JPH10507364A - 通流エレクトロポレーション装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 患者の生血液細胞内に分子を搬入させるための液体通流装置であって、両端に入口と出口を有した長形通流チャンバーを含んだ収容体と、それら入口と出口との間に配置された一対の長形平行電極と、患者から血液を抜き出し、両電極間で通流チャンバー内を通過させ、再び患者に戻すポンプ付き連続式分流器と、所定の分子を運搬する所定量の媒液を、血液が患者から抜き出された後で通流チャンバーに通過させる前にその血液内に注入する装置と、所定の振幅と持続時間を有した所定の電気信号をそれら電極に適用し、所定の強度と持続時間を有した電界を発生させて血液と媒液の混合物に反復的に適用させ、血液内の所定の細胞の細胞壁を一時的に透過性とし、それら細胞を死滅させることなく細胞内に分子を搬入させるための電源とを含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】 通流エレクトロポレーション装置及び方法 技術分野 本発明は人間及び他の哺乳類の病気の治療に関する。さらに特定すれば、本発 明は患者の生細胞内に薬剤（pharmaceutical compounds）及び遺伝子（genes） を搬入するために連続的液流を提供する装置並びに方法に関する。 背景技術 特定の薬剤を使用し、体内の特定細胞を標的にして治療を施すことが望ましい ことは既に知られている。しかし、例えば化学療法による癌の治療においては、 正常細胞をできるだけ死滅させずに癌細胞を死滅させるように配慮しながら多量 の薬物を投与することが必要である。化学療法で使用する薬物を癌細胞内に直接 的に注入できるなら、この目的は達成されるであろう。しかし、例えばブレオマ イシン（bleomycin）等の最良な抗癌剤のいくらかは特定の癌細胞の細胞膜内に 浸透できない。 同様に、特定の病気は患者の特定細胞内に望む遺伝子を侵入させることで治療 が可能である。現在のところ、たいていの遺伝子療法の実験では、遺伝子の細胞 内への運搬体（carrier）としてレトロウィルス（retrovirus）を利用してきた 。 だが、レトロウィルスが標的細胞に侵入したとき、ゲノム（genome）内で基本 的にはランダムに同化(integrate)し、その搬入の事実のみで突然変異的なダメ ージ(mutational damage)を与える可能性が存在する。もしそのウィルスが腫瘍 要素（oncogeny）に隣接して変異すれば、標的細胞の悪性変異が生じかねない。 これら欠点の多くは遺伝子転移(gene transfer)のためのエレクトロポレーシ ョン（electroporation）を利用することで軽減が可能である。 遺伝子や、薬剤等の他の分子(molecule)及び高分子（macromolecule）はエレ クトロポレーションとして知られる手法によって生細胞内への搬入が可能である ことは周知である。遺伝子や他の分子及び高分子は緩衝媒質(buffer medium)内 で生細胞と混合され、その混合物に対して高電界の短パルスが適用される。高電 界パルスは細胞膜を一時的に多孔質（porous）とし、遺伝子あるいは高分子を細 胞内に浸透させる。パルスは細胞のゲノムを改質させることができる。エレクト ロポレーション処理された遺伝子が相同宿主遺伝子（homologous host gene）と 組換(recombine)が可能なことはほぼ証明されている。このことに関する従来技 術の例には、チャン(Chang)に付与された米国特許第４，９７０，１５４号、カ ルビン（Calvin）に付与された米国特許第５，０９８，８４３号、及びバエル（ Baer）に付与された米国特許第５，１２８，２５７号がある。 エレクトロポレーションを利用した赤血球内への薬物の搬入並びにエレクトロ ポレーションによる白血球内への遺伝子の搬入は両方とも可能であることが証明 されている。