JP2008532560A - 微弱電界ネットワークを仲介して行う、生体外で細胞内に遺伝子、タンパク質および薬剤を送達する方法および装置 - Google Patents

Abstract

【課題】ＬＳＥＦＮを使用して、生体外で、遺伝子、タンパク質または薬剤を大量の細胞、細胞集塊、または組織に送達しやすくする。
【解決手段】微弱ＬＳＥＦＮ戦略を使用して、遺伝子、タンパク質または薬剤が、巨視的量の各種タイプの細胞、細胞集塊または組織に生体外で送達され、次いでその生物工学的に処理された細胞および組織を、疾患を治療するため各種の器官または組織に、全身的に注入送達または移植する方法を開示する。ＬＳＥＦＮパルスが加えられる、膜で封入された対向電極アレイの間の注入チャンバー内に、細胞、細胞集塊または組織が十分入る形状と大きさを有するＬＳＥＦＮチャンバーを使用する。
【選択図】図１ｂ

Description

この発明は、各種の細胞もしくは細胞集塊、例えば島(islets)、または各種の組織に、微弱電界ネットワーク(ultra low strength electric field network)を使って、大量の遺伝子、タンパク質または薬剤を生体外で送達しやすくする手法の技術分野のものである。

この出願は、２００５年３月１９日出願の米国仮特許願第６０／６６３，５６２号に関連するもので、それをここに援用するとともに、米国特許法第１１９条に基づいてその優先権を主張する。

電気穿孔法は、細胞または組織に高強度の電界パルスを短時間かけることを含む技術である。その電気刺激によって、膜を不安定にし、その結果ナノメートルサイズの細孔を形成する。このような透過性状態によって、膜は、ＤＮＡ、酵素、抗体および他の巨大分子を細胞の中へと通過させることができる。電気穿孔法は、遺伝子療法においてのみならず、薬剤の経皮送達および化学療法などの他の分野においても可能性を持っている。

１９８０年代初期以来、電気穿孔法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、他の巨大分子、リポソーム、ラテックスビーズまたはウイルス全体粒子を、生細胞の中へ導入するための研究手段として使用されている。電気穿孔法は、異種遺伝子を生体細胞中に効率的に導入するが、前記電気パルスが一対の針型電極によってキュベット中に加えられるので、この技術の利用は、基礎研究用の細胞系および初代培養物の少量の懸濁液にのみ限定されてきた。治療に使用するために、大量の細胞または細胞集塊、例えば島細胞に、生体外で(ex vivo)低強度電気穿孔法を介して遺伝子、タンパク質または薬剤を送達するためのシステムは、全く確立されていない。

電気穿孔法は、通常、試験管内で(in vitro)遺伝子導入を行うために使われているが、一対の針型またはプレート型の電極をげっ歯動物の腫瘍、肝臓、心筋に使って、生体内で(in vivo)遺伝子導入する限られた研究が報告されている。ごく最近、電気穿孔カテーテルを使用して、ヘパリンをウサギの動脈壁に送達し、薬剤の送達効率を有意に向上させている。ごく最近、この発明の発明者らは、遺伝子、タンパク質および薬剤を、大型動物およびヒトの器官および組織に低強度電気穿孔法を介して生体内で送達するシステムを発明した（米国特許第６，５９３，１３０号（２００３年）参照）。なお、この特許をここに援用する。その発明では、この発明の発明者らは、遺伝子、タンパク質および薬剤を、大型動物およびヒトの血管内に、低強度電気穿孔法を介して生体外で送達する装置も記述した。

治療用に使用するために、組織または生体工学的に処置された組織培養物に、遺伝子、タンパク質および薬剤を低強度電気穿孔法を介して生体外で(ex vivo)送達するためのシステムは、全く記述されたことがない。一方、高い電界強度を有する電気パルスは、細胞膜を永久的に破壊することがある（細胞崩壊）。現在入手できる最高の知識によれば、キュベットセッティング(cuvette setting)の中のいかなる種類の細胞、全胚または胚心臓に印加される電圧は、２００〜１５００Ｖ／ｃｍ程度で高くなければならず、そして針型またはプレート型の電極を使って生体内組織に印加する電圧は、１００〜２００Ｖ／ｃｍ程度で高くなければならない。そのような場合の損傷は、重大な問題であるが、十分に解明されていない。
米国特許第６，５９３，１３０号明細書

この発明の一目的は、微弱電気穿孔法(ultra low strength electroporation)（この明細書では、低強度電界ネットワーキング(low strength electric field networking)（ＬＳＥＦＮ）戦略と定義する）を使って、生体外で(ex vivo)、遺伝子、タンパク質または薬剤を大量の各種の細胞(cells)もしくは細胞集塊(cell clusters)、例えば、島(islet)、または各種組織(tussues)に送達しやすくする技術思想および応用可能な手法を確立することである。この発明の生体電気印加法の機序と性質は、今やっと、従来技術の電気穿孔法と定性的に異なっているというが分かり始めたところである。故に、この発明の生体電気印加法を電気穿孔法と称することは、誤解を招く恐れがあり、また不正確である。したがって、以下この明細書において、および医学分野において、この発明の生体電気印加法を、低強度電界ネットワーキング（ＬＳＥＦＮ）と称する。これらの生物工学的に処置された細胞および組織は、次いで、系全体的に（全系的に）注入され(be transfused systemically)、疾患を治療するため各種の器官または組織に送達または移植されることができる。

この発明には、以下の三つの要素が含まれている。すなわち、１）微弱電界（超低強度電界）(ultra low strength electric field)を介して行う、各種分離された細胞の中への遺伝子、タンパク質および薬剤の生体外での送達、２）微弱電界によって行う、細胞集塊、例えば、島、または全胚の中への遺伝子、タンパク質および薬剤の生体外での送達、ならびに、３）微弱電界を使って行う、各種培養組織および生物工学的に処置された組織の中への遺伝子、タンパク質および薬剤の生体外での送達、が含まれている。

