其它大分子通过而进入细胞。电穿孔不仅使基因治疗、也使其它领域如透皮药物递送和化学治疗成为可能。
自二十世纪80年代早期以来，已采用电穿孔作为研究工具将DNA、RNA、蛋白质、其它大分子、脂质体、乳胶微球或全病毒颗粒导入活细胞内。电穿孔能将外源基因有效导入活细胞内，由于依靠(样品)杯中的一对针形电极施加电脉冲，此技术仅局限于基础研究中应用于细胞系或原代培养物的小量悬浮液。尚未建立用于治疗的低强度电穿孔介导的可将基因、蛋白质或药物离体递送入大量细胞或细胞集落(例如胰岛)内的系统。
电穿孔常用于体外基因转染，已报导可用一对针形或板形电极在啮齿动物的肿瘤、肝脏、心肌层实施体内基因转移，但此类研究工作有限。近年来，才采用电穿孔导管将肝素递送至家兔的动脉管壁而显著提高了药物递送效率。近年来，我们发明了大动物或人类器官和组织的低强度电穿孔介导的体内基因、蛋白质或药物递送系统(参见纳入本文作为参考的美国专利US 6,593,130，2003)。在本发明中，我们再描述了一种可通过低强度电穿孔介导的向大动物和人类脉管内离体递送基因、蛋白质和药物的装置。
通过低强度电穿孔介导向组织或生物工程改造组织培养物内离体递送基因、蛋白质或药物进行治疗应用的系统尚未见报道。另一方面，高强度电场的电脉冲会导致永久性细胞膜破裂(细胞裂解)。根据现有的最佳知识，施加于样品杯中任何类型细胞、全胚胎或胚胎心脏的电压必须高达200-1500V/cm，而采用针形或板形电极时对任何体内组织施加的电压必须高达100-200V/cm。此时需要关注的主要是创伤，虽然这种创伤从未被详细鉴定过其特征。
发明概述
本发明的一个目的是建立采用超低强度电穿孔方法，在本申请书中定义为低强度电场网络(LSEFN)方法，促进向大量的各种类型细胞或细胞集落(例如胰岛)、或各种类型组织内离体递送基因、蛋白质或药物的构想和应用方法。现应认为本发明所用的生物电机制和本质在性质上不同于现有的电穿孔技术。因此，将本发明的生物电应用称为电穿孔是误导和不正确的。故在本申请书下文中和医学领域中将本发明的生物电应用称为低强度电场网络(LSEFN)。这些经生物工程改造的细胞和组织可再被系统性地输入、递送或植入到各种器官或组织，用于治疗疾病。
本发明包括两部分：1)用超低强度电场介导向各种分离的细胞内离体递送基因、蛋白质和药物；2)用超低强度电场介导向细胞集落(例如胰岛)，或全胚胎内离体递送基因、蛋白质和药物；和3)用超低强度电场介导向各种类型的培养物和经生物工程改造的组织细胞内离体递送基因、蛋白质和药物。
所采用的LSEFN腔室在形态和尺寸上应能将细胞、细胞集落或组织紧密容纳在输注腔室中，并通过包封在相对气体可渗透膜之间的电极串横跨施加低电压LSEFN脉冲。选择通过该气体可渗透膜导入培养液的气体或多种气体可使细胞、细胞集落或组织所需要的特定代谢处于最优和健康状态。在本申请中通过低强度电场网络和优化细胞、细胞集落或组织的培养和气体环境协同性联合作用能最大程度减少，甚至避免现有电穿孔技术常导致的细胞高死亡率。
参见各图说明本发明具有以下特征和优点：低电压电场网的电通透作用对细胞的伤害小；动态电通透作用可导致，例如细胞在静止电场中移动，缓冲液以恒定速度流动引起细胞旋转维持在恒定温度避免细胞受到热伤害，从而与现有技术相比可进行更长时间的LSEFN处理；采用微小电极组成的电阵列可最大程度降低产热和采用密集分布的电场网可提供更接近均一的LSEFN分布以辅助药物输注入细胞；以及所用的非样品杯系统能在一个合适的腔室中使细胞长时间接触(电脉冲)，从而可对大量细胞进行一次性的LSEFN处理，将基因和药物导入细胞内。
因此本发明以图解说明的实施方式中定义为一种向大量细胞、细胞集落或组织递送基因、蛋白质或药物的方法，该方法包括以下步骤：离体向细胞、细胞集落或组织施加电场强度均一和电极化强度均一的LSEFN电场；和将所述基因、蛋白质或药物系统性输入经LSEFN(处理的)细胞、细胞集落或组织中。
此法还包括体内递送已输注的细胞、细胞集落或组织到器官或组织中。
