JP2002516678A - 生体外遺伝子治療のためのフロースルー電気穿孔システム - Google Patents

生体外遺伝子治療のためのフロースルー電気穿孔システム

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ホフマン、グンター
ラブッセイ、ディエトマー
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ジェネトロニクス、インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞にあらかじめ選択した分子を接触させ、細胞に複数の一連の電気パルスを印加することで、あらかじめ選択した分子を生細胞に導入する方法及び装置である。この方法は生体外で実行できる。複数の電気パルスは回転電界を発生し、生細胞を死滅させることなく一時的な細孔を細胞に形成する。回転電界は、２つ以上の電極（１５０）を有するフロースルーチャンバ装置（１００）内に供給される。例えば、収集、電気穿孔、電気泳動といった３ステップパルス処理を利用して、選択した分子を細胞内に導入する。連続するパルス間で細胞の位置を再調整する機械的手段（７１０）もまた提供する。この装置は更に細胞に異なる温度でパルスを印加し、パルス印加後、細胞を異なる温度で特定の滞留時間内で回復させる手段（５４０）も有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は一般に細胞の透過性を高めるための電気パルスの利用、特にフロース
ルー電気穿孔システムに関する。
【０００２】 （発明の背景） 電界を利用して、細胞に恒久的な損傷を与えることなく細孔を形成することが
できる。これにより、大きな分子を細胞の細胞質に挿入することができるように
する。遺伝子や薬物といった他の分子を、電気穿孔法と呼ばれる処理により生細
胞に導入することができる。遺伝子や他の分子は、緩衝媒体内で生細胞と混合さ
れる。高電界の短いパルスを印加して細胞膜を一時的に多孔性にすることで、遺
伝子または分子を細胞に挿入して細胞のゲノムを変更することができる。
【０００３】 研究により、長いヌクレオチド配列（例えば、６３０ｋｂまで）を哺乳類の細
胞に電気穿孔を用いて導入することができることが知られている（Ｅａｎｕｌｔ
他、遺伝子（アムステルダム）１４４（２）：２０５、１９９４年；核酸研究、
１５（３）：１３１１、１９８７年；Ｋｎｕｔｓｏｎ他、生化学分析、１６４：
４４、１９８７年；Ｇｉｂｓｏｎ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、６（８）：２４５７、１
９８７年；Ｄｏｗｅｒ他、遺伝子工学、１２：２７５、１９９０年；Ｍｏｚｏ他
、植物分子生物学、１６：９１７、１９９１年）。しかしながら、現行の文献の
記載からかわるように、電気穿孔の効率は通常悪い（ここに文献として援用する
米国特許５０１９０３４号参照のこと）。条件、パラメータ及び細胞の種類にも
よるが、通常、トランスフェクションが約５〜２０％という結果になる。生細胞
へ電気穿孔を用いて核酸の転移及び他のあらかじめ選択した分子を導入する高効
率の方法及び装置の開発が求められていた。
【０００４】 カリフォルニア州サンディエゴのＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ社は、生体外フロー
スルー電気穿孔法及びチャンバを米国特許第５６７６６４６号及び第５５４５１
３０号で開示しており、その内容をここに文献として援用する。
【０００５】 （発明の概要） 本発明は、細胞にあらかじめ選択した分子を接触させ、細胞に複数の一連の３
ステップパルスを電気的に印加することで、あらかじめ選択した分子を生細胞に
導入する方法及び装置を提供する。この方法は生体外で実行できる。
【０００６】 収集、電気穿孔、電気泳動の３つの期間を有する３ステップパルス処理により
、選択した分子を細胞内に導入する。各３ステップパルスは、それぞれの機能を
達成するための特定の幅及び強度を有する３つの別々の電気インパルスからなる
。
【０００７】 各３ステップパルスはフロースルーチャンバ装置内に特定の配向の電界を発生
させる。異なる電界配向の複数の３ステップパルスを印加することにより、回転
電界を発生させることができる。この回転電界は生細胞を死滅させることなく細
胞に一時的な細孔を形成することができる。回転電界は、２つ以上の電極を有す
るフロースルーチャンバ装置内に供給される。
【０００８】 例えば、細胞分子混合物を攪拌させる振動板などの、連続するパルス間で細胞
の位置を再調整する機械的手段もまた提供される。これにより、生細胞の透過領
域を拡大することができる。
【０００９】 本発明は、細胞に異なる温度でパルスを印加し、パルス印加後、細胞を異なる
温度で特定の滞留時間内に回復させる手段も提供する。
【００１０】 こうした機能を利用することで、電気穿孔後の細胞の生存性だけでなく、トラ
ンスフェクト効率も高めることができる。
【００１１】 本発明の局面及び他の特徴は、以下の図面、詳細な説明及び特許請求の範囲に
より明らかになろう。
【００１２】 （好適な実施例の説明） 図１は、本発明の一実施例による回転電界を発生させるフロースルーチャンバ
