JP3740664B2

JP3740664B2 - 通流エレクトロポレーション装置及び方法

Info

Publication number: JP3740664B2
Application number: JP51350196A
Authority: JP
Inventors: ガンターエイ．ホフマン，; ヘンリー，アール．ケント，
Original assignee: ジェネトロニクス，インク．
Priority date: 1994-10-12
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 2006-02-01
Anticipated expiration: 2015-10-12
Also published as: DE69511422D1; JPH10507364A; CA2196610A1; WO1996012006A3; WO1996012006A2; US5676646A; DE69511422T2; CA2196610C; US5545130A; EP0785987B1; AU691705B2; AU4153696A; EP0785987A2; ATE183231T1

Description

技術分野
本発明は人間及び他の哺乳類の病気の治療に関する。さらに特定すれば、本発明は患者の生細胞内に薬剤（pharmaceutical compounds）及び遺伝子（genes）を搬入するために連続的液流を提供する装置並びに方法に関する。
背景技術
特定の薬剤を使用し、体内の特定細胞を標的にして治療を施すことが望ましいことは既に知られている。しかし、例えば化学療法による癌の治療においては、正常細胞をできるだけ死滅させずに癌細胞を死滅させるように配慮しながら多量の薬物を投与することが必要である。化学療法で使用する薬物を癌細胞内に直接的に注入できるなら、この目的は達成されるであろう。しかし、例えばブレオマイシン（bleomycin）等の最良な抗癌剤のいくらかは特定の癌細胞の細胞膜内に浸透できない。
同様に、特定の病気は患者の特定細胞内に望む遺伝子を侵入させることで治療が可能である。現在のところ、たいていの遺伝子療法の実験では、遺伝子の細胞内への運搬体（carrier）としてレトロウィルス（retrovirus）を利用してきた。
だが、レトロウィルスが標的細胞に侵入したとき、ゲノム（genome）内で基本的にはランダムに同化（integrate）し、その搬入の事実のみで突然変異的なダメージ（mutational damage）を与える可能性が存在する。もしそのウィルスが腫瘍要素（oncogeny）に隣接して変異すれば、標的細胞の悪性変異が生じかねない。
これら欠点の多くは遺伝子転移（gene transfer）のためのエレクトロポレーション（electroporation）を利用することで軽減が可能である。
遺伝子や、薬剤等の他の分子（molecule）及び高分子（macromolecule）はエレクトロポレーションとして知られる手法によって生細胞内への搬入が可能であることは周知である。遺伝子や他の分子及び高分子は緩衝媒質（buffer medium）内で生細胞と混合され、その混合物に対して高電界の短パルスが適用される。高電界パルスは細胞膜を一時的に多孔質（porous）とし、遺伝子あるいは高分子を細胞内に浸透させる。パルスは細胞のゲノムを改質させることができる。エレクトロポレーション処理された遺伝子が相同宿主遺伝子（homologous host gene）と組換（recombine）が可能なことはほぼ証明されている。このことに関する従来技術の例には、チャン（Chang）に付与された米国特許第４，９７０，１５４号、カルビン（Calvin）に付与された米国特許第５，０９８，８４３号、及びバエル（Baer）に付与された米国特許第５，１２８，２５７号がある。