エレクトロポレーションによる全血液(whole blood)の白血球内へ の遺伝子の選択的な搬入も可能であることは証明されている。静電界（static f ield）内でのベンチュリ管を利用した通流システムでの細胞のエレクトロポレー ションはカルビンによって米国特許第５，０９８，８４３号において提案されて いる。 しかしながら、生体患者の血管を介したエレクトロポレーションによる体外式 （ex vivo）細胞内(intra cellular)薬物及び遺伝子運搬を可能にする装置及び 方法は未だ提供されていない。そのような装置と方法の提供は望ましいであろう 。なぜなら、リンパ球を遺伝学的に改質させることで生体患者の遺伝子治療が可 能となるからである。このような装置及び方法は、赤血球内へ被嚢処理(encapsu late)することで生体の選択された組織及び器官に薬物を運搬する技術の提供に も有益であろう。一般的にこのような装置と方法とは、生体患者内への抗体、タ ンパク質、あるいは他の高分子の運搬手段の提供に優れた利点を提供するであろ う。 発明の開示 従って、本発明の主要な目的は、改良型通流エレクトロポレーション装置を提 供することである。 本発明の別な主要目的は、エレクトロポレーションによる体外式細胞内薬物及 び遺伝子運搬装置の提供である。本発明のさらに別な目的は、生体患者に対する エレクトロポレーションによる体外式細胞内薬物及び遺伝子運搬方法の提供であ る。本発明は遺伝子及び薬剤のごとき高分子の患者の生血液細胞内への搬入に利 用する装置並びに方法を提供する。この装置は長形のエレクトロポレーション部 を備えた使い捨てチャンバー(chamber)を有した改良収容構造を含んでいる。一 対のカテーテル（catheter）が患者に挿入され、患者の血液を抜き出して体内へ と戻す。蠕動ポンプ（peristaltic pump）を利用して血液が取り出されたなら、 所定の高分子を運搬する所定量の媒液がその血液内に注入される。その後に、一 対の長形で間隔が開けられて平行に設置された電極を有した通流チャンバー内の 血液と媒液のこの混合物に電界が反復的に適用される。この反復電界は細胞を殺 傷することなく高分子をそれらの細胞に侵入させることができるように所定の細 胞の細胞壁を一時的に透過性とするような所定の振幅（amplitude）と持続時間 （duration）とを有したものである。その後に、血液と媒液の混合物は患者体内 に戻される。この電界は信号発生器を利用してこれら電極に所定の電気信号を適 用することで発生される。 患者の生血球内に分子を侵入させるための通流装置は、その両端に入口と出口 とを有した長形の通流チャンバーを含んだ収容手段と、液体をその間に通過させ るようにそれら入口と出口との間に配置された一対の長形平行電極と、患者から 血液を抜き出し、前記の電極間で通流チャンバーを通過させ、さらに患者に戻す 連続式分流手段（flow shunt means）と、所定の分子を搬送する所定量の媒液を 血液を患者から抜き取った後であって、通流チャンバーを通過させる前にその血 液内に注入する手段と、所定の振幅と持続時間とを有した所定の電気信号をそれ ら電極に適用して血液内の所定の血液細胞の壁を一時的に透過性とすべく、所定 の振幅と持続時間とを有した電界パルスを発生させて血液と媒液との混合物に反 復的に適用し、細胞を殺傷することなく所定の細胞に分子を侵入させる手段とを 含んでいる。 図面の簡単な説明 図１は、エレクトロポレーションによる体外式細胞内薬物及び遺伝子運搬装置 の好適実施例を図示している。 図２は、図１に示す本発明の実施例に利用される共軸通流チャンバーの断面図 である。 図３は、図１に示す実施例に利用可能なクヴェット型通流チャンバーの斜視図 である。 図４は、本システムのポンプ及びチャンバー要素の別実施例を示す斜視図であ る。 