１００内の断面図である。ハウジング１２０は、ハウジング１２０の長さ１２５
方向に延びる細長い内部チャンバ１４０を形成する壁１３０を有する。内部チャ
ンバ１４０の長さ１２５方向に沿って連続もしくは脈動液流を供給するための導
管を形成するため、内部チャンバ１４０には入口１１０及び出口１１５が接続さ
れている。
【００１３】 ２つ以上の電極１５０がハウジング１２０内に配置され、内部チャンバ１４０
と接している。各電極１５０はハウジング１２０外に延びる部分１５５を有する
。この電極１５０の部分１５５はプリント回路基板テンプレート１６０に挿入さ
れるのが好ましく、図に示すようなすり接点等の取り外し可能な電気接点１７０
により保持される。すり接点１７０はフロースルーチャンバ１００の取り外し及
び挿入を簡素化する。フロースルーチャンバ１００は、使い捨てもしくは殺菌の
ため回路基板テンプレート１６０から取り外し可能である。回路基板テンプレー
ト１６０は支持構造１８０により支持されている。電極１５０はこのようにして
回路基板テンプレート１６０内の回路に電気的に接続されている。回路基板テン
プレート１６０は、電気信号発生源１９０に電気的に接続されている。
【００１４】 内部チャンバ１４０内に回転電界を発生させるため、２つ以上の電極１５０が
フロースルーチャンバ１００のハウジング内に配置される。電気穿孔のため回転
電界を生細胞に加えることで、あらかじめ選択した分子の取り込み及び効率を効
果的に増加させることができる。電気穿孔向上のため回転電界を用いる一定の局
面については、米国特許第５７０２３５９号に開示されており、ここに文献とし
て援用する。電極１５０は導電性材料で形成されており、金メッキを施すことも
できる。一実施例において、電極１５０は、図２Ａ及び２Ｃに示すように、直線
状の棒で、ハウジング１２０の長さ１２５方向に、ハウジング１２０の壁１３１
の１つが隣接する壁１３２に接する部分に離間して配設することもできる。ハウ
ジングの壁の数及び形状は、直線状棒電極の数に合わせて変更することができる
。例えば、円筒状のハウジングも可能である。ハウジング１２０の特定の形状を
２つ、図２Ａ及び２Ｃに示す。
【００１５】 図２Ａは、図１に示すフロースルーチャンバに使用される四角形のハウジング
の端面図である。ハウジング１２０は、四角形の細長い内部チャンバ１４０を形
成する４つの壁１３１、１３２、１３３、１３４を有する。４つの直線状電極１
５１、１５２、１５３、１５４はハウジング１２０内に離間して配置されている
。各電極１５１は１つの壁１３１と隣接する壁１３２の間の交差部の長さ方向に
配置される。
【００１６】 四角形のハウジング１２０内の４つの電極１５１、１５２、１５３、１５４は
、それぞれプリント回路基板テンプレート１６０を介して電気信号発生源１９０
に接続されている。電気信号発生源１９０は、電極１５１、１５２、１５３、１
５４間にそれぞれ電界を発生させるために、２つの対向する電極対にパルス状の
電界を供給する。各パルスは図３Ａ、３Ｂに示す３ステップパルスと呼ばれる、
３つのステップからなる波形をしている。電界は、各々の連続する３ステップパ
ルス間で回転させることができるが、３ステップパルスの各インパルスステップ
間では回転させてならない。１つまたは複数のパルス供給後、電気信号発生源１
９０のパルス発生制御器１９７は、四角形のハウジング１２０内の、最初の電極
対から９０度回転させた位置の他の電極対と接続し、パルスを再度発生させる。
こうすることで、連続する電気パルスにより異なる電界構成にすることができ、
最終的には、細長い内部チャンバ１４０内に回転電界を発生させる。
【００１７】 ４つの電極は、図２Ｂに示すように、４つの異なる電界構成にすることができ
る。第１の構成では、電極１５１と１５２が接続され、電極１５３と１５４が接
続される。第２の構成では、第１の構成と同じ電極対が接続されるが、電極に極
性が反対の電荷が供給される。第３の構成では、電極１５１と１５４が接続され
、電極１５２と１５３が接続される。第４の構成では、第３の構成と同じ電極対
が接続されるが、電極に極性が反対の電荷が供給される。電極の接続の変更によ
り電界の構成及び配向が変化し、回転電界が発生する。パルス発生制御器１９７
は電界が自動的に回転するようにプログラムすることもできるし、あるいは手動
で操作することもできる。
【００１８】 図２Ｃは、図１に示すフロースルーチャンバに用いられる六角形のハウジング
の端面図である。ハウジング１２０は六角形の細長い内部チャンバ１４０を形成
する６つの壁１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６を有する。６つ
の直線状電極１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６はハウジング１
２０内に離間して配置されている。６つの電極は図２Ｄに示す６つの異なる電界
構成にすることができる。
【００１９】 生細胞にあらかじめ選択した分子を導入するため、液状細胞サンプル及び選択
した分子を有する液状媒体を混合し、液状細胞分子混合物を得る。この混合物を
次に入口１１０からフロースルーチャンバ１００の内部チャンバ１４０に供給す
る。内部チャンバ１４０内で、混合物内の細胞には、電極１５０から発生された