低電圧ＬＳＥＦＮパルスを印加する、ガス透過性膜で封入された対向電極アレイの間の注入チャンバー内に、細胞、細胞集塊または組織が十分入る形状と大きさを有するＬＳＥＦＮチャンバーを使用する。ガス透過性膜を通して培養液の中へ導入する一種または複数種のガスを選択して、当該細胞、細胞集塊または組織が必要とする特定の代謝や健康を最適化することができる。細胞死の比率が高いことは、従来技術の電気穿孔法ではざらであるが、この出願では、細胞、細胞集塊または組織に対して低強度電界ネットワークと最適の培養およびガスの環境とを相乗作用的に組み合わせることによって、最小限に抑えられまたは回避さえされる。

したがって、ここに具体的に詳解する発明は、次のように特徴づけられ、かつ利点を有する。すなわち、低電圧の電気で透過性にすることによって、細胞の損傷が少なくなる。動的に電気で透過性にするので、すなわち細胞が静電界中で動きかつ一定流量の緩衝液中で回るので、一定温度が維持されかつ細胞の熱損傷が回避されて、従来技術と比べて長期間のＬＳＥＦＮ処理が実施できる。非常に小さい電極の電気アレイを使用することにより、熱を最小限にし、かつより均一な平均的ＬＳＥＦＮ暴露と細胞への注入を行うために放散電界を利用する。そして、小型のチャンバー内で長期間暴露した細胞を使う非キュベットのシステムで、大量の細胞を注入処理し、それを一度に再導入して大きいバッチのプロセスを行う。

したがって、この発明は、その具体的に詳解する実施態様において、細胞、細胞集塊または組織に、生体外で(ex vivo)、ＬＳＥＦＮ電界の平均化された電界強度と平均化された電界方向(electrical polarization)でもってＬＳＥＦＮ電界を掛けるステップと、ＬＳＥＦＮを掛けている間に、前記細胞、細胞集塊または組織の中へその系全体的に遺伝子、タンパク質または薬剤物質を注入するステップとを含んでなる、巨視的量の細胞、細胞集塊または組織に、遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を送達する方法、と定義される。

その方法は、さらに、前記注入された細胞、細胞集塊または組織を、生体内で、器官または組織に送達するステップを含んでいる。

上記方法は、さらに、生体外でＬＳＥＦＮ電界を掛けている間に、および遺伝子、タンパク質または薬剤物質を系全体的に注入している間に、培養液を流して、細胞、細胞集塊または組織を浸すステップを含んでなる。その培養液は、細胞、細胞集塊または組織を培養するのに使用してもよい。その流れる培養液は、薬剤、タンパク質または遺伝子と容易に混合して、薬剤、タンパク質または遺伝子が細胞膜と相互に作用し合う機会が増える。

生体外でＬＳＥＦＮ電界を細胞、細胞集塊または組織に掛けるステップは、所定のバースト繰返し数を有するパルス状ＤＣ電界（各バーストは、所定の休止期間で隔てられている）を掛けることを含んでいる。この方法の、生体外でＬＳＥＦＮ電界を細胞、細胞集塊または組織に掛けるステップは、１００Ｖ／ｃｍより弱いＬＳＥＦＮ電界を掛けることを含み、好ましくは約１０〜１Ｖ／ｃｍまたはそれより弱いＬＳＥＦＮ電界を掛けることを含む。ＬＳＥＦＮ電界は、数値的に決められた値に拘わらず、細胞、細胞集塊または組織に誘電発熱や生物学的損傷を起こさない大きさに選択される。

流体を流すことによって、流体の温度が実質的に一定に維持されて、ＬＳＥＦＮ電界中で細胞、細胞集塊または組織が熱により損傷するのが回避される。

ここに具体的に詳解する、ＬＳＥＦＮ電界を生体外で掛ける方法は、細胞、細胞集塊または組織を、間に電界が生じる少なくとも一対の電極の間のＬＳＥＦＮ電界に配置するステップを含んでいる。これらの電極は、その間に縁辺電界(fringing field)を提供するように配置構成され、かつ細胞、細胞集塊または組織が主として縁辺電界に暴露されて、細胞、細胞集塊または組織がＬＳＥＦＮ電界の平均化された電界強度および平均化された電界方向に暴露されるような距離の間隔で隔てられている。正負のグリッドを提供する対の電極のアレイを採用してもよいし、または各種電極エレメントの複数のサブアレイを各種寸法形状の配置で採用してもよい。

細胞、細胞集塊または組織は、それらを入れるチャンバー内に入れる。前記電極アレイは、そのチャンバーの壁の上にまたは中に設置され、その壁は、ＬＳＥＦＮ電界を受ける細胞、細胞集塊または組織に十分に適合していて、平均化された電界強度と平均化された電界方向のＬＳＥＦＮ電界を提供する。そのＬＳＮＥＦＮ電界は、ぼやけた(pixilated)縁辺電界を発生する複数の小電極の多重アレイを使って発生させるまたは印加される。電極の大きさは、細胞、細胞集塊または組織の大きさに対応して選択されて、その規模でＬＳＥＦＮ電界の実効平均電界強度と平均電界方向を提供する。

ＬＳＥＦＮ電界の電界強度と電界方向の平均化は、一実施態様では、細胞、細胞集塊または組織を浸すために流体を流すことによって提供され、それは、細胞、細胞集塊または組織をＬＳＥＦＮ電界中で動かすことを含んでおり、それは、細胞、細胞集塊または組織をＬＳＥＦＮ電界中で並進させ回転させる。その回転は、カオス的であってもよく、ＬＳＥＦＮ電界内で細胞、細胞集塊または組織がランダムにタンブリングすることを含んでいる。その流体の流れは、細胞、細胞集塊または組織を細胞と組織の滅菌栄養培養環境に維持しながら、前記電界内で細胞および細胞集塊を電界内で回し続け、均一に分布したＬＳＥＦＮを受けさせ続ける。

この方法は、細胞、細胞集塊または組織が移動する延長された暴露経路にわたって、一回の暴露期間中に、大量の細胞、細胞集塊または組織を量産またはバッチ生産するように容易に改変されて、電界を介して処理された細胞、細胞集塊または組織の大量生産がなされる。

ＬＳＥＦＮ電界を掛けている間に細胞、細胞集塊または組織の中へ遺伝子、タンパク質または薬剤を系全体的に注入する状況は、後の遺伝子、タンパク質または薬剤を送達のために、細胞、細胞集塊または組織の能力に関して、ＬＳＥＦＮ電界処理中に細胞、細胞集塊または組織の変化を顕微鏡で観察し、検査し、試験して、把握する。