エレクトロポレーションを利用した赤血球内への薬物の搬入並びにエレクトロポレーションによる白血球内への遺伝子の搬入は両方とも可能であることが証明されている。エレクトロポレーションによる全血液（whole blood）の白血球内への遺伝子の選択的な搬入も可能であることは証明されている。静電界（static field）内でのベンチュリ管を利用した通流システムでの細胞のエレクトロポレーションはカルビンによって米国特許第５，０９８，８４３号において提案されている。
しかしながら、生体患者の血管を介したエレクトロポレーションによる体外式（ex vivo）細胞内（intra cellular）薬物及び遺伝子運搬を可能にする装置及び方法は未だ提供されていない。そのような装置と方法の提供は望ましいであろう。なぜなら、リンパ球を遺伝学的に改質させることで生体患者の遺伝子治療が可能となるからである。このような装置及び方法は、赤血球内へ被嚢処理（encapsulate）することで生体の選択された組織及び器官に薬物を運搬する技術の提供にも有益であろう。一般的にこのような装置と方法とは、生体患者内への抗体、タンパク質、あるいは他の高分子の運搬手段の提供に優れた利点を提供するであろう。
発明の開示
従って、本発明の主要な目的は、改良型通流エレクトロポレーション装置を提供することである。
本発明の別な主要目的は、エレクトロポレーションによる体外式細胞内薬物及び遺伝子運搬装置の提供である。本発明のさらに別な目的は、生体患者に対するエレクトロポレーションによる体外式細胞内薬物及び遺伝子運搬方法の提供である。本発明は遺伝子及び薬剤のごとき高分子の患者の生血液細胞内への搬入に利用する装置並びに方法を提供する。この装置は長形のエレクトロポレーション部を備えた使い捨てチャンバー（chamber）を有した改良収容構造を含んでいる。一対のカテーテル（catheter）が患者に挿入され、患者の血液を抜き出して体内へと戻す。蠕動ポンプ（peristaltic pump）を利用して血液が取り出されたなら、所定の高分子を運搬する所定量の媒液がその血液内に注入される。その後に、一対の長形で間隔が開けられて平行に設置された電極を有した通流チャンバー内の血液と媒液のこの混合物に電界が反復的に適用される。この反復電界は細胞を殺傷することなく高分子をそれらの細胞に侵入させることができるように所定の細胞の細胞壁を一時的に透過性とするような所定の振幅（amplitude）と持続時間（duration）とを有したものである。その後に、血液と媒液の混合物は患者体内に戻される。この電界は信号発生器を利用してこれら電極に所定の電気信号を適用することで発生される。
患者の生血球内に分子を侵入させるための通流装置は、その両端に入口と出口とを有した長形の通流チャンバーを含んだ収容手段と、液体をその間に通過させるようにそれら入口と出口との間に配置された一対の長形平行電極と、患者から血液を抜き出し、前記の電極間で通流チャンバーを通過させ、さらに患者に戻す連続式分流手段（flow shunt means）と、所定の分子を搬送する所定量の媒液を血液を患者から抜き取った後であって、通流チャンバーを通過させる前にその血液内に注入する手段と、所定の振幅と持続時間とを有した所定の電気信号をそれら電極に適用して血液内の所定の血液細胞の壁を一時的に透過性とすべく、所定の振幅と持続時間とを有した電界パルスを発生させて血液と媒液との混合物に反復的に適用し、細胞を殺傷することなく所定の細胞に分子を侵入させる手段とを含んでいる。
【図面の簡単な説明】
図１は、エレクトロポレーションによる体外式細胞内薬物及び遺伝子運搬装置の好適実施例を図示している。
図２は、図１に示す本発明の実施例に利用される共軸通流チャンバーの断面図である。
図３は、図１に示す実施例に利用可能なクヴェット型通流チャンバーの斜視図である。
図４は、本システムのポンプ及びチャンバー要素の別実施例を示す斜視図である。
図５は、図４の実施例のチャンバーの詳細を示す分解図である。
図６は、チャンバー保持体内に設置された状態の、一部を切り欠いた図５の組み立てチャンバーを示す斜視図である。
図７は、構造の詳細を図示するために一部を切り欠いた図６の保持体の側面図である。