此法还包括使培养液流入浸浴经离体施加LSEFN电场和系统性输入了所述基因、蛋白质或药物的细胞，细胞集落或组织(浴池)的步骤。所述培养液用于培养细胞、细胞集落或组织。流动的培养液易与药物、蛋白质或基因混合而增加了所述药物蛋白质或基因与细胞膜相互作用的机会。
向细胞、细胞集落或组织离体施加LSEFN电场的步骤，包括以预定的一组重复速率施加DC电场脉冲，每一组间隔预定的休止期。向细胞、细胞集落或组织离体施加LSEFN电场的方法步骤，包括施加低于100v/cm，优选约10-1v/cm或更低的LSEFN电场。不论LSEFN电场的测定值，所选择的(电场)强度数量级应不会导致电介质发热和不会对细胞、细胞集落或组织产生生物学伤害。
流动的培养液能使培养液温度基本上维持恒定从而使LSEFN电场中的细胞、细胞集落或组织不受到热伤害。
离体施加LSEFN电场的图解说明方法，包括将细胞、细胞集落或组织安置在LSEFN电场中横跨施加电场至少一对电极之间的步骤。这些电极经排列和布置在其之间提供了一个环周电场。各电场间隔一定距离，使得细胞、细胞集落或组织主要接触其周边电场，从而诸细胞、细胞集落或组织可接触电场强度均一和电极化强度均一的LSEFN电场。在各种几何阵列中可采用一对电极阵列来提供阳极和阴极栅极，或众多不同电极元件的亚阵列。
将细胞、细胞集落或组织安置在容纳细胞、细胞集落或组织的腔室中。将电极阵列安置在腔室壁上或之中，腔室壁密切相容使细胞、细胞集落或组织经受LSEFN，因而提供了电场强度均一和电极化强度均一的LSEFN电场。采用由多个小电极组成的多重阵列来产生或施加LSEFN电场，可产生奇特的环周电场。选择的电极大小与所述细胞、细胞集落或组织的大小相关，从而可提供此种规模的电场强度均一和电极化强度均一的有效LSEFN电场。
在一实施方式中，提供电场强度和电极化强度均一的LSEFN电场是通过使培养液流动浸浴所述细胞、细胞集落或组织，包括移动LSEFN电场中的细胞、细胞集落或组织，转移和旋转LSEFN电场中的细胞、细胞集落或组织。旋转可以是杂乱无序的，包括随机翻滚LSEFN电场中的细胞、细胞集落或组织。这种(培养液)流动使细胞和细胞集落持续在电场中滚动而得以接受均一分布的LSEFN(作用)，同时将细胞、细胞集落或组织维持在无菌和有营养的细胞和组织培养环境中。
可以容易地改进此法，而在一次接触时间内沿延伸接触途径移动所述细胞、细胞集落或组织从而大量产生经介导的细胞、细胞集落或组织，以大量产生或批量产生大量的经基因或药物治疗的细胞、细胞集落或组织。
可通过显微镜观察、检查和检测LSEFN期间将所述基因、蛋白质或药物系统性输注入细胞、细胞集落或组织后细胞、细胞集落或组织的变化，及用显微镜观察LSEFN期间能否将所述基因、蛋白质或药物递送入所述细胞、细胞集落或组织。
本发明还包括按照上述方法中的任何一种，将基因、蛋白质或药物递送入大量的细胞、细胞集落或组织中的装置。
为了语言的流畅性，虽然用功能性解释描述了或将描述所述装置和方法，但应明确理解，除非35USC 112作出明确阐述外，不应以任何方式将本申请的权利要求(范围)理解为必然限于“方法”或“步骤”构成的有限范围内，而是在司法等同原理下权利要求所提供限定的含义及其等同概念的整个范围内，在权利要求按35USC 112作出明确阐述时，则符合35USC 112的全部法定等同条款。现转到以下附图来更好地直观显示和说明本发明，图中同样的数字编号指同样的元件。
附图的简要说明
图1a为实施低电压LSEFN腔室示意图的俯视图。
图1b为图1a腔室的横剖面图。
图2a为两个可渗透膜和夹在它们之间的电极阵列所形成的可屈曲性封装装置的分解透视图，见右图所示。
图2b为两个相对的封装装置的局部分解透视图，具有图1a和1b实施方式的侧面和末端框架。
图2c为图2b组装实施方式的俯视图。
图3a为该腔室第二实施方式的侧面图，提供了可在其中实施低电压LSEFN的可屈曲性圆柱管。
图3b为通过图3a剖面线3b-3b的垂直断面图。
图4为图3a和3b腔室构建形成螺旋装置的透视图。