回転電界が加えられる。
【００２０】 図３Ａ、３Ｂは、あらかじめ選択した分子を細胞に導入するのに用いられる、
例えば収集、電気穿孔、電気泳動といった３ステップパルス処理を示す。各３ス
テップパルスは、それぞれの機能を達成するため特定の幅及び強度を有する３つ
の別々の電気インパルスからなる。図３Ａは、電界３２０内の細胞３１０を示す
。収集ステップにおいて、細胞膜３４０近辺の領域３３０ａ、３３０ｂにおいて
帯電されたあらかじめ選択した分子を収集するため、第１の電気インパルス３３
５が印加される。次に電気穿孔ステップにおいて、細胞膜３４０を透過可能にす
るため、第２の電気インパルス３５５が印加され、一時的な細孔３６０が形成さ
れる。最後に電気泳動ステップにおいて、細胞３１０に一時的な細孔３６０を通
してあらかじめ選択した分子を導入するため、第３の電気インパルス３７５が印
加される。
【００２１】 図３Ｂは、１つの３ステップパルスにおける各電気インンパルスの相対振幅及
び幅を示す。収集インパルス３３５及び電気泳動インパルス３７５の振幅は同一
でもよいが、電気穿孔インパルス３５５の振幅は、他の２つのインパルスの振幅
よりかなり大きくなければならない。電気穿孔インパルス３５５の振幅は、細胞
膜３４０に一時的な細孔３６０を形成するのに十分な大きさである。電気穿孔イ
ンパルス３５５は、１ｃｍ当たり約１００から１００００ボルトの電界を発生す
るのが好ましい。収集ステップ及び電気泳動ステップは膜透過性をさらに高める
作用はないので、収集インパルス３３５及び電気泳動インパルス３７５の振幅は
電気穿孔インパルス３５５の振幅よりかなり小さい。収集インパルス３３５及び
電気泳動インパルス３７５は、それぞれ１ｃｍ当たり約１０から１００ボルトの
電界を発生するのが好ましい。
【００２２】 高振幅インパルス３５５の幅は、他の２つのインパルス３３５、３７５に比較
して短い。これは、生細胞に長時間高振幅インパルス３３５を印加することで、
生細胞に損傷を与え、死滅させてしまう可能性さえあるからである。各パルスの
好ましいパルス幅の範囲は次の通りである。収集インパルス３３５は約０．１ｍ
ｓから約１０００ｍｓ、電気穿孔インパルス３５５は約１μｓから約１０００μ
ｓ、電気泳動インパルス３７５は約０．１ｍｓから約１０００ｍｓである。電気
泳動インパルス３７５のパルス長が長いと、電気泳動現象によりあらかじめ選択
した分子を細孔を通して通過させることができ、各細胞に導入される分子の数を
増加させることができる。こうして、トランスフェクトされる細胞の割合をより
高くすることができる。また、３ステップパルス印加後、回復時間ををより長く
するため、細胞を浴槽内に滞留させることができる。
【００２３】 ある選択した分子は正または負の極性で帯電される。正に帯電された粒子は、
例えばターゲット細胞及び正電極間に当初位置する分子のみが細胞膜３４０付近
の領域３３０ａに移動し、細胞に入ることができる。ターゲット細胞及び負電極
間に当初位置する正に帯電された分子は、電界がこれらの分子を細胞膜３４０か
ら強制的に遠ざける。それゆえ、電気穿孔の効率を高めるため、フロースルーチ
ャンバ内の細胞を機械的なバイブレータにより攪拌することで、ターゲット細胞
の位置を外部電界の方向に関して回転させるため細胞位置を再調整してもよい。
【００２４】 これ以外に、連続する３ステップパルスが異なる配向の電界を発生する、複数
の一連の３ステップパルスを供給することで回転電界を発生してもよい。電界配
向を変化させると回転電界が発生する。これにより、ターゲット細胞のどの側の
分子も、細胞に入ることができ電気穿孔効率を高めることができる。
【００２５】 こうした回転電界は３ステップパルスを特に使用しなくても発生させることが
できる。１インパルスステップのみのパルスも利用することもできる。一連のパ
ルスの電界の配向が変化されるのであれば、複数の一連のパルスで回転電界を発
生させることができる。
【００２６】 複数のパルス、例えばそれぞれ電界の配向が異なる複数の３ステップパルスを
供給することができる。複数のパルスの集合間で電界の配向を変更しても、回転
電界が発生される。
【００２７】 更に、電気穿孔の効率を高めるため、上記の回転電界と機械的なバイブレータ
による細胞位置の再調整を組み合わせて行うこともできる。
【００２８】 フロースルーチャンバ１００は、連続フローモード、または例えば停止して進
むといったバッチモードで動作することができる。連続フローモードにおいては
、液状細胞分子混合物は、回転電界を加えた状態で連続してフロースルーチャン
バに供給される。生体外の実施例においては、患者からの細胞の抽出及び電気穿
孔済細胞の再注入間の時間は、細胞培養を再注入前に行うのであれば、長く設定
することができる。バッチモードにおいては、フロースルーチャンバは液状細胞
分子混合物の最初の注入で充填される。その後、注入を停止し複数の一連の３ス
テップパルスが印加される。次に、フロースルーチャンバは空にされ、液状細胞
分子混合物の２回目の注入で再充填される。
【００２９】 フロースルーチャンバ１００は、図４に示す生体外の実施例による装置システ
ム４００で使用することができる。この装置システム４００は蠕動ポンプ４１０