この発明は、さらに、上記やり方のいずれか一つによって、巨視的量の細胞、細胞集塊または組織に、遺伝子、タンパク質または薬剤物質を送達する装置を含む。

この発明の装置および方法は、文法的な流暢さのために作用的説明でもって記述してきたし、また記述していくが、各請求項は、米国特許法第１１２条でことさらに規定されていない限り、いかなる形でも「手段」または「ステップ」の限定解釈により必然的に限定して解釈されるべきでないこと、各請求項により規定される定義の意味および均等の全範囲が司法上の均等論の下に与えられるべきであること、そして各請求項が米国特許法第１１２条の下で明言的に規定されている場合は、米国特許法第１１２条の下で全法定均等物が与えられるべきであることを、まさにその旨理解されたい。ここで図面に移ることにより、この発明はよりよく思い描くことができ、そこでは同じ要素は同じ番号で参照されている。

次に、各請求項に定義されるこの発明の具体的な詳解例として提示する好適な実施態様についての以下の詳細な説明に移ることにより、この発明およびその種々の実施態様をよりよく理解することができよう。各請求項により定義される発明は、以下に記述する具体的に詳解された実施態様よりも範囲が広くあり得ると、ここで正にそのように理解されたい。

この発明の具体的に詳解された実施態様では、微弱電界強度(ultra low electric field strengths)の短いパルス幅で長いバーストパルス幅の電界を使用して、遺伝子、タンパク質および薬剤のターゲティングを行う際に利用する、大量の分離された細胞および培養された組織を生体外で電気で透過性にする方法および装置が開示されている。分離された細胞、細胞集塊および培養された組織に、遺伝子、タンパク質および薬剤を高度に効率的に送達するため微弱電界を掛けることができるように、この発明の発明者らは、遺伝子、タンパク質および薬剤の新規な送達システムの三種の異なる実施態様も設計した。しかしながら、その具体的に詳解した実施態様は、請求項の範囲内に入ることを意図している実施態様の範囲を網羅するものではないことを、篤と理解すべきである。

これらの実施態様には、分離された細胞に生体外で微弱電界を介して遺伝子、タンパク質および薬剤を送達するために微弱電界を掛ける装置１１が含まれている。装置１１は、図１ａに平面図で、断面側面図で図１ｂに、一部分解斜視図で図２ｂに、および組立て状態の平面図で図２ｃに図式的に示してある。このシステムでは、電極アレイ１２が、二つの対向するガス透過性でかつ透明の可撓性膜１６ａと１６ｂの間に密封されている。なお、これらの膜を合わせて参照番号１６で表すが、約７０μｍ厚である。膜１６は、可撓性である必要はないが、可撓性であると、装置１１をその二次元的広がりを損なうことなく、よりコンパクトな容積に折り畳むかまたは形成することができる。対向する膜１６ａと１６ｂは、それらの間の緩衝液中を流れる細胞をタンブルさせるのに十分な距離で隔てられているが、細胞にＬＳＥＦＮを掛けるため採用される以下に考察する微弱電圧の電界に密接に暴露するのに十分短い距離をおいて配置されている。膜１６は、対向する一対の可撓性側部１７によって結合されて、密封された長方形フレーム１５を形成している。膜１６は、ポリスチレンで構成され、Ｏ₂ およびＣＯ₂ に対して選択的にガス透過性である。そこに具体的に詳解された実施態様では、各膜は、厚さが約７５μｍであり、両方の膜の間でＯ₂ とＣＯ₂ を効率的に交換させることができるが、細胞の環境を周囲の大気から遮断している。このことによって、成長中の細胞に最適な酸素投与を行うことができ、かつバランスのとれたｐＨ媒体が提供される。

膜１６は、図２ａに分解図で最も良好に示されているように、電極のアレイ１２をカプセル封入するように製作されるが、その場合、電極シート１２が膜シート１６ａと１６ｂの間にサンドイッチされ、次いでこれらシートが結合されて封入された電極アセンブリ１３が形成される。

膜１６は、好ましくは、細胞１８を顕微鏡で観察できるように透明であり、そして対向する封入電極アセンブリ１３の間に画成されるチャンバー２０内で細胞１８の培養を可能にかつ容易にするように、ガス透過性である。二つの対向する電極と膜のアセンブリ１３を使って、図２ｂに最もよく示されているような、端部プレート２２、可撓性の頂部と底部の膜パネル１９および可撓性の側部パネル２１で構成されている長方形プラスティックフレーム１５の中に、滅菌密閉チャンバー２０が形成される。フレーム１５のパネル１９と２１は、二つの対向する端部プレート２２の間でチャンバー２０の直線長さの延長を可能としながら、装置１１をコンパクトな三次元の形状に構成できるように、可撓性である。二本の灌流針２４が、チャンバー２０の対向する端部プレート２２に取り付けられかつ貫通して延びていて、流体の注入および放出を可能とし、かつチャンバー２０中を通る緩衝液の流れを維持している。

この発明の方法の好ましい実施態様では、大量の分離された細胞１８が、一方の灌流針２４を通って、培養チャンバー２０の中へ注入されて、その細胞がチャンバー２０に充填される。チャンバーの容量は、約１０〜１０００ｍｌまたはそれより大きいが、最終用途に適合させられるように変更することができる。選択された遺伝子、タンパク質または薬剤の物質の一種もしくは複数種を含む培地または緩衝液が、約１０ｍｌ／ｈの流量でチャンバー２０を通って連続的に灌流されていて、細胞１８を動かしつづけかつ膜１６ａ、１６ｂに付着させないで保ち、そして３７℃の温度に維持されている。緩衝液の種類、緩衝液の温度、流量その他の培養パラメータは、通常の培養基準に従って、目下のＬＳＥＦＮ、細胞、遺伝子、タンパク質または薬剤物質の数、タイプおよび種類に応じて変更できるものである、ということをもちろん理解されたい。