图5为该腔室第三实施方式的俯视图，可在此腔室中实施低电压LSEFN。
图6为图5腔室的纵剖面图。
图7显示在本发明(实施)低电压LSEFN过程中的典型脉冲序列的时间波形图。
图8为实施本发明用实时显微镜观察LSEFN的实验室设置的图解说明。
图9a和9b显示分别用于阳离子脂质体介导的HIL-10基因转移和腺病毒介导的基因转移的人IL-10cDNA质粒结构图，图9c为显示基因转移百分比的直方图。
图10a为显示转基因表达的叠置胶照片，图10b为转基因/GAPDH比率对LSEFN的电场强度(伏特/厘米)的直方图。
现转到以下优选实施方式的详细描述以更好地理解本发明及其各种实施方式，提供这些优选实施方式作为本发明权利要求书中所确定的说明性实施例，应当明确理解，如权利要求书中所确定的那样，本发明的范围可比下文所述的说明性实施方式更广泛。
优选实施方式详述
在本发明说明性实施方式中，公开了用于离体使基因、蛋白质和药物靶向电通透进入大量分离的细胞和培养组织所用的方法和装置，采用了超低强度电场，持续性短脉冲，和持续性一组长脉冲。为了能够施加超低强度电场以将基因、蛋白质和药物高效递送入分离的细胞、细胞集落和培养组织，我们还设计了该新型基因、蛋白质和药物递送系统的三种不同实施方式。然而必须清楚地理解这些说明性实施方式并非详尽无遗地论述了本发明权利要求书所主张的实施方式范围。
这些实施方式包括用于施加超低强度电场以介导离体向分离的细胞递送基因、蛋白质和药物的装置11。装置11的示意图见图1a的俯视图，侧向横剖面图见图1b，局部分解透视图见图2b，和装配后的俯视图见图2c。在该系统中，电极阵列(10)密封在两个相对的、可屈曲性气体可渗透的透明膜(16a)和(16b)之间，共同以参考数字(16)表示，厚约70μm。膜(16)不需要可弯曲，但可屈曲性使装置11能折叠或形成更紧密的容量而不丧失其二维长度。相对的膜(16a)和(16b)在空间上间隔一定距离，足以让随缓冲液流入的细胞翻滚，但又足够小使(细胞)能紧密接触以下所述的超低压电场，而向细胞提供LSEFN。膜(16)以一对相对的可屈曲性侧边(17)组合形成密封的矩形框15。膜(16)由聚苯乙烯组成，可选择性通透气体O2和CO2。在该说明性实施方式中，每个膜厚约75μm，允许O2和CO2在二膜之间有效交换，但细胞环境与大气环境隔离。这使得生长的细胞可以得到最佳供氧和pH平衡的培养液环境。
装配膜(16)使之包封电极阵列(12)，最佳示意图2a的分解图，其中电极片(12)夹在二膜片(16a)和(16b)之间，然后结合在一起形成包封的电极组件13。
膜(16)优选透明膜，以允许用显微镜观察细胞18，并且是气体可渗透的以允许和促进腔室(20)中细胞18的培养，腔室(20)位于相对的包封电极组件13之间。利用两个相对的电极膜组件13，在由图2b最佳显示的终板(22)、可屈曲上膜和下膜护板，及可屈曲侧护板(21)组成的矩形塑料框15中形成了无菌密封腔室(20)。框架17的护板(19)和(21)可屈曲，允许装置11能形成紧密的三维形状，同时使腔室(20)的线性延长能在两个相对的终板(22)之间延伸。两个灌注针24固定在腔室(20)的终板(22)上穿过终板(22)以允许注入和放出液体并维持缓冲液流过腔室20。
在本发明方法的一优选实施方式中，通过一个灌注针24将大量的分离细胞18注入培养腔室(20)中，使细胞充满腔室(20)。腔室容量介于约10-1000ml之间或更大，但可以改变使之适合于最终应用。将含有所选基因、蛋白质或药物或多种药物的培养液或缓冲液以约10毫升/小时的速度持续灌注通过腔室(20)，保持细胞18移动而不粘附膜(16a)、(16b)，温度维持在37℃。当然应明白，缓冲液的性质、其温度、流速和其它培养参数可以按常规培养原则根据LSEFN、细胞、基因、蛋白质或药物的数量、类型和性质而不同。