、注入ポンプ４１２、フロースルーチャンバ１００及び信号発生器１９０からな
る。この装置４００は更に、液体が図４に矢印で示す方向に流れるようにする、
Ｔ字継手４３４とともに適切なチューブで形成された液体導管セグメント４２４
、４２６、４２８、４３０、４３２からなる。液体導管セグメント４２４は患者
から（例えば、差し込み可能なカテーテルなどを用いて）抽出された細胞サンプ
ルを蠕動ポンプ４１０へ送る。細胞サンプルは、患者から直接抽出してもよいし
、一定期間培養し処理したものでもよい。どのようにして得られたものであれ、
細胞サンプルは注入ポンプ４１２からの液状媒体と混合され混合物となり、電気
穿孔のため液体導管セグメント４３０経由でフロースルーチャンバ１００に送ら
れる。フロースルーチャンバ１００に接続された液体導管セグメント４３２は、
差し込み可能なカテーテルなどを用いて、電気穿孔済混合物を患者へ再注入する
のに用いられる。この装置４００は、信号発生器１９０及びフロースルーチャン
バ１００を接続する、一組の電気ケーブル４３６及び４３８を有する。
【００３０】 注入ポンプ４１２は、遺伝子または薬物といった、あらかじめ選択した高分子
を担ぶ液状媒体を一定量保持するための注射器４４０を使用する従来のものでよ
い。注射器４４０のプランジャは、モータ駆動ピストン器４４２により、患者の
体内に押し込まれる。注射器４４０から液体導管セグメント４２６経由で送られ
る液状媒体の送出率は、制御ダイアル４４４で調節可能であり、送出パラメータ
はディスプレイ４４６に表示される。
【００３１】 蠕動ポンプ４１０は、従来の蠕動ポンプにより駆動可能であり、送出率を調節
する制御手段を有する。蠕動ポンプ４１０は、患者４２２の体外の液状細胞サン
プルを活発に循環的に送り出す。蠕動ポンプ４１０は、液状細胞サンプルが注入
ポンプ４１２からの液状媒体と混合するＴ字継手４３４へ液状細胞サンプルを送
り出す、交換可能なチューブセグメント４４８を有する。この液状媒体は食塩水
といった適切な液状溶媒に懸濁された薬物でもよい。患者の細胞に遺伝子を導入
する場合、液状媒体は、患者の細胞に導入されるまで遺伝子の生存を維持するの
に適切な液状媒体に懸濁された遺伝子を含む。こうした液状媒体は当業者に周知
である。
【００３２】 フロースルーチャンバ１００の詳細を図１、２Ａ及び２Ｃに示す。信号発生器
１９０からの電気ケーブル４３６及び４３８はフロースルーチャンバ１００に取
り外し可能に接続されるプラグを有する。このケーブルはフロースルーチャンバ
１００と電極１５０とを電気的に接続する。
【００３３】 電気信号発生器１９０の主要な機能は、パルスがフロースルーチャンバ１００
の電極１５０に供給されたときに、チャンバ内を流れる液状細胞サンプル及び液
状媒体の混合物に所定の振幅及び幅で電界を加える、所定の電気信号を発生する
ことである。
【００３４】 細胞を電界内に置くと、電位が細胞膜全体に誘導される。球形の細胞の場合、
電界で誘導される膜電位は、 Ｖｍ＝１．５ＲＥｃｏｓθ であり、ここでＲは細胞の半径、Ｅは外部電界強度、及びθは特定位置における
膜の法線ベクトルと外部電界配向との間の角度である。これについては、ここに
文献として援用する米国特許第４８２２４７０号を参照のこと。
【００３５】 膜内に誘導される電界はおおよそ以下の式で表される。
【００３６】 Ｅｍ＝Ｖｍ／ｄ＝１．５（Ｒ／ｄ）Ｅｃｏｓθ ここで、ｄは膜の厚みでありＲより小さい。膜内の電界は膜に強い力を及ぼす
ため細孔が形成される。電界で形成される細孔は可逆的で、例えば核酸といった
分子の導入が可能であり、加える電界強度を適切に選択することで多くの細胞が
生存可能になる。
【００３７】 これらの電界は３ステップ方法で加えられ、電界の分極は所定の順序で回転す
るのが好ましい。電極対が電気的に接続され、対向する電極対に対してパルスを
供給すると、特定配向の電界が発生する。１つまたは複数のパルス供給後、パル
ス発生制御器１９７は他の電極対を接続し再度パルスを供給する。これにより第
１の電界とは異なる配向の電界が発生する。
【００３８】 本発明の方法を実行するパルス発生器はすでに数年前から発売されている。そ
の信号発生器の１つが、米国カリフォルニア州サンディゴのＧｅｎｅｔｒｏｎｉ
ｃｓ社の一部門であるＢＴＸ社から入手可能なＥＬＥＣＴＲＯ ＣＥＬＬ ＭＡ
ＮＩＰＵＬＡＴＯＲ Ｍｏｄｅｌ ＥＣＭ ６００である。ＥＣＭ ６００信号
発生器は、コンデンサの完全な放電によりパルスを発生し、指数関数的に減衰す
る波形となる。この信号発生器により発生された電気信号は、短い立ち上がり時
間と指数関数的に減衰する立ち下がり波形とを特徴とする。ＥＣＭ ６００信号
発生器においては、電気穿孔パルス長は、Ｒ１からＲ１０の１０個のタイミング
抵抗器を１つ選択することで設定される。これらは、約５０μＦ固定のキャパシ
タンスを有する高電圧モード（ＨＶＭ）及び約２５〜約３１７５μＦの範囲のキ
ャパシタンスを有する低電圧モード（ＬＶＭ）の双方で作動する。
【００３９】 細胞膜全体に電界を加えることで、電気穿孔法で重要な一時的な細孔が形成さ
れる。ＥＣＭ ６００信号発生器は電極の間（単位はｃｍ）を伝播される電圧（
単位はｋＶ）を供給する。この電位差は、Ｅ＝ｋＶ／ｃｍの電界強度と呼ばれる
強度を定義する。各細胞は、最適な電気穿孔のため独自の臨界電界強度を有する