図５は、図４の実施例のチャンバーの詳細を示す分解図である。 図６は、チャンバー保持体内に設置された状態の、一部を切り欠いた図５の組 み立てチャンバーを示す斜視図である。 図７は、構造の詳細を図示するために一部を切り欠いた図６の保持体の側面図 である。 図８は、詳細を示すために一部を断面で示した図７の実施例の平面図である。 発明を実施するための最良態様 図１には本発明の好適実施例が図示されている。この装置は、蠕動ポンプ（pe ristaltic pump）１０と、注入ポンプ１２と、通流チャンバーユニット１４と、 信号発生器１６とを含んでいる。この装置はさらに、患者２２の腕の静脈から血 液を抜き取って体内に戻すための略図で示された一対の挿入可能なカテーテル１ ８と２０の形態の分流手段を含んでいる。この装置はさらに、図１の矢印で示す 方向にそれらポンプ１０と１２、通流チャンバーユニット１４、及びカテーテル １８と２０の間で液を流すため、Ｔ形状結続器３４と共に適当なＩＶ型チューブ 機構の要素であるチューブ部材２４、２６、２８、３０及び３２を含んでいる。 この装置はまたさらに、信号発生器１６と通流チャンバーユニット１４とを接 続するための一対の電気ケーブル３６と３８とを含んでいる。 注入ポンプ１２は、遺伝子や薬剤等の所定の高分子を搬送するための媒液を保 持する注入器４０を利用した通常タイプのものでよい。注入器４０のプランジャ ーはモーター駆動式ピストン構造体４２によって内側に押される。注入器４０か らチューブ部材２６への媒液の運搬流量は制御ダイヤル４４で手動調整すること が可能である。この際の運搬パラメータは表示器４６に示されている。 蠕動ポンプ１０は通常デザインのものであり、ポンプの作動を調節するための 制御器（図示せず）を有している。蠕動ポンプ１０は患者２２の体外の血液を強 制循環させる。このポンプ１０は円筒収容器５０を囲む取り替えチューブ部材４ ８を含んでいる。モーター駆動式ローター（図示されていない）はチューブ部材 ４８とエンゲージしており、チューブ部材４８内部を通過させて血液をＴ形状結 続器３４へと送り、そこで注入ポンプ１２からの媒液と混合させる。この媒液は 生理塩水等の適当な液体運搬体（vehicle）内に懸濁（suspend）された薬剤であ ってもよい。遺伝子を患者の血液細胞内に導入するときには、媒液は、患者の血 液細胞内に注入されるまで遺伝子の活性を保つような適当な媒液に懸濁された遺 伝子を含む。このような媒液はこの分野の技術者にはよく知られている。 通流チャンバーユニット１４は長形通流チャンバー５４を収納する方形収容体 ５２を含んでいる。この通流チャンバー５４の詳細は図２に示されている。これ は、対面状態の平行電極面を定義する円筒容器５８と、それに同心的に提供され た円筒形導電ロッド５６の形態である一対の均等に間隔が開けられた長形電極を 含んでいる。好適には、ロッド５６と容器５８とはステンレススチール製であり 、望むならば金メッキを施すこともできる。ロッド５６と容器５８の両端部には 絶縁性プラスチック材料で成る中空ブロック６０と６２とがそれぞれ提供されて おり、耐高温エラストマー製Ｏ−リング６４で封止されている。これらＯ−リン グ６４はブロック６０と６２の内側に提供されている。好適には、これらＯ−リ ング６４は商標ＶＩＴＯＮを付したもののごとき耐熱性材料で製作されており、 通流チャンバー５４はオートクレーブでの殺菌が可能である。 ブロック６０と６２とにはロッド５６と容器５８の両端部を受領するための円 筒穴が提供されている。ブロック６０は入口ポート６６を、ブロック６２は出口ポ ート６８を有しており、血液と媒液との混合物は図２の矢印によって示される方 向に電極間（５６と５８）にて通流チャンバー５４を通過することができる。ナ ット７０と７２（図１）はそこにチューブ部材７４と７６とをそれぞれ結続させ るために入口ポート６６と出口ポート６８のそれぞれのネジ溝壁内にネジ固定さ れている。