可实施本发明的普通实验室设备略图见图8。如图1a和1b所示和描述的条形腔室(58)与脉冲发生器14相连接固定在显微镜62的镜台60上，允许在LSEFN处理过程中用显微镜观察。在生产单位中可能不需要显微镜观察，或者可通过调节条形腔室(58)的性能提供观察。条形腔室(58)可用手移动，或通过操纵杆或其它方法控制的自动化平台或机制(未显示)移动，以允许选择性观察任何区域确定缓冲液、缓冲液中细胞和药物的流动及他们的电穿孔状态。当然可考虑使条形腔室静止不动而移动显微镜62。将条形腔室与灌注泵64耦联以保持缓冲液流动和其中的内含物流过或流入腔室(58)。可通过阀门入口66注入细胞、基因、蛋白、药物或培养缓冲液，加入缓冲液。
将脉冲发生器14产生的优化电脉冲施加于电极阵列(12)的两侧，该阵列为上文图1a和1b中所描述的平面阵列或网格阵列，一阵列(12)与阳极DC电压相连而另一阵列与阴极DC电压相连。阵列(12)元件是按电磁设计原理选择的能在条形腔室(58)内提供弥散或环周电场的屏幕或其它构型。优化的脉冲形式可通过常规原理或试验与误差来确定。施加于阵列(12)跨越缓冲液的LSEFN脉冲可假定为目前已知或后来设计的任何脉冲模式、重复速率和脉冲形状。所用的脉冲模式通常为常规方法中的常规模式和熟知形式，对每种具体应用可着手进行调整。例如，可采用美国专利US 6,593,130(2003)中公开的任何脉冲模式，也可按照熟知的生物物理学原理对其进行改良使之符合或适合本发明的技术。
在该说明性实施方式中，电极阵列(12)的两相对侧间隔大约5mm。跨越腔室(20)的施加电场强度在灌注时约为5伏特/厘米。该场强大大低于常规样品杯装置的200-1500伏特/厘米，因此在本说明书和权利要求书中定义为超低强度电场。处理只需要持续约20-60分钟。但腔室(20)也可以用于长期培养。在用显微镜观察细胞18后可将腔室(20)置于培养箱中进行长期培养。需要时可以重复此种处理。
图1b图解阐明了细胞18在腔室(20)中接触环周或弥散电场。此外，细胞18随缓冲液沿腔室(20)的纵轴流动时易发生滚动或旋转，进一步使细胞膜承受到均一的电场强度和电极化强度。与在静止缓冲液中的情况相比，此结果能更均匀的导致细胞膜通透性增加和输入靶物质。
在图7中更详细地显示了典型的脉冲模式，由大量的间隔脉冲组(50)组成，总接触时间大约20分钟。以与本发明所述相符的方式，可以改变此接触时间，长于或短于上述总接触时间。各脉冲组(50)之间的休止或无效时间(56)约为2分钟，此时没有或基本上没有有效的电场接触。再次的休止或无效时间(56)可以根据实际应用加长或缩短。如图7所示，脉冲组(50)由大量的5ms脉冲(52)组成，各脉冲的间隔(54)是15ms，此时为零电场或无效电场。脉冲组(50)的持续时间可以按照本发明所述改变，也可在各自情况中凭经验进行优化。
在图3和图4的第二种实施方式中，我们提供了用于超低强度电场介导的离体向细胞和细胞集落(例如胰岛)递送基因、蛋白质和药物的装置11。所提供的带有电极阵列(12)的圆柱形或管形培养腔室(26)类似于图1a和图2b所示，可用来向细胞集落28施加发生器14产生的电场。如横剖面图3b更清楚地显示那样，腔室(26)在同心膜(16)之间有包封电极(12)，电极(12b)与阴极端(40)相连而电极(12a)与阳极端(42)相连。电极(12a)和(12b)可以按所需的任何几何形状排列，但是其优选的实施方式见图3b，其中阴极电极(12b)和阳极电极(12a)在几何图形上相互交替以最大扩展环周电场，使其延伸到腔室(26)以及细胞集落28。电极的数目见图3b的图解说明，必须理解电极的数目和它们的形状是设计问题，可以与本发明所述相符的方式以多种方法进行改变。
图4显示了圆柱性腔室(26)，其在图3a中已展开，显示为线形，但可以螺旋卷曲形成更紧密的三维系统。如图3b垂直横剖面图最佳显示的那样，因为腔室(26)的尺寸更接近细胞集落本身的大小，该腔室中的电极阵列(12)比第一种实施方式更加接近细胞集落28。因此，可进一步降低LSEFN电压。例如：可采用约1V/cm电场跨越腔室(26)，该电压仍属于超低电场强度定义。