。これは、細胞の大きさ、膜組織及び細胞壁そのものの個々の特徴に起因する。
例えば、哺乳類の細胞は、細胞死及び／または電気穿孔が起こるのに一般的に０
．５〜５．０ｋＶ／ｃｍを必要とする。必要な電界強度は、細胞の大きさに反比
例して変化するのが普通である。
【００４０】 ＥＣＭ ６００信号発生器は、内部コンデンサに供給される設定した充電電圧
の振幅を、ＬＶＭにおいて５０〜５００Ｖ、ＨＶＭにおいて０．０５〜２．５ｋ
Ｖの間で調整できる調節つまみを有する。電気信号の最大振幅は、ＥＣＭ ６０
０信号発生器のディスプレイに表示される。この装置は、更に、出力に平行に接
続された抵抗と、並列接続された７つの選択可能な追加コンデンサとを同時に組
み合わせることにより、ＬＶＭモードにおいてパルス長を制御する複数の押しボ
タンスイッチを有する。
【００４１】 ＥＣＭ ６００信号発生器は更に自動充電及びパルス押しボタンを１つ有する
。このボタンを押すことで、内部コンデンサを設定した電圧に充電し、５秒以下
の自動サイクルにおいて外部電極にパルスを供給する。所定の電界を連続して加
えるためめ、手動ボタンを連続して押してもよい。
【００４２】 電源装置内の発生器により供給される電圧パルスの波形は異なっていてもよい
。応用によっては、図３Ｂに示すような矩形波列を用いることが好ましい。図３
Ｃから図３Ｆは、いくつかの他の使用可能な波形例を示しており、これには、例
えば指数関数的に減衰するパルス列、単極発振パルス列、または双極発振パルス
列が含まれるがそれに限定されない。さらに、３ステップパルスシーケンスは、
異なるステップにおいて別のパルス波形にすることもできる。
【００４３】 電気インパルスの電界強度は、電圧を電極間の距離（単位はｃｍ）で割って求
められる。例えば、１／２ｃｍ離れた２つの電極表面間の電圧が５００Ｖである
場合、電界強度は５００（１／２）または１０００Ｖ／ｃｍまたは１ｋＶ／ｃｍ
である。
【００４４】 波形、電界強度及びパルス幅はパルス供給装置の正確な構造及び電気穿孔処理
に用いられる細胞の種類によって異なる。当業者であれば周知の方法を用いて変
換効率及び細胞生存率を測定することにより、本発明の方法で用いる適切なパル
ス数を容易に決定できるだろう。
【００４５】 ３ステップパルスが好ましい電気パルスは、細胞がいかなる温度にあっても供
給することができ、一般に電気パルスは細胞が約２℃〜３９℃の温度範囲にある
ときに供給される。しかし電気パルスは細胞が約２℃〜１０℃の温度の間で供給
するのが好ましい。単一の３ステップパルスシーケンス間は温度が変更されない
。むしろ、温度変化が求められる場合、１つの３ステップパルスシーケンスが完
了し次の３ステップパルスシーケンスを開始する前に温度が変更される。電気パ
ルス供給後、細胞を一定期間培養することができる。細胞は約３７℃の温度で培
養するのが好ましい。
【００４６】 図５は、流体導管５３０に複数の温水浴が接続された蠕動ポンプ５１０及びフ
ロースルーチャンバ１００組み合わせからなる他の実施例を示す。蠕動ポンプ５
１０は入力チューブ５３０用のロータアッセンブリ５１５を有する。コントロー
ルパネル５１２は、特定方向の吸入開始停止及び吸入速度及び時間を含む、ポン
プ５１０の各種パラメータの選択及び制御手段を有する。ポンプ５１０には更に
特定の選択されたパラメータまたは動作状態を表示する、ディスプレイパネル５
１４を有する。フロースルーチャンバ１００の一実施例を図１、２Ａ及び２Ｃに
示す。フロースルーチャンバ１００は回転電界を発生させる複数の電気パルスを
供給する。各パルス供給後、細胞及び分子混合物は特定の温水浴５４０に送り込
まれる。この装置は様々な温度で混合物にパルスを印加する手段を有し、パルス
印加後、混合物を異なる温水浴に滞留させることができる。
【００４７】 図６は、各パルス発生イベント後のある好ましい温度変更処理を示す図である
。パルス発生イベントは単一の３ステップパルスまたは一連の３ステップパルス
でもよい。第１のパルス発生イベント６１０がフロースルーチャンバ１００で発
生する。混合物は、細胞を回復させるために、チューブ５３０を経由して第１の
温水浴５４１へ送り込まれる。第２のパルス発生イベント後、混合物は第２の回
復のため、第２温水度浴槽５４２へ送り込まれる。第３温水浴５４３以降は、使
用する特定の処理手順に応じて細胞培養または他の動作に用いることができる。
【００４８】 以下の実施例は例示であり、本発明を制限するものではない。以下のものは使
用可能な代表的なものであるが、当業者に周知の他の処理で代替することができ
る。人間の赤血球の電気穿孔に用いる一処理例を示す。第１のパルス発生イベン
トは４℃で行われた。発生した電界強度は１ｃｍあたり約２５００Ｖであり、パ
ルス発生イベントは約０．３ミリ秒持続した。細胞は約５分間、約４℃で回復し
た。第２のパルス発生イベントは約３７℃で行われた。発生した電界強度は１ｃ
ｍあたり約１８７５Ｖであり、パルス発生イベントは約０．３ミリ秒持続した。
細胞は約１０分間、約３７℃で回復した。電気穿孔済細胞は約４℃の他の浴槽で
集められた。
【００４９】 図７は、フロースルーチャンバ１００が振動板７１０に装着される他の実施例
を示す。振動板７１０は、フロースルーチャンバ１００を振動させ、連続パルス