チューブ部材７４と７６は収容体５２内で延びており、収容体５２の 前方パネルに搭載されたナット７８と８０とにそれぞれ接続されている。チュー ブ部材３０と３２とはそれぞれナット７８と８０とに接続されている。 信号発生器１６から延びる電気ケーブル３６と３８（図１）は、通流チャンバ ーユニット１４の収容体５２の前方パネル上のジャック８２と８４とに引き抜き 自由に接続されている。これらのジャック８２と８４とはさらにワイヤ８６と８ ８とに接続されている。これらワイヤ８６と８８とは通流チャンバー５４の一方 の電極としてネジシャフト／ナット構造体９０あるいは９２（図２）に、さらに 、他方の電極として容器５８周囲のクランプに接続されている。構造体９０はロ ッド電極５６に対して電気的接続を提供し、構造体９２は容器電極５８に対して 電気的接続を提供する。 以下において信号発生器１６（図１）の詳細を解説することにする。信号発生 器１６の機能は所定の電気信号を発生させることである。この信号は通流チャン バー５４の電極５６と５８とに適用されたとき、所定の振幅と持続時間とを有し た電界を通過する血液と媒液の混合物に適用する。好適には、この電界は反復的 に適用され、所定の血液細胞壁を充分に透過性とし、血液細胞を殺傷することな く高分子を所定の血液細胞内に浸透させるものである。 信号発生器１６の好適な１例は米国カルフォルニア州サンディエゴ市のジェネ トロニクスインク社から商業的に入手可能な”ＥＬＥＣＴＲＯ ＣＥＬＬ ＭＡ ＮＩＰＵＬＡＴＯＲ Ｍｏｄｅｌ ＥＣＭ ６００Ｒ”である。このＥＣＭ ６ ００Ｒ信号発生器はキャパシタの完全放電によりパルスを発生させ、指数関数的 （exponentially）に衰退する波形を提供する。ＥＣＭ６００Ｒ信号発生器によ って発生された電気信号は迅速な上昇時間（fast rise time）と指数関数的な尾 部（tail）とをその特徴としている。 このＥＣＭ ６００Ｒ信号発生器で望むパルス長を達成するにはいくつかの可 変要因（変数）が考慮される。これらには使用されるバッファタイプ、電圧とタ イミングモード、充填容量（fill volume）及びチャンバータイプとが含まれる 。 チャンバー抵抗は媒液のタイプによって決定される。あるいはチャンバーの容 積を変化させることでも変化させることが可能である。すなわち、小容積は高抵 抗をもたらす。チャンバー容積の変化は逆関係的（inverse relationship）に抵 抗とパルス長とを変化させる。もし全チャンバー抵抗がタイミングレジスターよ りもずっと大きいならば機能（active）を維持し、望むパルス長を提供する。も しチャンバー抵抗が選択されたタイミングレジスターよりも低ければ、パルス長 はチャンバー抵抗によって決定される。チャンバー抵抗は本質的に、達成可能な 最長パルスを決定する。ＥＣＭ ６００Ｒ信号発生器において、エレクトロポレ ーションパルス長はＲ１からＲ１０と指定された１０体のタイミングレジスター の１つを選択することでセットされる。これらは高ＶＭ（５０マイクロファラッ ドで固定されたキャパシタンス）と低ＶＭ（２５から３，１７５マイクロファラ ッドのキャパシタンス範囲）のいずれにおいても機能する。 細胞膜を通過する電流によってエレクトロポレーションプロセスには欠かせな い一時的な孔が創出される。ＥＣＭ ６００Ｒ信号発生器は電極間のチャンバー 間隙（ｃｍ）にかかる電圧（ｋＶ）を提供する。この電位差はいわゆる電界強度 を定義する。すなわち、Ｅ＝ｋＶ／ｃｍである。各細胞は最良エレクトロポレー ションのための個別の臨界電界強度を有している。これは細胞サイズ、細胞膜の 組成、及び細胞壁自身の個々の特性によるものである。例えば、ある種類のグラ ム陽性バクテリアはエレクトロポレーションに対して非常に抵抗性があり、細胞 の死滅及び／又はエレクトロポレーションが発生するには非常に高い電界強度、 すなわち１７ｋＶ（ｃｍ）以上を要する。