在图5和图6的第三种实施方式中，我们提供了用于超低强度电场介导的离体向组织32递送基因、蛋白质和药物的另一种装置11。在此实施方式中，可以修饰腔室的大小和形状使之与各种形状的培养组织、或生物工程支架32相匹配。将密封膜(16)中的两个相对电极阵列(12)以图1-4类似方式置于腔室(30)内培养组织32的两端。然而，其中确定的框架(22)和腔室(30)的大小和形状按所要处理组织的具体形状定制。例如，所要处理的组织是一片移植的皮肤组织或角膜，此时框架(22)和腔室(30)的轮廓应与移植的皮肤组织片相匹配，从而在灌注时可对该组织片有效施加低强度电场LSEFN。
现在考虑如何应用本发明对分离的细胞进行基因、蛋白质和药物治疗。可从人体分离得到任何生物学细胞，如淋巴细胞、单核细胞、骨髓、成肌细胞、干细胞等。然后离体用超低强度电场网将基因、蛋白质或药物递送入这些细胞，随后再给病人全身或局部输注或注射进行治疗。例如在癌症治疗中，可分离病人的单核细胞，离体将CXCR3基因递送入这些细胞，再将其注射入肺部对肺癌进行免疫治疗。在干细胞移植中，可将某些抗细胞凋亡基因转染入干细胞，然后将干细胞移植入靶器官。
同样考虑了如何应用本发明对细胞集落进行基因、蛋白质和药物治疗。例如在胰岛细胞集落移植中，可给同种异体或异源胰岛细胞集落离体递送免疫抑制基因以防排斥。
对培养的和工程改造的组织也可用本发明来提供基因、蛋白质和药物治疗。例如：在组织工程改造时，可将PET报告基因递送入培养的组织。
图9a、9b、9c、10a和10b图解说明了初步应用本发明的结果。图9a为人质粒构建图。采用人IL-10cDNA质粒作阳离子脂质体(Gap:DLRIE)介导的hIL-10基因转运和超低强度LSEFN-介导的hIL-10基因转运。图9b阐述了采用腺病毒-人质粒IL-10cDNA构建物作腺病毒介导的基因转运。图9c为直方图，说明腺病毒(Adv，n＝5)，脂质体(Lip，n＝5)或超低强度(10伏特/厘米)LSEFN(Ele，n＝5)介导的体外人IL-10基因转运给人外周血淋巴细胞的效率。为了检测基因转运效率，如先前所述，合成了hIL-10mRNA的地高辛标记的反义和正义RNA探针(Boehringer Mannheim)，用于石蜡切片原位杂交。计算每张切片10个高倍显微镜视野中(放大倍数X400)的淋巴细胞总数和兰染色阳性细胞的百分数，测定基因转运效率。超低强度LSEFN介导的体外基因转运效率比脂质体介导的基因转运高5倍，比腺病毒介导的基因转运效率略高。
图10a为叠置胶图，显示用定量竞争性RT-PCR分析测定的人IL-10转基因表达的代表性数据。在单用人-IL-10载体不用LSEFN(泳道1)或用10伏特/厘米LSEFN而不用载体灌注(泳道2)转染的淋巴细胞中未检测到转基因表达。用人IL-10基因和10伏特/厘米LSEFN(泳道4)处理的淋巴细胞的转基因表达显著高于用5伏特/厘米LSEFN处理的淋巴细胞(泳道3)。
图10b为直方图，描绘了电场强度对超低强度LSEFN介导的体外人淋巴细胞的人IL-10转基因表达比值的作用。转基因表达用定量竞争性RT-PCR分析检测。数据用IL-10/GAPDH RT-cDNA水平的比值表示。各数据点处n等于3-5。当应用10伏特/厘米的电场强度时转基因表达水平最高。与对照(0伏特/厘米)相比P小于0.01。
上述实例并不意味着已详尽无遗地研究了非常大量的应用低强度电场LSEFN来离体递送基因、蛋白质和药物治疗，而对人或动物进行干预、治疗和疾病预防。本发明有许多优点和改进超过现有的实践方法。本发明开创了使基因、蛋白质和药物靶向来预防和治疗大动物和人类疾病的时代。在本发明之前，尚不存在供人用的现存技术。上述公开的超低电压LSEFN概念和技术为我们提供了一个强有力的不用病毒载体的基因转运工具。基本上已清楚，由于病毒中额外的遗传物质和其自我复制特性，采用病毒载体并不总是递送的理想方法。
本领域普通技术人员可不背离本发明思路和范围而对本发明做许多更改和修饰。例如，