図８は、詳細を示すために一部を断面で示した図７の実施例の平面図である。
発明を実施するための最良態様
図１には本発明の好適実施例が図示されている。この装置は、蠕動ポンプ（peristaltic pump）１０と、注入ポンプ１２と、通流チャンバーユニット１４と、信号発生器１６とを含んでいる。この装置はさらに、患者２２の腕の静脈から血液を抜き取って体内に戻すための略図で示された一対の挿入可能なカテーテル１８と２０の形態の分流手段を含んでいる。この装置はさらに、図１の矢印で示す方向にそれらポンプ１０と１２、通流チャンバーユニット１４、及びカテーテル１８と２０の間で液を流すため、Ｔ形状結続器３４と共に適当なＩＶ型チューブ機構の要素であるチューブ部材２４、２６、２８、３０及び３２を含んでいる。
この装置はまたさらに、信号発生器１６と通流チャンバーユニット１４とを接続するための一対の電気ケーブル３６と３８とを含んでいる。
注入ポンプ１２は、遺伝子や薬剤等の所定の高分子を搬送するための媒液を保持する注入器４０を利用した通常タイプのものでよい。注入器４０のプランジャーはモーター駆動式ピストン構造体４２によって内側に押される。注入器４０からチューブ部材２６への媒液の運搬流量は制御ダイヤル４４で手動調整することが可能である。この際の運搬パラメータは表示器４６に示されている。
蠕動ポンプ１０は通常デザインのものであり、ポンプの作動を調節するための制御器（図示せず）を有している。蠕動ポンプ１０は患者２２の体外の血液を強制循環させる。このポンプ１０は円筒収容器５０を囲む取り替えチューブ部材４８を含んでいる。モーター駆動式ローター（図示されていない）はチューブ部材４８とエンゲージしており、チューブ部材４８内部を通過させて血液をＴ形状結続器３４へと送り、そこで注入ポンプ１２からの媒液と混合させる。この媒液は生理塩水等の適当な液体運搬体（vehicle）内に懸濁（suspend）された薬剤であってもよい。遺伝子を患者の血液細胞内に導入するときには、媒液は、患者の血液細胞内に注入されるまで遺伝子の活性を保つような適当な媒液に懸濁された遺伝子を含む。このような媒液はこの分野の技術者にはよく知られている。
連続チャンバーユニット１４は長形通流チャンバー５４を収納する方形収容体５２を含んでいる。この通流チャンバー５４の詳細は図２に示されている。これは、対面状態の平行電極面を定義する円筒容器５８と、それに同心的に提供された円筒形導電ロッド５６の形態である一対の均等に間隔が開けられた長形電極を含んでいる。好適には、ロッド５６と容器５８とはステンレススチール製であり、望むならば金メッキを施すこともできる。ロッド５６と容器５８の両端部には絶縁性プラスチック材料で成る中空ブロック６０と６２とがそれぞれ提供されており、耐高温エラストマー製Ｏ−リング６４で封止されている。これらＯ−リング６４はブロック６０と６２の内側に提供されている。好適には、これらＯ−リング６４は商標ＶＩＴＯＮを付したもののごとき耐熱性材料で製作されており、通流チャンバー５４はオートクレーブでの殺菌が可能である。
ブロック６０と６２とにはロッド５６と容器５８の両端部を受領するための円筒穴が提供されている。ブロック６０は入口ポート６６を、ブロツク６２は出口ポート６８を有しており、血液と媒液との混合物は図２の矢印によって示される方向に電極間（５６と５８）にて通流チャンバー５４を通過することができる。ナット７０と７２（図１）はそこにチューブ部材７４と７６とをそれぞれ結続させるために入口ポート６６と出口ポート６８のそれぞれのネジ溝壁内にネジ固定されている。チューブ部材７４と７６は収容体５２内で延びており、収容体５２の前方パネルに搭載されたナット７８と８０とにそれぞれ接続されている。チューブ部材３０と３２とはそれぞれナット７８と８０とに接続されている。