一般的には必要な電界強度は細胞サイ ズと逆の関係で変化する。 ＥＣＭ ６００Ｒ信号発生器は、低ＶＭでは５０から５００Ｖ、高ＶＭでは０ ．０５から２．５Ｖで内蔵キャパシタに対して提供されるセットされたチャージ 用電圧の強度を調整するノブを有している。電気信号の強度はＥＣＭ ６００Ｒ 信号発生器に内蔵された表示器に示される。この装置は低ＶＭモードにおいてさ らに、出力部に平行なレジスターと、７体の選択可能な追加キャパシタ（additi ve capacitors）の同時的組み合せ(simultaneous combination)による抵抗によ ってパルス長を制御するための複数のプッシュボタン式スイッチをも含んでいる 。 ＥＣＭ ６００Ｒ信号発生器はさらに１体の自動チャージ及びパルスプッシュ ボタン（automatic charge and pulse push button）をも含んでいる。電圧をセ ットし、５秒以下の自動サイクルで通流チャンバーへとパルスを運搬させるため に内蔵キャパシタのチャージを開始させるようにこのボタンを作動させることが 可能である。この手動式ボタンを連続的に押し、血液と媒液との混合物に所定の 電界を反復的に適用することが可能であり、あるいは、反復的チャージ／パルス モードを調整可能な反復レートで選択することが可能である。 信号発生器１６によって提供される電気信号の波形は指数関数的に衰退するパ ルス、正方パルス、単極振動パルストレインあるいは双極振動パルストレインで もよい。その電界強度は０．２ｋＶ／ｃｍから２０ｋＶ／ｃｍでよい。パルス長 は１０マイクロ秒から１００ミリ秒の範囲でよい。通流チャンバーを通過すると きには液体容積要素(element)あたり１から１００パルスが存在可能である。も ちろん、波形、電界強度及びパルス持続時間は細胞の種類や、エレクトロポレー ションで細胞に侵入する高分子の種類によって変動する。 図３は使い捨てタイプのクヴェットチャンバー９０の形態での別形態の通流チ ャンバーを図示している。このクヴェットチャンバー９０は上端に丸形開口部を 有した収容器９２を定義している透明プラスチック製方形収容体を含んでいる。 この開口部はプッシュ式プラスチックキャップ９４で閉じられている。チュー ブ部材３０はチャンバー９０の１端のキャップ９４の中央部の穴を通過して延び ている。チューブ部材３２は固定具９６で封止された収容器９２の底部上方の穴 を通過して延び出ている。収容器９２は好適には埋め込まれた一対の長形電極９ ８と１００を有して成形されている。これらはスプリング式接触部を有した安全 スタンド（図示せず）内の信号発生器１６から電気信号を運搬する電気ケーブル ３６と３８とに接続されている。これら電極９８と１００とには均一に間隙が提 供されており、入口と出口との間でチャンバー９０とほぼ同じ長さを平行に延び ており、それらの間に液体を通過させる。電極９８と１００とはステンレススチ ールあるいはアルミニウム等のいかなる適当な導電材料であっても構わず、望む ならば金メッキが施されてもよい。好適には、この使い捨てクヴェットチャンバ ー９０は殺菌を確実にするためにガンマ線で照射処理される。 血液リンパ球のエレクトロポレーションの典型的なプロトコールは以下に記載 されている。 プライマリヒト末梢血液リンパ球（Primary Human Peripheral Blood Lymphoc ytes）ＣＣＦＲ−ＣＥＭ Ｔ−リンパ細胞（T-Lymphoblastoid cell） プラスミド（Plasmid）： ｐＢＬ３ＣＭＶ 細胞準備： 成長媒質（Growth Medium）： ＲＰＭＩ １６４０ １０％胎牛血清 （fetal calf serum） ハーベストフェーズ： 対数成長（Logarithmic Growth） （Harvest Phase） ウォッシュ手順（Washing Procedure）：遠心器によるペレット ウォッシュ １： ＰＢＳで再懸濁（Resuspend） 最終細胞密度： ２ｘ１０⁷ 活性細胞／ｍｉ （Final Cell Density） （viable cells/mi） エレクトロポレーションセッティング： モードの選択： Ｔ ５００Ｖ／キャパシタンス＆抵抗（ＬＶ） （500 V/CAPACITANCE & RESISTANCE(LV)） キャパシタンスのセット：Ｃ ２７００−３０００ｕｆ 抵抗のセット： ＢＴＸ使い捨てクヴェットＰ／Ｎ６２０ （２ｍｍ間隙） チャージ用電圧のセット：Ｓ １１０Ｖ 望む電界強度： ０．