因此，必须明白，提供的说明性实施方式目的只是举例，不应认为是对以下权利要求所定义的发明范围的限制。例如，尽管在以下某些组合中阐述了权利要求的诸要素，但必须明确地理解，本发明包括其它具有更少、更多或不同要素的组合，即使原先未以这样的组合提出权利要求，他们已在上文中公开。
应明白，本说明书中描述本发明及各种实施方式所用的词语不仅具有它们通用的含义，还包括在本说明书所述结构、材料或作用中超越通用含义范围的特殊含义。因此，可理解如果某要素在本说明书文词中的含义包括一种以上的含义，那么在权利要求中使用该词时必须理解为通指其得到本说明书和该词语本身支持的所有可能的含义。
因此，下面权利要求书措词或要素的定义是说明书中所定义的，不仅包括字面上陈述的要素组合，还包括具有基本相同的功能以基本相同的方式获得基本相同结果的等价结构、材料或作用。因此，就此意义而言，认为对以下权利要求中的任何一种要素可进行两种或多种要素的等价物取代，或对权利要求书中的两种或多种要素作单一要素取代。虽然在上文中描述了诸要素在某些组合中起作用，甚至为原先的权利要求，但应明确地理解，要求保护的组合中的一种或多种要素在某些情况下可从该组合中删除，要求保护的组合可以是针对亚组合或亚组合的变体。
特别认为，如本领域普通技术人员、现有知识或后来的设计所看到的那样，对要求保护的主题的非实质性改变同等地落在本申请权利要求的范围内。因此，本领域普通技术人员目前或后来知道的明显替换也属于已定义要素的范围内。
因此应明白，本申请的权利要求包括所有上述图解说明和描述的内容，所有概念上的等同物，所有基本上掺入了本发明基本思路的明显替代物。

Claims (39)

1.一种向大量细胞、细胞集落或组织细胞内递送基因、蛋白质或药物的方法，其特征在于，该方法包括：以电场强度均一和电极化强度均一的LSEFN电场向细胞、细胞集落或组织离体施加低强度电场网络(LSEFN)；和
在LSEFN期间将所述基因、蛋白质或药物系统性输入细胞、细胞集落或组织的细胞内。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括在离体施加LSEFN电场和系统性输入所述基因、蛋白质或药物时，使培养液流动以浸浴所述细胞、细胞集落或组织。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括使培养液流动以培养所述细胞、细胞集落或组织。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括使培养液流动以培养所述细胞、细胞集落或组织。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括向体内器官或组织递送输入细胞、细胞集落或组织内。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离体向细胞、细胞集落或组织施加LSEFN电场，包括以预定的一组重复速率、每次间隔预定的休止期施加脉冲DC电场。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离体向细胞、细胞集落或组织施加LSEFN电场，包括施加低于100伏特/厘米的LSEFN电场。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离体向细胞、细胞集落或组织施加LSEFN电场，包括施加约10伏特/厘米或更低的LSEFN电场。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离体向细胞、细胞集落或组织施加LSEFN电场，包括施加约1伏特/厘米或更低的LSEFN电场。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离体向细胞、细胞集落或组织施加LSEFN电场，包括施加低于可能导致电介质发热和对所述细胞、细胞集落或组织产生生物学伤害测定值的LSEFN电场。