信号発生器１６から延びる電気ケーブル３６と３８（図１）は、通流チャンバーユニット１４の収容体５２の前方パネル上のジャック８２と８４とに引き抜き自由に接続されている。これらのジャック８２と８４とはさらにワイヤ８６と８８とに接続されている。これらワイヤ８６と８８とは通流チャンバー５４の一方の電極としてネジシャフト／ナット構造体９０あるいは９２（図２）に、さらに、他方の電極として容器５８周囲のクランプに接続されている。構造体９０はロッド電極５６に対して電気的接続を提供し、構造体９２は容器電極５８に対して電気的接続を提供する。
以下において信号発生器１６（図１）の詳細を解説することにする。信号発生器１６の機能は所定の電気信号を発生させることである。この信号は通流チャンバー５４の電極５６と５８とに適用されたとき、所定の振幅と持続時間とを有した電界を通過する血液と媒液の混合物に適用する。好適には、この電界は反復的に適用され、所定の血液細胞壁を充分に透過性とし、血液細胞を殺傷することなく高分子を所定の血液細胞内に浸透させるものである。
信号発生器１６の好適な１例は米国カリフォルニア州サンディエゴ市のジェネトロニクスインク社から商業的に入手可能な”ＥＬＥＣＴＲＯＣＥＬＬＭＡＮＩＰＵＬＡＴＯＲＭｏｄｅｌＥＣＭ６００Ｒ”である。このＥＣＭ６００Ｒ信号発生器はキャパシタの完全放電によりパルスを発生させ、指数関数的（exponentially）に衰退する波形を提供する。ＥＣＭ６００Ｒ信号発生器によって発生された電気信号は迅速な上昇時間（fast rise time）と指数関数的な尾部（tail）とをその特徴としている。
このＥＣＭ６００Ｒ信号発生器で望むパルス長を達成するにはいくつかの可変要因（変数）が考慮される。これらには使用されるバッファタイプ、電圧とタイミングモード、充填容量（fill volume）及びチャンバータイプとが含まれる。
チャンバー抵抗は媒液のタイプによって決定される。あるいはチャンバーの容積を変化させることでも変化させることが可能である。すなわち、小容積は高抵抗をもたらす。チャンバー容積の変化は逆関係的（inverse relationship）に抵抗とパルス長とを変化させる。もし全チャンバー抵抗がタイミングレジスターよりもずっと大きいならば機能（active）を維持し、望むパルス長を提供する。もしチャンバー抵抗が選択されたタイミングレジスターよりも低ければ、パルス長はチャンバー抵抗によって決定される。チャンバー抵抗は本質的に、達成可能な最長パルスを決定する。ＥＣＭ６００Ｒ信号発生器において、エレクトロポレーションパルス長はＲ１からＲ１０と指定された１０体のタイミングレジスターの１つを選択することでセットされる。これらは高ＶＭ（５０マイクロファラッドで固定されたキャパシタンス）と低ＶＭ（２５から３，１７５マイクロファラッドのキャパシタンス範囲）のいずれにおいても機能する。
細胞膜を通過する電流によってエレクトロポレーションプロセスには欠かせない一時的な孔が創出される。ＥＣＭ６００Ｒ信号発生器は電極間のチャンバー間隙（ｃｍ）にかかる電圧（ｋＶ）を提供する。この電位差はいわゆる電界強度を定義する。すなわち、Ｅ＝ｋＶ／ｃｍである。各細胞は最良エレクトロポレーションのための個別の臨界電界強度を有している。これは細胞サイズ、細胞膜の組成、及び細胞壁自身の個々の特性によるものである。例えば、ある種類のグラム陽性バクテリアはエレクトロポレーションに対して非常に抵抗性があり、細胞の死滅及び／又はエレクトロポレーションが発生するには非常に高い電界強度、すなわち１７ｋＶ（ｃｍ）以上を要する。一般的には必要な電界強度は細胞サイズと逆の関係で変化する。
ＥＣＭ６００Ｒ信号発生器は、低ＶＭでは５０から５００Ｖ、高ＶＭでは０．０５から２．５Ｖで内蔵キャパシタに対して提供されるセットされたチャージ用電圧の強度を調整するノブを有している。電気信号の強度はＥＣＭ６００Ｒ信号発生器に内蔵された表示器に示される。この装置は低ＶＭモードにおいてさらに、出力部に平行なレジスターと、７体の選択可能な追加キャパシタ（additive capacitors）の同時的組み合せ（simultaneous combination）による抵抗によってパルス長を制御するための複数のプッシュボタン式スイッチをも含んでいる。