５５ｋＶ／ｃｍ 望むパルス長： ｔ ５０−５５ｍｓｅｃ エレクトロポレーション手順：予備冷却クヴェット （Pre Chill Cuvettes） 細胞容積： １８ｕｌ 細胞密度： ２ｘ１０⁷ 細胞／ｍｌ トランスフェクタント（Transfectant）： ２０ｕｌＰＢＳ内の５０ｕｇプラスミドＤＮＡ （スーパーコイル(supercoiled)） 全反応容積： ２００ｕｌ 処理温度： 混合物を室温で１０分間保持 Ａを押し、自動チャージ／パルス手順起動 希釈媒質： １０％胎牛血清による６ｍｌＲＰＭＩ １６４０ （Dilution Media） 後パルス培養 ５％ＣＯ₂内で３７℃にて２４−４８時間保持 （Post Pulse Incubation） 選択手法： ＣＡＴ分析（assay） 図４において、組み合わせられた蠕動ポンプ１０２と通流チャンバー構造体１ ０４の別実施例が示されており、これらは組み立てと使用の容易化のために共通 の搭載台１０６に搭載されている。蠕動ポンプ１０２はチューブ部材１１０を受 領するためにローター構造体１０８を有している。制御パネル１１２はポンプユ ニットの多様なパラメータの選択と制御の手段を提供しており、スタート−スト ップ方向性ポンプ作動（start-stop directional pumping）とポンプ作動レート (rate of pumping)及び時間の選択／制御が含まれている。このポンプ構造体に は適当なデジタル式読み出しパネル(digital readout panel)１１４が提供され ており、特定の選択パラメータあるいは操作条件の視覚的読み出しを提供する。 通流エレクトロポレーションチャンバー構造体はパネル１２０と１２２との間 に形成された、使い捨てチャンバー収容用の溝１１８を備えた一般的にＵ形状の 安全スタンド１１６を含んでいる。サイドパネル１２２には上側スリット１２４ と下側スリット１２６とが提供されており、チャンバーに接続されたチューブ部 材１２８と１１０とをそれぞれ受領している。 図５には通流チャンバー構造の詳細が図示されている。このチャンバーは長形 で中央に配置された貫通スリット１３０を有した中央に配置された一般的には方 形である板状部材１２８を含んでいる。貫通スリット１３０は一対の板状電極１ ３２と１３４の手段にて板状部材１２８の両側から挟まれている。中央板状部材 １２８は好適には非導電性材料で製造されており、板状電極１３２と１３４とは 好適には少なくともスリット１３０の両側に関係する表面に沿って金メッキ処理 が容易な導電材料で作成されている。電極１３４には上側と下側にチューブ部材 接合部が提供されており、それぞれチューブ部材１２８と１１０を接続しており 、それぞれのチューブ部材を貫通スリット１３０の上下端部と直接的に連通させ る。 通流チャンバーは、貫通スリット１３０を挟むように板状部材１２８の両側と 封止状態に係合する電極１３２と１３４とを有している。これら電極１３２と１ ３４とは好適には中央板状部材１２８の両側にて適当な接着手段によって封止状 態に接着されている。 組み立てられたチャンバーは安全スタンド１１６内で一対のスプリング式接触 部材１３６と１３８（図６）との間で開口溝１１８内にスライド挿入される。こ れらの接触部材１３６と１３８とは銅合金等の適当な導電性材料で作成されてお り、それぞれ導電性保持体１４０と１４２内に搭載されている。