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离体向细胞、细胞集落或组织施加LSEFN电场，包括将所述细胞、细胞集落或组织安置在LSEFN电场中横跨施加电场的至少一对电极之间的步骤，这些电极经排列和布置在它们之间提供了一个环周电场，各电场间隔一定距离，使得细胞、细胞集落或组织主要接触其周边电场，从而使诸细胞、细胞集落或组织可接触电场强度均一和电极化强度均一的LSEFN电场。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离体向细胞、细胞集落或组织施加LSEFN电场，包括将细胞、细胞集落或组织放在一腔室中，此腔室的壁上或之中安置有电极阵列可产生LSEFN电场，腔室壁紧密容纳所述细胞、细胞集落或组织，使它们能经受LSEFN，因而提供了电场强度均一和电极化强度均一的LSEFN电场。
13.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述使培养液流动浸浴细胞、细胞集落或组织，包括在LSEFN电场中移动细胞、细胞集落或组织。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述在LSEFN电场中移动细胞、细胞集落或组织，包括在LSEFN电场中旋转细胞、细胞集落或组织。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述在LSEFN电场中旋转细胞、细胞集落或组织，包括在LSEFN电场中翻滚细胞、细胞集落或组织。
16.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述使培养液流动浸浴细胞、细胞集落或组织，还包括维持LSEFN电场中培养液温度基本恒定以避免细胞、细胞集落或组织遭受热伤害。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离体向细胞、细胞集落或组织施加的LSEFN电场是电场强度均一和电极化强度均一的LSEFN电场，包括施加的LSEFN电场是采用许多小电极组成的多重阵列产生的奇特环周电场。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述向细胞、细胞集落或组织施加LSEFN电场，包括向细胞、细胞集落或组织施加LSEFN电场和在细胞、细胞集落或组织移动的延长接触途径的一次接触时间间隔内向一批大量的细胞、细胞集落或组织输注基因、蛋白质或药物，从而大量产生经介导的细胞、细胞集落或组织。
19.一种向大量细胞，细胞集落或组织细胞内递送基因、蛋白质或药物的方法，其特征在于，该方法包括：向安置在气体可通透的与细胞、细胞集落或组织密切相容的组织培养腔室中的所述细胞、细胞集落或组织离体施加动态LSEFN电场；和
用显微镜观察LSEFN期间所述基因、蛋白质或药物系统性输入细胞、细胞集落或组织。
20.一种向大量细胞，细胞集落或组织细胞内递送基因、蛋白质或药物的方法，其特征在于，该方法包括：
体外向安置在气体可通透的与细胞、细胞集落或组织密切相容的组织培养腔室中的所述细胞、细胞集落或组织施加动态LSEFN电场；
在LSEFN期间将所述基因、蛋白质或药物系统性输入细胞、细胞集落或组织细胞中；和
用显微镜观察、检查或检测LSEFN期间细胞、细胞集落或组织的变化和能否将所述基因、蛋白质或药物递送入细胞、细胞集落或组织细胞内。
21.一种向大量细胞、细胞集落或组织细胞内递送基因、蛋白质或药物的装置，其特征在于，该装置包括：LSEFN电场发生源，其可向一次接触容量提供强度均一和电极化强度均一的电场；和
在LSEFN期间向所述细胞、细胞集落或组织细胞内系统性输入基因、蛋白质或药物源。
22.如权利要求21所述的装置，其特征在于，该装置还包括在离体施加LSEFN电场和系统性输入所述基因、蛋白质或药物期间，使培养液流入所述细胞、细胞集落或组织所在的浴池。