この発明を実行し得る簡単な実験室の装置を図式的に図８に示す。図１ａおよび１ｂに関連して図示し記述したようなストリップチャンバー５８が、パルス発生器１４に接続されて、顕微鏡６２の顕微鏡ステージ６０に載せられおり、ＬＳＥＦＮプロセス中に、顕微鏡観察を行うことができるようになっている。生産装置では、顕微鏡観察は、必要でないかもしれないし、またはストリップチャンバー５８を実現するときにその性質に適合した手段で実施することもできるであろう。ストリップチャンバー５８は、手で動かせるようにもできるし、またはジョイスティックその他の手段で制御される電動のステージまたは機構（図示せず）で動かせるようにもでき、その結果、どの領域でも選択して観察することができて、緩衝液の動き、緩衝液中の細胞および物質、ならびにそれらの電気穿孔の状態を確認することができる。ストリップチャンバー５８を静止させておいて代わりに顕微鏡６２を移動させてもよいことは、もちろん意図している。ストリップチャンバー５８は、そのチャンバー５８を通ってまたはその中で緩衝液が流れその内容物が移動するのを維持する灌流ポンプ６４に連結されている。その緩衝液は、細胞、遺伝子、タンパク質、薬剤または培養緩衝剤溶液を、弁付きポート６６を通して注入することによって、充填することができる。

最適化された電気パルスが、パルス発生器１４から電極アレイ１２の両側に加えられ、そのアレイは、先に図１ａおよび１ｂに記載したように平面のアレイまたはグリッドであり、一方のアレイ１２が正のＤＣ電圧に接続され、他方が負のＤＣ電圧に接続されている。このアレイ１２の細部は、電磁気的設計原理およびストリップチャンバー５８内に放散電界または縁辺電界（はみ出し電界）を提供する目的に従って選択されるスクリーンその他の配置構成としてもよい。パルス形状の最適化は、在来の原理または試行錯誤法で決めてもよい。アレイ１２にそして緩衝液を跨いで加えられるＬＳＥＦＮパルスは、現在知られまたは今後案出されるいかなるパルスプロフィール、繰返し数およびパルス形状を呈してもよい。使用されるパルスプロフィールは、従来のやり方の範囲内にある通常のよく知られているものであり、目下の各特定の用途向けに調節される。例えば、米国特許第６，５９３，１３０号（２００３年）に開示されているどのパルスプロフィールを採用してもよく、さらに、そのパルスプロフィールは、十分に理解されている生物物理学的原理に従って、この発明の教示と矛盾せずまたはそれに適合するように変更してもよい。

電極アレイ１２の対向する二つの側を隔てる距離は、具体的に詳解した実施態様では約５ｍｍである。チャンバー２０を跨いで（両端間に）加えられる電界の強度は、灌流している間、約５Ｖ／ｃｍである。この電界強度は、従来のキュベットセッティングの場合の２００〜１５００Ｖ／ｃｍよりはるかに低く、この明細書および請求項のために微弱電界強度(ultra low electrical field strength)と定義する。その処理は、僅かに約２０〜６０分間続ける必要がある。しかしながら、チャンバー２０は、長期培養にも使用することができる。細胞１８は、長期培養のために、インキュベーター内に入れることができるチャンバー２０内に入っているままで、顕微鏡下で観察することができる。その処置は、必要に応じて繰り返すことができる。

図１ｂは、細胞１８がチャンバー２０内で縁辺電界または放散電界に暴露されていることを図解している。さらに、細胞１８は、緩衝液とともにチャンバー２０の長手軸線下流方向に流れるにつれて、タンブルしたり回転したりしして、さらに細胞膜が暴露される電界の大きさと方向の両者が平均化される。その結果、静止緩衝液の場合よりもより均一に電気穿孔されて注入された細胞または標的が得られる。

典型的なパルスプロフィールをより詳細に図７に示し、それは、約２０分間の全暴露期間にわたって間隔を置いて位置する複数のパルスグループで構成されている。その暴露期間は、より長いまたはより短い全暴露期間にわたって、この発明の教示に矛盾しない要領で変更することができる。実効的な電界暴露がないまたは実質的にない約２分間の停止期間すなわち零期間５６が、各パルスグループ５０間に設けられている。同様に、この停止期間すなわち零期間５６も、目下の用途に応じて、より長くしたりまたはより短くしたりすることができる。パルスグループ５０は、図７に示されているが、図解されているように、各々１５ｍｓの零電界の間隔５４で隔てられている複数の５ｍｓパルスで構成されている。グループ５０のバーストの時間長は、この発明の教示に従って可変であり、かつ各場合に経験的に最適化することができる。

図３ａ〜３ｂおよび図４に示す第二の実施態様では、この発明の発明者らは、細胞、および島などの細胞集塊中に、生体外で、微弱電界を介して、遺伝子、タンパク質および薬剤を送達する装置１１を提供する。円柱形のまたは管形の培養チャンバー２６に、図１ａおよび図２ｂに示したのと類似の電極アレイ１２が設けられており、発生器１４から細胞集塊２８に電界を掛けるのに使用される。図３ｂの断面図に最もよく示されているように、チャンバー２６には、同心膜１６の間に封入された電極１２が設けられており、その電極１２ｂは負端子４０に接続され、そして電極１２ａは正端子４２に接続されている。電極１２ａと１２ｂは、所望のいかなる幾何学的配置で設けてもよいが、好ましい実施態様は図３ｂに示してあり、この場合、負電極１２ｂと正電極１２ａは、チャンバー２６の中へ、したがって細胞集塊２８へと延びる縁辺電界を最大にするために、幾何学的に交互に配置されている。電極の数は、図式的に図３ｂに示してあり、電極の数とその形状は、設計上の問題であり、この発明の教示に合致した要領で多様に変更できると解さなければならない。

図４は、円柱チャンバー２６が、展開されると図３ａに示すように直線的な形になるが、螺旋形にコイル巻きして三次元のよりコンパクトなシステムを形成できることを、示している。図３ｂの垂直断面図に最もよく見られるように、チャンバーの寸法が細胞集塊自体の大きさに殆ど近づけてあるので、このチャンバー２６内では、電極アレイ１２は、第一の実施態様の場合より細胞集塊２８に近接している。したがって、ＬＳＥＦＮの電圧は、さらに下げることができる。例えば、チャンバー２６を跨いで約１Ｖ／ｃｍの電界を採用することができ、この価もまた微弱電界強度の定義の範囲内に含まれる。