、例えば連続する３ステップパルス間で、細胞分子混合物を機械的に攪拌させる
。これにより細胞の位置が再調整され、電気穿孔効率を高めるため、透過可能な
領域を潜在的に増大させることができる。振動の大きさ及び時間は、振動板７１
０に連結された制御手段７１５で調節可能である。振動の大きさは、電極に対す
る細胞の位置をわずかに回転させるのに十分大きくなければならない。
【００５０】 本発明のいくつかの実施例を説明してきたが、以下の特許請求の範囲に規定す
る本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変更及び改良を行うことが
できることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 回転電界を発生させる同軸フロースルーチャンバの断面を示す概略図である。
【図２】 図２Ａは、図１に示すフロースルーチャンバで利用される四角形のハウジング
の端面を示す概略図、図２Ｂは、図２Ａに示す四角形のハウジングを有するフロ
ースルーチャンバで発生可能な４つの電界構成を示す図、図２Ｃは、図１に示す
フロースルーチャンバで利用される六角形のハウジングの端面を示す概略図、図
２Ｄは、図２Ｃに示す六角形のハウジングを有するフロースルーチャンバで発生
可能な６つの電界構成を示す図である。
【図３】 図３Ａは、細胞にあらかじめ選択した分子を導入させる、例えば収集、電気穿
孔及び電気泳動からなる３ステップ処理を実行する、電界Ｅ内の細胞を示す図、
図３Ｂは図３Ａに示す３ステップ処理の比較電気パルス振幅及び幅を示す図、及
び図３Ｃから図３Ｆはいくつかの３ステップパルス波形を示す図である。
【図４】 生体外で電気穿孔をするための細胞内薬物及び遺伝子輸送装置の好適な実施例
を示す図である。
【図５】 各種温水浴を有するポンプ及びフロースルーチャンバ構成要素の他の実施例を
示す斜視図である。
【図６】 図５に示す実施例の装置の動作中の状態を示す詳細な概略図である。
【図７】 ポンプ及び振動板に装着されたフロースルーチャンバの他の実施例を示す斜視
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA19 CA01 CA11 DA02 GA14 HA17 4B029 AA24 BB11 CC01 4C084 AA13 AA30

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生細胞への分子の導入方法であって、 第１の特定の温度に維持されている細胞分子混合物を形成するため、生細胞を
    選択した分子と接触させ、 前記細胞の細胞膜において前記選択した分子を収集するため前記細胞分子混合
    物に第１の電気インパルスを印加し、 前記細胞膜に一時的な透過性を与えるため前記第１の電気インパルスの印加後
    に前記細胞分子混合物に第２の電気インパルスを印加し、 前記細胞膜を通して前記細胞内に前記選択した分子の一部を移動させるため前
    記第２の電気インパルスの印加後に前記細胞分子混合物に第３の電気インパルス
    を印加し、 前記第１、第２及び第３の電気インパルスが１つの３ステップパルスを形成し
    、前記３ステップパルスが前記細胞分子混合物に対し、回転電界を発生するため
    に異なる配向の電界を加えて連続的に印加することを特徴とする、生細胞への分
    子の導入方法。
  2. 【請求項２】 前記細胞分子混合物を機械的に攪拌することで、前記細胞へ
    の連続する３ステップパルスの印加後、前記細胞の位置を再調整する、請求項１
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記各ステップが、生体外で実行されることを特徴とする、
    請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記第１及び第３の電気インパルスの幅が、それぞれ約０．
    １〜約１０００ミリ秒であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記第２電気インパルスの幅が、約１〜約１０００μ秒であ
    ることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記第１及び第３の電気インパルスが、それぞれ１ｃｍ当た
    り約１０〜１０００Ｖの電界を発生させることを特徴とする、請求項１記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 前記第２の電気インパルスが、１ｃｍ当たり約１００〜１０
    ０００Ｖの電界を発生させることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記第１、第２及び第３の電気インパルスが、矩形波パルス
    列、指数関数的に減衰するパルス列、単極発振波パルス列、または双極発振波パ
    ルス列からなることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 患者の生細胞へ分子を導入するための連続フロー方法であっ
    て、 入口と出口、及び前記入口と出口間に特定の構成で離間して配置された２つ以