23.如权利要求22所述的装置，其特征在于，所述浴池为培养浴池。
24.如权利要求21所述的装置，其特征在于，所述LSEFN电场发生源包括能以预定的一组重复速率，每组间隔预定的休止期发射脉冲的DC电场发生源。
25.如权利要求21所述的装置，其特征在于，所述LSEFN电场发生源包括产生低于50伏特/厘米的LSEFN电场发生源。
26.如权利要求21所述的装置，其特征在于，所述LSEFN电场发生源包括产生约10伏特/厘米或更低的LSEFN电场发生源。
27.如权利要求21所述的装置，其特征在于，所述LSEFN电场发生源包括产生约1伏特/厘米或更低的LSEFN电场发生源。
28.如权利要求21所述的装置，其特征在于，所述LSEFN电场发生源包括产生低于导致电介质发热和对细胞、细胞集落或组织产生生物学伤害测定值的LSEFN电场发生源。
29.如权利要求21所述的装置，其特征在于，所述LSEFN电场发生源包括跨越施加该电场的至少一对电极，这些电极经排列和布置在它们之间提供了一环周电场，各电场间隔一定距离使得细胞、细胞集落或组织主要接触其周边电场，从而使诸细胞、细胞集落或组织可接触电场强度均一和电极化强度均一的LSEFN电场。
30.如权利要求21所述的装置，其特征在于，所述LSEFN电场发生源包括：电极阵列和腔室，该腔室壁之中或其上安置有所述电极阵列可产生LSEFN电场，并且腔室壁与经受LSEFN的细胞、细胞集落或组织密切相容，从而能提供电场强度均一和电极化强度均一的LSEFN电场。
31.如权利要求22所述的装置，其特征在于，所述浴池可供培养液流动以移动LSEFN电场中的细胞、细胞集落或组织。
32.如权利要求31所述的装置，其特征在于，所述浴池可供培养液流动以旋转LSEFN电场中的细胞、细胞集落或组织。
33.如权利要求31所述的装置，其特征在于，所述浴池可供培养液流动以翻滚LSEFN电场中的细胞、细胞集落或组织。
34.如权利要求22所述的装置，其特征在于，所述浴池可供培养液流动以维持液体温度基本恒定从而避免LSEFN电场中的细胞、细胞集落或组织遭受热伤害。
35.如权利要求21所述的装置，其特征在于，所述LSEFN电场发生源包括可产生奇特环周电场的由许多小电极组成的多重阵列。
36.如权利要求21所述的装置，其特征在于，所述LSEFN电场发生源和系统输注源经排列和布置可在一次接触时间内容纳一批大量的细胞、细胞集落或组织，可使所述细胞、细胞集落或组织沿延伸接触途径移动，从而能产生大量经介导的细胞、细胞集落或组织。
37.如权利要求36所述的装置，其特征在于，可将所述发生源折叠成紧密的体积而提供延伸的接触途径。
38.一种向大量细胞、细胞集落或组织细胞内递送基因、蛋白质或药物的装置，其特征在于，该装置包括：
用于离体施加动态超低强度电场导致细胞、细胞集落或组织电穿孔的电场发生源；
在LSEFN期间向细胞、细胞集落或组织细胞内系统性输入基因、蛋白质或药物的仪器；和与所述细胞、细胞集落或组织密切相容的气体可渗透性组织培养腔室；
以及用于检测LSEFN期间将所述基因、蛋白质或药物系统性输入细胞，细胞集落或组织内的显微镜。
39.如权利要求38所述的装置，其特征在于，能导致电穿孔的动态超低强度电场的发生源包括：低电场LSEFN脉冲发生器；和耦联于该发生器的相对电极阵列；其中由膜形成的腔室壁包封有界定LSEFN的相对电极阵列，和位于该相对电极阵列之间的输注腔室，该腔室的形状和尺寸可在相对膜包封的电极阵列之间紧密容纳所述细胞、细胞集落或组织，当基因、蛋白质或药物以预定时间流过该腔室时能施加跨越电极阵列的LSEFN脉冲；和
还包括与该腔室相通的密封无菌的能使培养缓冲液循环流动的可控温灌注系统，从而保持细胞、细胞集落或组织在电场中滚动和接受均匀分布的LSEFN作用，同时将细胞、细胞集落和组织维持在无菌和有营养的细胞和组织培养环境中。
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