図５および６に示す第三の実施態様では、この発明の発明者らは、組織３２中に、生体外で、微弱電界を介して、遺伝子、タンパク質および薬剤を送達する別の装置１１を提供する。この実施態様では、チャンバーの大きさと形状は、各種形状の培養組織または生物工学的に処理されたスカホールド(scaffold)３２に合うように改変することができる。密閉された膜１６の中の二つの対向する電極アレイ１２は、チャンバー３０の中に、図１〜４と類似の要領で培養組織３２の両側に設置されている。しかし、フレーム２２の大きさと形状およびその中に画成されているチャンバー３０は、処理されている組織の特定の形状に対してカスタマイズされる。例えば、皮膚移植組織または角膜の断片が処理される組織であることがあるが、その場合、フレーム２２とチャンバー３０は、皮膚移植組織の断片に合った輪郭を有し、その結果、低強度電界ＬＳＥＦＮを、灌流中に、前記断片に効果的に掛けることができる。

ここで、分離された細胞のために、この発明をどのように使って、遺伝子、タンパク質および薬剤による治療法を提供するかを検討する。リンパ球、単球、骨髄、筋芽細胞、幹細胞などの生体細胞は、いずれも人体から分離することができる。次いで、これら細胞に、微弱電界を使用して、生体外で、遺伝子、タンパク質または薬剤を送達したものを、治療を目的として、患者に全身的に(systemically)または局所的に注入または注射する。例えば、癌を治療する場合、単球を患者から分離し、次に、その細胞の中へＣＸＣＲ３遺伝子を生体外で送達したものを、肺に注射して肺癌の免疫治療を行うことができる。幹細胞を移植する場合は、ある種の抗アポトーシス遺伝子を当該幹細胞に導入した後、標的器官に移植することができる。

同様に、細胞集塊のために、この発明をどのように使って、遺伝子、タンパク質および薬剤による治療法を提供するかを検討する。例えば、島細胞の集塊を移植する場合、同種異系または外因性の島細胞集塊に、拒絶反応を防止するための免疫抑制遺伝子を、生体外で送達することができる。

また、この発明は、培養組織および遺伝子工学的に処理された組織のために、遺伝子、タンパク質および薬剤による治療法を行うのに使われる。例えば、遺伝子工学的に処理された組織の場合、培養中の組織にＰＥＴレポーター遺伝子を送達することができる。

図９ａ、９ｂ、９ｃ、１０ａおよび１０ｂは、この発明を予備的に使用した結果をグラフで示している。図９ａは、ヒトプラスミドの構造を示す模式図である。ヒトプラスミドのＩＬ−１０ｃＤＮＡは、カチオンリポソーム（Ｇａｐ：ＤＬＲＩＥ）を介して行うｈＩＬ−１０遺伝子の輸送および微弱ＬＳＥＦＮを介して行うｈＩＬ−１０遺伝子の輸送に使用される。図９ｂは、アデノウイルスを介して行う遺伝子の輸送に使用されるアデノウイルス・ヒトプラスミドＩＬ−１０ｃＤＮＡの構造を図解する。図９ｃは、アデノウイルス（Ａｄｖ、ｎ＝５）、リポソーム（Ｌｉｐ、ｎ＝５）または微弱（１０Ｖ／ｃｍ）ＬＳＥＦＮ（Ｅｌｅ、ｎ＝５）を介して行う、ヒト末梢リンパ球内のヒトＩＬ−１０遺伝子の試験管内(in vitro)の輸送の効率を図解する棒グラフである。この遺伝子輸送の効率を測定するため、ｈＩＬ−１０ ｍＲＮＡのアンチセンスおよびセンスのジゴキシゲニン標識のリボプローブ（Boehringer Mannheim）を合成して、先に述べたように、パラフィン切片上に原位置でハイブリッド形成させるために使用した。この遺伝子輸送の効率は、一切片当たり、１０個の高倍率顕微鏡視界（倍率、×４００）でカウントした、全リンパ球中の青色染色で陽性の細胞の百分率として測定した。微弱ＬＳＥＦＮで仲介して行った試験管内での遺伝子輸送の効率は、リポソーム仲介による遺伝子輸送の５倍と高く、かつアデノウイルス仲介による遺伝子輸送より僅かに高かった。

図１０ａは、競合ＲＴ−ＰＣＲ定量分析法で検出したヒトＩＬ−１０導入遺伝子発現の代表的データを示す重合せゲル図解(superimposed gel illustration)である。導入遺伝子の発現は、ＬＳＥＦＮなしでヒトＩＬ−１０ベクターのみで導入されたリンパ球（レーン１）にも、灌流なしの１０Ｖ／ｃｍのＬＳＥＦＮでベクターを使って処理したリンパ球（レーン２）にも、検出されなかった。導入遺伝子の発現レベルは、ヒトＩＬ−１０遺伝子と１０Ｖ／ｃｍのＬＳＥＦＮで処理されたリンパ球（レーン４）の方が、５Ｖ／ｃｍのＬＳＥＦＮで処理されたリンパ球（レーン３）に比べて有意に高かった。

図１０ｂは、微弱ＬＳＥＦＮを介して試験管内でヒトＩＬ−１０で導入した遺伝子の、ヒトリンパ球中での発現比率に対する、電界強度の効果をプロットした棒グラフである。導入遺伝子の発現は、競合ＲＴ−ＰＣＲ定量分析法で検出した。データは、ＩＬ−１０／ＧＡＰＤＨ ＲＴ−ｃＤＮＡレベルの比で示してある。ｎは、各データ点で３〜５である。導入遺伝子の発現レベルは、１０Ｖ／ｃｍの電界強度を掛けたとき最高であった。Ｐ値は、対照（０Ｖ／ｃｍ）の値と比べて０．０１より小さかった。

上記の実施例は、生体外で、遺伝子、タンパク質および薬剤を送達する治療に、低強度電界ＬＳＥＦＮを使用することができ、その結果、ヒトまたは動物の介入、治療および疾患の予防のために使用することができるという、非常に多くの用途を、決して網羅している訳ではない。この発明は、既存の常法を超える多くの利点または改良点を有している。この発明は、大型動物とヒトの疾患の予防と治療を行うための、遺伝子、タンパク質および薬剤のターゲティングに新しい時代を開くものである。この発明より前には、ヒトに適用できる既存の技術は全くなかった。上記に開示した微弱電圧ＬＳＥＦＮの技術思想と技術は、ウイルスベクターを使用せずに遺伝子を輸送する強力なツールを我々に提供してくれる。ウイルスベクターを使用することは、ウイルス中の他の遺伝物質およびそれ自体の自己複製性のために、必ずしも理想的な送達法ではないことが、その後、明らかになってきている。