    上の電極を有する細長いフロースルーチャンバを設け、 患者から細胞サンプルを抽出し、 前記液状の細胞サンプルを前記電極間の前記フロースルーチャンバを通過させ
    た後に、前記細胞サンプルを前記患者に戻し、 前記細胞サンプルを患者から抽出した後及び前記細胞サンプルが前記フロース
    ルーチャンバ内を通過する前に、あらかじめ選択した分子を運ぶ所定量の液状媒
    体を前記細胞サンプルに注入し、前記液状媒体と前記細胞サンプルとの混合物を
    生成し、 前記混合物を第１の特定温度で維持し、 所定の振幅及び幅の電界を前記液状媒体と前記細胞サンプルの前記混合物流に
    加えるために、所定の電気信号または一連の電気信号を前記電極に供給すること
    でパルス発生イベントを実行し、 前記混合物を第２の特定温度で維持し、 別のパルス発生イベントを繰り返し供給し、 前記混合物を他の特定温度で維持する、 ことを特徴とする、患者の生細胞へ分子を導入するための連続フロー方法。
  10. 【請求項１０】 少なくとも前記第１、第２及び他の特定温度のうち、２つ
    の温度が異なることを特徴とする、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 入口、及び前記入口と出口間に特定の構成で離間して配置
    された２つ以上の電極を有する細長いフロースルーチャンバを設け、 患者から細胞サンプルを抽出し、 前記液状の細胞サンプルを前記電極間の前記フロースルーチャンバを通過させ
    た後に、前記細胞サンプルを前記患者に戻し、 前記細胞サンプルを患者から抽出した後及び前記細胞サンプルが前記フロース
    ルーチャンバ内を通過する前に、あらかじめ選択した分子を運ぶ所定量の液状媒
    体を前記細胞サンプルに注入して、前記液状媒体と前記細胞サンプルとの混合物
    を生成し、 前記混合物を第１の特定温度で維持し、 所定の振幅及び幅の電界を第１の配向で発生し、前記液状媒体と前記細胞サン
    プルの前記混合物流に加えるために、所定の電気パルスまたは一連の電気パルス
    を前記電極に供給し、 前記混合物に回転電界を発生するために、前記電極への異なる電界配向の所定
    の電気パルスまたは一連の電気パルスの供給を繰り返す、 、患者の生細胞へ分子を導入するための連続フロー方法。
  12. 【請求項１２】 各パルスが、第１の電気インパルス、第２の電気インパル
    ス、及び第３の電気インパルスの連続からなる３ステップパルスであることを特
    徴とする、請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記第１及び第２の電気インパルスの幅が、それぞれ約０
    ．１〜１０００ミリ秒であることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記第２の電気インパルスの幅が、約１〜１０００μ秒で
    あることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記第１及び第２の電気インパルスが、それぞれ１ｃｍ当
    たり約１０〜１０００Ｖの電界を発生させることを特徴とする、請求項１２記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】 前記第２の電気インパルスが、１ｃｍ当たり約１００〜１
    ００００Ｖの電界を発生させることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記第１、第２及び第３の電気インパルスが、矩形波パル
    ス列、指数関数的に減衰するパルス列、単極発振波パルス列、または双極発振波
    パルス列からなることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記電極が直線状であることを特徴とする、請求項１１記
    載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記フロースルーチャンバが、四角形構造内に４つの直線
    状電極を有することを特徴とする、請求項１１記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記フロースルーチャンバが、六角形構造内に６つの直線
    状電極を有することを特徴とする、請求項１１記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記フロースルーチャンバが円形断面を有し、少なくとも
    ２つ以上の前記電極が互いに円形状に配置されることを特徴とする、請求項１１
    記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記フロースルーチャンバを機械的に振動させることで、
    前記混合物内の前記生細胞の位置を連続するパルス間で再調整することを特徴と
    する、請求項１１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記フロースルーチャンバが、前記電極に電気信号を供給
    するため、プリント回路基板テンプレートの取り外し可能な接点を用いることを