これら保持体１ ４０と１４２とは導電性ケーブル１４４と１４６とに接続状態となる。一対の導 電性ケーブル１４４と１４６とはそれぞれの保持体１４０と１４２にハンダ等の 手段によって接続されたリード１４８と１５０とを含んでいる（図８）。 図７及び図８にはその接触構造が詳細に図示されている。保持体１４０と１４ ２とは収容体１１６の後方部に提供された開口部１５４を備えた取り外し自由な 後方プレート１５２に搭載されている。後方プレート１５２はネジ等１５６の手 段で固定されている。この実施例では、保持体１４０と１４２とは収容体１１６ 内で複数のピン体１５８によって後方プレート１５２に搭載されている。 スプリング式接触部１３６と１３８とはどのような適当な構造であってもよい が、好適形態では図６と図７に示すような形状を有している。図示のごとくに接 触部１３６は梯子形状であり、側部に提供された平行側部材１６２間を延びる複 数の弓形接触部材１６０を有している。このような構造によって、電極１３２と １３４とに接触するように押し付けられた自動清浄式接触部（self-cleaning co ntact）が提供される。 ケーブル１４４と１４６とは後方プレート１５２内でグロメット１６８を有し た開口部１６６を通過して延びる。 図９には図５の９−９線に沿った断面図が示されており、電極１３４を通過す る開口導管へのチューブまたは液管の接続部の詳細が示されている。チューブ１ ７０は開口部１７２を通って電極１３４へと延びており、貫通スリット１３０の 上端と直接的に連通してチャンバーと連通する。チューブ部材１２８はチューブ １７０に通常の手法で取り付けられている。 以上、本発明によるエレクトロポレーションを利用した体外における薬物及び 遺伝子の運搬のための装置並びに方法の好適実施例を解説してきたが、当業者で あればこれらの実施例の改良及び変形は充分に可能であろう。よって、本発明の 保護範囲は本明細書の「請求の範囲」によってのみ限定されるべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者の生血液細胞内に分子を搬入するための液体通流装置であって、その両 端部に入口と出口を有した長形通流チャンバーを含んだ収容手段と、該長形通流 チャンバー内で該入口と該出口との間に配置され、該チャンバーの両側に沿って 延びており、内部に液体を通過させる一対の長形平行電極と、患者から血液を抜 き出し、該電極間で該通流チャンバー内を通過させ、該患者に戻すための連続式 分流手段と、患者から抜き出された後であって、該通流チャンバーを通過させる 前に該血液内に所定の分子を運搬する所定量の媒液を注入する手段と、前記電極 に対して所定の振幅と持続時間の所定電気信号を適用し、所定の強度と持続時間 の電界を発生させ、前記血液と媒液の混合物に対して反復的に適用し、該血液の 所定の血液細胞の壁を一時的に透過性とし、該血液細胞を死滅させることなく該 血液細胞内に分子を搬入させる手段と、を含んでいることを特徴とする液体通流 装置。 ２．前記収容手段は、方形断面形状であって、両端間の中央部に提供された長形 貫通スリットを有した一般的に長形な非導電性板状部材を含んでおり、前記電極 は、該貫通スリットを閉鎖するように挟んで該板状部材の両側に封止状態にて提 供され、前記長形通流チャンバーを定義する長形導電性板状部材である、ことを 特徴とする請求項１記載の装置。 ３．前記入口と出口は前記電極の一方に形成されており、前記貫通スリットの両 端部と連通していることを特徴とする請求項２記載の装置。 ４．前記収容手段は、非導電性材料で成形されており、前記通流チャンバーを取 り外し自由に受領するための開口溝部を提供する一対の平行側壁を有した一般的 にＵ形状である収容器と、前記電極とエンゲージさせて電気的に接続させるため の該側壁内のスプリング式電気接触部と、を含んでいることを特徴とする請求項 ３記載の装置。 ５．前記Ｕ形状収容器は、前記入口と出口に接続されたチューブを通過させるた めにその一方側にスリットを含んでいることを特徴とする請求項４記載の装置。 ６．前記電極は実質的に前記通流チャンバーの全長に及んで延びていることを特 徴とする請求項１記載の装置。 ７．前記通流チャンバーは長形非導電性チューブ部材と、該チューブ部材の一方 の端部に提供され、前記入口あるいは出口を定義する冠部材と、該チューブ部材 の両側に沿って延びており、前記電極を定義する一対の長形導電性板部材と、を 含んでいることを特徴とする請求項６記載の装置。 ８．前記通流チャンバーは、前記電極の一方を定義する長形導電性チューブ部材 と、前記入口及び出口を定義する該チューブ部材の両端に提供された一対の冠部 材と、該チューブ部材と共軸的に延びて他方の電極を定義する導電性ロッドとを 含んでいることを特徴とする請求項１記載の装置。 ９．前記通流チャンバーはその断面形状が実質的に方形であることを特徴とする 請求項１記載の装置。 １０．前記通流チャンバーは、長形非導電性チューブ部材と、該チューブ部材の 一方の端部に提供され、前記入口あるいは出口を定義する冠部材と、該チューブ 部材の両側に沿って延びており、前記電極を定義する一対の長形導電性板状部材 と、を含んでいることを特徴とする請求項９記載の装置。 １１．患者の生血液細胞内に分子を搬入させるための連続式液体通流方法であっ て、両端に入口と出口を有し、該入口と出口との間に配置された一対の長形平行 電極を含んでおり、その間に液体を通過させる長形通流チャンバーを提供するス テップと、患者に連続式分流手段を選択的に接続するステップと、該患者から血 液を連続的に抜き出すステップと、前記電極間で前記通流チャンバー内に該血液 を通過させ、該患者内に戻すステップと、血液を該患者から抜き出した後で該通 流チャンバーに通過させる前に、所定の分子を運搬する所定量の媒液を該血液内 に注入するステップと、前記電極に対して所定の振幅と持続時間の所定の電気信 号を適用し、所定の強度と持続時間の電界を発生させ、前記血液と媒液の混合物 に対して反復的に適用し、前記血液内の所定の血液細胞の壁を一時的に透過性と し、該血液細胞を死滅させることなく該血液細胞内に分子を搬入させるステップ と、を含んでいることを特徴とする液体通流方法。 １２．前記分子は、遺伝子と薬剤とで成る群から選択されたものであることを特 徴とする請求項１１記載の方法。 １３．患者の体外へ第１のカテーテルを介して血液を強制排出させ、第２のカテ ーテルを介して該患者の体内へと戻すステップをさらに含んでいることを特徴と する請求項１１記載の方法。 １４．前記所定の血液細胞は赤血球と白血球とで成る群から選択されるものであ ることを特徴とする請求項１１記載の方法。 １５．前記電界は、所定の電気信号の適用先である一対の電極を有した通流チャ ンバー内の血液と媒液の混合物に対して適用されることを特徴とする請求項１１ 記載の方法。 １６．前記電気信号は、指数関数的に衰退するパルス、平方パルス、単極振動パ ルストレイン、及び双極振動パルストレインで成る群から選択される電波を有し ていることを特徴とする請求項１５記載の方法。 １７．前記電界は約０．２ｋＶ／ｃｍから２０．０ｋＶ／ｃｍの範囲の強度を有 していることを特徴とする請求項１１記載の方法。 １８．各前記パルスは約１０マイクロ秒から１００ミリ秒の範囲の持続時間を有 していることを特徴とする請求項１６記載の方法。 １９．前記通流チャンバーを通過するときには液体容積要素あたり約１パルスか ら１００パルスが存在することを特徴とする請求項１８記載の方法。 ２０．前記所定の血液細胞はリンパ球であり、前記電界は約０．５５ｋＶ／ｃｍ の強度を有しており、前記電気信号は約５０から５５ミリ秒の持続時間を有した パルスと共に指数関数的に衰退するパルストレイン波形を有していることを特徴 とする請求項１５記載の方法。