多くの変更や修正が、この発明の精神および範囲を逸脱することなしに、当業者によってなしうるであろう。

したがって、ここに具体的に詳解した実施態様は、単に例示の目的で記載されたものであり、前掲の各請求項により定義される発明を限定するものと受け取ってはいけないと理解されなければならない。例えば、ある請求項の複数要素が特定の組合せで記載されているという事実に拘わらず、この発明は、より少ない要素、より多い要素、または異なる要素での他の組合せをも、たとえそのような組合せが当初請求されていなくても、ここに開示されているものは含むものであるということを、篤と理解しなければならない。

この発明およびその各種実施態様を記述するためにこの明細書で使用された語は、その一般的に定義された意味においてだけでなく、この明細書における特別の定義により、その一般的に定義されている意味の範囲を超えた構造、材料または働きを含むと理解すべきである。したがって、一つの要素がこの明細書の文脈の中で二つ以上の意味を包含すると理解できる場合には、請求項でのその使用は、この明細書およびその語自体により裏付けられる全ての可能な意味について包括的であると理解しなければならない。

したがって、前掲の各請求項の語または要素の定義は、この明細書において、文言どおりに記載された要素の組合せだけでなく、実質的に同一の要領で実質的に同一の作用をして実質的に同一の結果を得る全ての均等な構造、材料または働きを包含するものとして、定義されている。したがって、この意味で、前掲の各請求項におけるどの一つの要素を二つ以上の要素で等価的に置換してもよいこと、または請求項における二つ以上の要素を単一の要素で置き換えてもよいことを、筆者は意図している。複数の要素が特定の組合せで働くように上述され、そのように当初請求されているかもしれないが、請求された組合せからの一つまたは複数の要素は、場合によっては、その組合せから外すことができ、また請求された組合せは部分的組合せにまたは部分的組合せの変形に向けられてもよいことを、篤と理解されたい。

当業者から見て、請求された主題からの非現実的な変更は、現在知られているものでも今後案出されるものでも、各請求項の範囲内の均等物であると意識的に意図している。したがって、当業者にとって現在知られておりまたは今後知られる自明な置換は、定義された要素の範囲内であるものと定義されている。

したがって、各請求項は、上記に具体的に図解および記述されたもの、概念的に均等なもの、自明に置き換えできるもの、およびこの発明の必須の思想を本質的に取り込んでいるものをも包含していると理解されるべきである。

低電圧ＬＳＥＦＮを実行できるチャンバーの概念図の平面図である。 図１ａのチャンバーの図式的断面図である。 図の右側に示す可撓性の封入アセンブリを形成する、２枚の透過性膜とその間にサンドイッチされた電極アレイの分解斜視図である。 図１ａと１ｂの実施態様の側面と端面のフレームを有する二つの対向する封入アセンブリの部分分解斜視図である。 図２ｂの実施態様を組み立てた平面図である。 低電圧ＬＳＥＦＮを実施できる可撓性円柱形管として提供される第二実施態様のチャンバーの概念図の側面図である。 図３ａの３Ｂ−３Ｂ切断線で見た垂直断面図である。 らせん状アセンブリを形成するように構成された、図３ａと３ｂのチャンバーの図式的斜視図である。 低電圧ＬＳＥＦＮを実行できる第三実施態様のチャンバーの概念図の平面図である。 図５のチャンバーの図式的縦断面図である。 この発明の低電圧ＬＳＥＦＮプロセスにおける典型的なパルスシーケンスを示す波形タイミング図である。 ＬＳＥＦＮの実時間顕微鏡観察でこの発明を実施できる実験装置の図式的描写である。 カチオンリポソームで仲介したＨＩＬ−１０遺伝子の導入に使用したヒトプラスミドＩＬ−１０ｃＤＮＡの構造を示す線図である。 アデノウイルスで仲介したＨＩＬ−１０遺伝子の導入に使用したヒトプラスミドＩＬ−１０ｃＤＮＡの構造を示す線図である。 遺伝子導入の百分率を示す棒グラフである。 導入遺伝子の発現を示す重合せゲルの写真である。 導入遺伝子／ＧＡＰＤＨ比対ＬＳＥＦＮのための電界強度（Ｖ／ｃｍ）の関係を示す棒グラフである。

符号の説明

１１ … 送達装置
１２ … 電極アレイ
１３ … 電極アセンブリ
１４ … パルス発生器
１５ … フレーム
１６ … 可撓性膜
１７ … 可撓性側部
１８ … 細胞
１９ … 膜パネル
２０ … チャンバー
２１ … 側部パネル
２２ … 端部プレート
２４ … 灌流針

Claims (39)