    特徴とする、請求項１１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 患者の生細胞へ分子を導入する方法であって、 入口と出口、及び液体がその間を通過するよう前記入口と出口間に特定の構成
    で離間して配置される２つ以上の電極を有する細長いフロースルーチャンバを設
    け、 患者から細胞サンプルを抽出し、 前記細胞サンプルを患者から抽出した後、あらかじめ選択した分子を運ぶ所定
    量の液状媒体を液状の前記細胞サンプルに注入して、細胞分子混合物を生成し、 前記細胞分子混合物を前記電極間の前記フロースルーチャンバに充填し、 前記混合物を第１の特定温度で維持し、 所定の振幅及び幅の電界を発生し、前記細胞分子混合物流に印加するために、
    パルスの印加が第１の方向の電界を発生させる第１のパルス発生イベントを形成
    する、所定の振幅及び幅の電気パルスまたは一連の電気パルスを前記電極に供給
    し、 連続するパルス発生イベントは第１のパルス発生イベントとは異なる電界配向
    を有する、連続するパルス発生イベントを発生して、これにより回転電界を発生
    し、 前記フロースルーチャンバを空にし、 前記フロースルーチャンバに他の前記細胞分子混合物を続いて充填する、 患者の生細胞へ分子を導入するための方法。
  25. 【請求項２５】 患者の生細胞へ分子を導入するための装置であって、 液体導管を形成する入口と出口とを有する細長いフロースルーチャンバを含む
    ハウジングと、 回転電界を発生するため特定の構成で離間して前記ハウジング内に配置され、
    液体がその間を流れるよう前記入口及び前記出口間に配置される２つ以上の電極
    と、 患者から細胞サンプルを抽出する手段と、 前記液状の細胞サンプルを前記電極間の前記フロースルーチャンバを通過させ
    、前記患者に前記細胞サンプルを戻す手段と、 前記細胞サンプルが前記患者から抽出された後及び前記細胞サンプルが前記フ
    ロースルーチャンバ内を通過する前に、あらかじめ選択された分子を運ぶ所定量
    の液状媒体を前記細胞サンプルに注入する手段と、 前記細胞サンプル内のあらかじめ選択された細胞の壁を一時的に透過可能にす
    ることで細胞を死滅させることなく選択された細胞に分子を導入する、前記液状
    細胞サンプルと液状媒体の混合物に異なる電界配向の複数の一連の電気パルスを
    供給するため、前記電極に電気エネルギーを供給するため接続された信号源と、 を有する、患者の生細胞に分子を導入する装置。
  26. 【請求項２６】 前記電極が、前記ハウジングに沿って各コーナに配置され
    た直線状の棒であることを特徴とする、請求項２５記載の装置。
  27. 【請求項２７】 前記フロースルーチャンバが、四角形構造内に４つの異な
    る電界配向を発生させる４つの電極を有することを特徴とする、請求項２５記載
    の装置。
  28. 【請求項２８】 前記フロースルーチャンバが、六角構造内に６つの異なる
    電界配向を発生させる６つの電極を有することを特徴とする、請求項２５記載の
    装置。
  29. 【請求項２９】 前記フロースルーチャンバが円形の断面を有し、２つ以上
    の電極が互いに円形状に配置されることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記ハウスに結合され、連続する電気パルス間で前記細胞
    を機械的に攪拌して、前記細胞の位置の再調整するように構成された、機械的振
    動要素を更に有することを特徴とする、請求項２５記載の装置。
  31. 【請求項３１】 前記機械的振動要素が、前記フロースルーチャンバに装着
    される振動板を有することを特徴とする、請求項３０記載の装置。
  32. 【請求項３２】 前記電極が、前記電極と前記信号源間を電気的に接触させ
    る、プリント回路基板テンプレートに着脱可能に装着されることを特徴とする、
    請求項２５記載の装置。
  33. 【請求項３３】 細胞に異なる温度でパルスを印加し、パルス印加後、前記
    細胞を他の温度で特定の滞留時間内で回復させる、複数の温水浴を更に有するこ
    とを特徴とする、請求項２５記載の装置。
  34. 【請求項３４】 生細胞に一時的な細孔を形成する装置であって、 入口と出口とを有するチャンバを含むハウジングと、 前記チャンバ内で回転電界を発生するため、前記ハウス内に配置された複数の
    電極と、 前記ハウジングの前記入口にあらかじめ選択した分子と液状の細胞サンプルを
    運ぶ液状媒体の混合物を導入する手段と、 前記液状の細胞サンプル内のあらかじめ選択された細胞の壁を一時的に透過可
    能にし、細胞を死滅させることなく前記選択された細胞に特定の分子を導入可能
    にするために、所定の振幅及び幅の電気信号を前記電極に供給し、前記液状媒体
    及び前記液状細胞サンプルの前記混合物に所定の振幅及び幅の回転電界を連続的
    に加える手段と、 を有する、生細胞に一時的な細孔を開ける装置。
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