1. 巨視的量の細胞、細胞集塊または組織に、遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を送達する方法であって、
   細胞、細胞集塊または組織に、生体外で、低強度電界ネットワーキング（ＬＳＥＦＮ）を、そのＬＳＥＦＮ電界の平均化された電界強度と平均化された電界方向でもって掛けるステップと、
   ＬＳＥＦＮ電界を掛けている間に、前記細胞、細胞集塊または組織の中へその系全体的に前記遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を注入するステップと、
   を含んでなる方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、さらに、
   生体外でＬＳＥＦＮ電界を掛けている間に、および前記遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を系全体的に注入している間に、流体を流して前記細胞、細胞集塊または組織を浸すステップを含む
   ことを特徴とする方法。
3. 請求項２に記載の方法であって、さらに、
   前記流体を流して前記細胞、細胞集塊または組織を培養するステップを含む
   ことを特徴とする方法。
4. 請求項１に記載の方法であって、さらに、
   流体を流して前記細胞、細胞集塊または組織を培養するステップを含む
   ことを特徴とする方法。
5. 請求項１に記載の方法であって、さらに、
   前記注入された細胞、細胞集塊または組織を、生体内で、器官または組織に送達するステップを含む
   ことを特徴とする方法。
6. 請求項１に記載の方法において、
   生体外でＬＳＥＦＮ電界を前記細胞、細胞集塊または組織に掛けるステップが、所定のバースト繰返し数を有するパルス状ＤＣ電界を掛けることを含んでおり、その各バーストが所定の休止期間で隔てられている
   ことを特徴とする方法。
7. 請求項１に記載の方法において、
   生体外でＬＳＥＦＮ電界を前記細胞、細胞集塊または組織に掛けるステップが、１００Ｖ／ｃｍより弱いＬＳＥＦＮ電界を掛けることを含んでいる
   ことを特徴とする方法。
8. 請求項１に記載の方法において、
   生体外でＬＳＥＦＮ電界を前記細胞、細胞集塊または組織に掛けるステップが、約１０Ｖ／ｃｍ以下のＬＳＥＦＮ電界を掛けることを含んでいる
   ことを特徴とする方法。
9. 請求項１に記載の方法において、
   生体外でＬＳＥＦＮ電界を前記細胞、細胞集塊または組織に掛けるステップが、約１Ｖ／ｃｍ以下のＬＳＥＦＮ電界を掛けることを含んでいる
   ことを特徴とする方法。
10. 請求項１に記載の方法において、
    生体外でＬＳＥＦＮ電界を前記細胞、細胞集塊または組織に掛けるステップが、前記細胞、細胞集塊または組織に、誘電発熱と生体損傷を起こす決まった値より弱いＬＳＥＦＮ電界を掛けることを含んでいる
    ことを特徴とする方法。
11. 請求項１に記載の方法において、
    生体外でＬＳＥＦＮ電界を前記細胞、細胞集塊または組織に掛けるステップが、間にＬＳＥＦＮ電界が生じる少なくとも一対の電極の間のＬＳＥＦＮ電界に前記細胞、細胞集塊または組織を配置することを含んでおり、それら電極は、その間に縁辺電界を提供するように配置構成され、かつ前記細胞、細胞集塊または組織が前記縁辺電界に主として暴露されて、前記細胞、細胞集塊または組織が前記ＬＳＥＦＮ電界の平均化された電界強度と平均化された電界方向に暴露されるような距離をおいて隔てられている
    ことを特徴とする方法。
12. 請求項１に記載の方法において、
    生体外でＬＳＥＦＮ電界を前記細胞、細胞集塊または組織に掛けるステップは、前記ＬＳＥＦＮ電界を発生する電極アレイが中にまたは上に配置されている壁であってＬＳＥＦＮ電界を受ける前記細胞、細胞集塊または組織に十分適合している壁を有するチャンバー内に前記細胞、細胞集塊または組織を入れることを含んでおり、それにより前記ＬＳＥＦＮ電界の平均化された電界強度と平均化された電界方向を提供する
    ことを特徴とする方法。
13. 請求項２に記載の方法において、
    流体を流して前記細胞、細胞集塊または組織を浸すステップが、前記細胞、細胞集塊または組織を前記ＬＳＥＦＮ電界内で動かすことを含んでいる
    ことを特徴とする方法。
14. 請求項１３に記載の方法において，
    前記細胞、細胞集塊または組織を前記ＬＳＮＥＦＮ電界内で動かすことが、前記細胞、細胞集塊または組織を前記ＬＳＥＦＮ電界内で回すことを含んでいる
    ことを特徴とする方法。
15. 請求項１４に記載の方法において、
    前記細胞、細胞集塊または組織を電界内で回すことが、前記細胞、細胞集塊または組織を前記ＬＳＥＦＮ電界内でタンブルさせることを含んでいる
    ことを特徴とする方法。
16. 請求項２に記載の方法において、
    流体を流して前記細胞、細胞集塊または組織を浸すステップが、前記流体の温度を実質的に一定に保持して、前記細胞、細胞集塊または組織が前記ＬＳＥＦＮ電界中で、熱によって損傷するのを避けるステップをさらに含んでいる
    ことを特徴とする方法。
17. 請求項１に記載の方法において、
    前記細胞、細胞集塊または組織に、生体外で、ＬＳＥＦＮ電界を、そのＬＳＥＦＮ電界の平均化された電界強度と平均化された電界方向でもって掛けるステップが、複数の小電極の多重アレイを使用して前記ＬＳＥＦＮ電界を掛け、ぼやけた縁辺電界を発生させることを含んでいる
    ことを特徴とする方法。
18. 請求項１に記載の方法において、
    前記細胞、細胞集塊または組織に前記ＬＳＥＦＮ電界を掛けるステップが、一バッチの多数の細胞、細胞集塊または組織に、それら細胞、細胞集塊または組織が移動する延長された暴露経路にわたって、一回の暴露期間中に、前記ＬＳＥＦＮ電界を掛けて、前記遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を系全体的に注入することを含んでなり、その結果、仲介された細胞、細胞集塊または組織の大量生産がなされる
    ことを特徴とする方法。
19. 巨視的量の細胞、細胞集塊または組織に、遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を送達する方法であって、
    細胞、細胞集塊または組織に十分適合したガス透過性の組織培養チャンバーの中に、細胞、細胞集塊または組織を入れて、それに生体外で動的ＬＳＥＦＮ電界を掛けるステップと、
    ＬＳＥＦＮ電界を掛けている間に、前記細胞、細胞集塊または組織の中へその系全体的に前記遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を注入するのを顕微鏡で観察するステップと、
    を含んでなる方法。
20. 巨視的量の細胞、細胞集塊または組織に、遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を送達する方法であって、
    細胞、細胞集塊または組織に十分適合したガス透過性の組織培養チャンバーの中に、細胞、細胞集塊または組織を入れて、それに生体外で動的ＬＳＥＦＮ電界を掛けるステップと、
    ＬＳＥＦＮ電界を掛けている間に、前記細胞、細胞集塊または組織の中へその系全体的に前記遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を注入するステップと、
    ＬＳＥＦＮ電界を掛けている間に、その後の遺伝子、タンパク質または薬剤の送達のために、前記細胞、細胞集塊または組織の能力に関して、前記細胞、細胞集塊または組織の変化を顕微鏡で観察、検査または試験するステップと、
    を含んでなる方法。
21. 巨視的量の細胞、細胞集塊または組織に、遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を送達する装置であって、
    暴露容積に平均化された電界強度と平均化された電界方向を提供するＬＳＥＦＮ電界の提供源と、
    ＬＳＥＦＮ電界を掛けている間に、細胞、細胞集塊または組織の中へその系全体的に遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を注入する注入源と、
    を備えてなる装置。
22. 請求項２１に記載の装置であって、さらに、
    生体外でＬＳＥＦＮ電界を掛け、かつ前記遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を系全体的に注入している間に、前記細胞、細胞集塊または組織を中で処理する流動流体の浴を備えてなる
    ことを特徴とする装置。
23. 請求項２２に記載の装置において、
    前記浴が培養浴である
    ことを特徴とする装置。
24. 請求項２１に記載の装置において、
    前記ＬＳＥＦＮ電界の提供源が、所定のバースト繰返し数を有しかつ各バーストが所定の休止期間で隔てられているパルス状ＤＣ電界の提供源を含んでいる
    ことを特徴とする装置。
25. 請求項２１に記載の装置において、
    前記ＬＳＥＦＮ電界の提供源が、５０Ｗ／ｃｍより弱いＬＳＥＦＮ電界を発生する提供源を含んでいる
    ことを特徴とする装置。
26. 請求項２１に記載の装置において、
    前記ＬＳＥＦＮ電界の提供源が、約１０Ｖ／ｃｍ以下のＬＳＥＦＮ電界を発生する提供源を含んでいる
    ことを特徴とする装置。
27. 請求項２１に記載の装置において、
    前記ＬＳＥＦＮ電界の提供源が、約１Ｖ／ｃｍ以下のＬＳＥＦＮ電界を発生する提供源を含んでいる
    ことを特徴とする装置。
28. 請求項２１に記載の装置において、
    前記ＬＳＥＦＮ電界の提供源が、前記細胞、細胞集塊または組織に誘電発熱および生体損傷を起こす決まった値より低い弱いＬＳＥＦＮ電界を発生する提供源を含んでいる
    ことを特徴とする装置。
29. 請求項２１に記載の装置において、
    前記ＬＳＥＦＮ電界の提供源が、電界を掛ける少なくとも一対の電極を有し、それら電極は、その間に縁辺電界を提供するように配置構成され、かつ前記細胞、細胞集塊または組織が主として前記縁辺電界に暴露されて、前記ＬＳＥＦＮ電界の平均化された電界強度および平均化された電界方向に暴露されるような距離をおいて隔てられている
    ことを特徴とする装置。
30. 請求項２１に記載の装置において、
    前記ＬＳＥＦＮ電界の提供源が、電極アレイ、および前記ＬＳＥＦＮ電界を発生する電極アレイが中にまたは上に配置されている壁であってＬＳＥＦＮを受ける前記細胞、細胞集塊または組織に十分適合している壁を有するチャンバーを含んでおり、それにより前記ＬＳＥＦＮ電界の平均化された電界強度と平均化された電界方向を提供する
    ことを特徴とする装置。
31. 請求項２２に記載の装置において、
    前記浴が、流動流体を提供して、前記細胞、細胞集塊または組織を前記ＬＳＥＦＮ電界内で動かす
    ことを特徴とする装置。
32. 請求項３１に記載の装置において、
    前記浴が、流動流体を提供して、前記細胞、細胞集塊または組織を前記ＬＳＥＦＮ電界内で回す
    ことを特徴とする装置。
33. 請求項３２に記載の装置において、
    前記浴が、流動流体を提供して、前記細胞、細胞集塊または組織を前記ＬＳＥＦＮ電界内でタンブルさせる
    ことを特徴とする装置。
34. 請求項２２に記載の装置において、
    前記浴が、流動流体を提供して、その流体の温度を実質的に一定に維持して前記細胞、細胞集塊または組織が前記ＬＳＥＦＮ電界内で熱によって損傷するのを回避する
    ことを特徴とする装置。
35. 請求項２１に記載の装置において、
    前記ＬＳＥＦＮ電界の提供源が、ぼやけた縁辺電界を発生する複数の小電極からなる多重アレイを含んでいる
    ことを特徴とする装置。
36. 請求項２１に記載の装置において、
    ＬＳＥＦＮ電界の前記提供源および系全体的に注入する前記注入源が、前記細胞、細胞集塊または組織が移動する延長された暴露経路にわたって、一回の暴露期間中に、一バッチの多数の細胞、細胞集塊または組織を収容するように配置構成されており、その結果、仲介された細胞、細胞集塊または組織の大量生産がなされる
    ことを特徴とする装置。
37. 請求項３６に記載の装置において、
    前記提供源および供給源は、延長された暴露経路を提供するものでありながら、小容積に折りたたまれるものである
    ことを特徴とする装置。
38. 巨視的量の細胞、細胞集塊または組織に、遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を送達する装置であって、
    細胞、細胞集塊または組織に生体外で暴露するための動的微弱電界電気穿孔を行う電界提供源と、
    ＬＳＥＦＮ電界を掛けている間に、前記細胞、細胞集塊または組織の中へその系全体的に前記遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を注入する手段と、
    前記細胞、細胞集塊または組織に十分適合しているガス透過性の組織培養チャンバーと、
    ＬＳＥＦＮ電界を掛けている間に、前記細胞、細胞集塊または組織の中へ系全体的に前記遺伝子、タンパク質または薬剤の物質が注入されていることを確認する顕微鏡と、
    を備えてなる装置。
39. 請求項３８に記載の装置において、
    動的微弱電界穿孔を行う電界供給源が、弱電界ＬＳＥＦＮパルスの発生器およびその発生器に連結された対向電極のアレイを有し、
    前記ガス透過性の組織培養チャンバーが、ＬＳＥＦＮを規定する対向電極のアレイを封入する膜で形成された壁を有するチャンバー、および前記アレイの前記対向電極の間に画成された注入チャンバーを有し、前記注入チャンバーは、膜で封入された対向電極のアレイの間に前記細胞、細胞集塊または組織が十分に入る形状と大きさを有し、その電極アレイの両端にＬＳＥＦＮパルスが、遺伝子、タンパク質または薬剤の物質を所定の期間そのチャンバーを通して流しながら、加えられ、そして
    さらに、この装置は、前記ガス透過性組織培養チャンバーに連通された、密閉された滅菌されかつ温度制御されている循環培養緩衝液潅流システムを備えてなり、そのシステムにより、前記細胞、細胞集塊および組織を滅菌した栄養性の細胞および細胞集塊の培養環境中に維持しながら、前記細胞および細胞集塊を前記電界中で回し続けかつ均一に分布したＬＳＥＦＮを受けさせ続ける
    ことを特徴とする装置。

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