ＥＣＭ６００Ｒ信号発生器はさらに１体の自動チャージ及びパルスプッシュボタン（automatic charge and pulse push button）をも含んでいる。電圧をセットし、５秒以下の自動サイクルで通流チャンバーへとパルスを運搬させるために内蔵キャパシタのチャージを開始させるようにこのボタンを作動させることが可能である。この手動式ボタンを連続的に押し、血液と媒液との混合物に所定の電界を反復的に適用することが可能であり、あるいは、反復的チャージ／パルスモードを調整可能な反復レートで選択することが可能である。
信号発生器１６によって提供される電気信号の波形は指数関数的に衰退するパルス、正方パルス、単極振動パルストレインあるいは双極振動パルストレインでもよい。その電界強度は０．２ｋＶ／ｃｍから２０ｋＶ／ｃｍでよい。パルス長は１０マイクロ秒から１００ミリ秒の範囲でよい。通流チャンバーを通過するときには液体容積要素（element）あたり１から１００パルスが存在可能である。もちろん、波形、電界強度及びパルス持続時間は細胞の種類や、エレクトロポレーションで細胞に侵入する高分子の種類によって変動する。
図３は使い捨てタイプのクヴェットチャンバー９０の形態での別形態の通流チャンバーを図示している。このクヴェットチャンバー９０は上端に丸形開口部を有した収容器９２を定義している透明プラスチック製方形収容体を含んでいる。
この開口部はプッシュ式プラスチックキャップ９４で閉じられている。チューブ部材３０はチャンバー９０の１端のキャップ９４の中央部の穴を通過して延びている。チューブ部材３２は固定具９６で封止された収容器９２の底部上方の穴を通過して延び出ている。収容器９２は好適には埋め込まれた一対の長形電極９８と１００を有して成形されている。これらはスプリング式接触部を有した安全スタンド（図示せず）内の信号発生器１６から電気信号を運搬する電気ケーブル３６と３８とに接続されている。これら電極９８と１００とには均一に間隙が提供されており、入口と出口との間でチャンバー９０とほぼ同じ長さを平行に延びており、それらの間に液体を通過させる。電極９８と１００とはステンレススチールあるいはアルミニウム等のいかなる適当な導電材料であっても構わず、望むならば金メッキが施されてもよい。好適には、この使い捨てクヴェットチャンバー９０は殺菌を確実にするためにガンマ線で照射処理される。
血液リンパ球のエレクトロポレーションの典型的なプロトコールは以下に記載されている。
プライマリヒト末梢血液リンパ球（Primary Human Peripheral Blood Lymphocytes）ＣＣＦＲ−ＣＥＭ
Ｔ−リンパ細胞（T-Lymphoblastoid cell）
プラスミド（Plasmid）：ｐＢＬ３ＣＭＶ
細胞準備：
成長媒質（Growth Medium）：ＲＰＭＩ１６４０１０％胎牛血清（fetal calf serum）
ハーベストフェーズ（Harvest Phase）：対数成長（Logarithmic Growth）
ウォッシュ手順（Washing Procedure）：遠心器によるペレット
ウォッシュ１：ＰＢＳで再懸濁（Resuspend）
最終細胞密度（Final Cell Density）：２ｘ１０⁷活性細胞／ｍｉ（viable cells/mi）
エレクトロポレーションセッティング：
モードの選択：Ｔ５００Ｖ／キャパシタンス＆抵抗（ＬＶ）（500 V/CAPACITANCE & RESISTANCE(LV)）
キャパシタンスのセット：Ｃ２７００−３０００ｕｆ
抵抗のセット：ＢＴＸ使い捨てクヴェットＰ／Ｎ６２０（２ｍｍ間隙）
チャージ用電圧のセット：Ｓ１１０Ｖ
望む電界強度：０．５５ｋＶ／ｃｍ
望むパルス長：ｔ５０−５５ｍｓｅｃ
エレクトロポレーション手順：予備冷却クヴェット（Pre Chill Cuvettes）
細胞容積：１８ｕｌ
細胞密度：２ｘ１０⁷細胞／ｍｌ
トランスフェクタント（Transfectant）：２０ｕｌＰＢＳ内の５０ｕｇプラスミドＤＮＡ（スーパーコイル(supercoiled)）
全反応容積：２００ｕｌ
処理温度：混合物を室温で１０分間保持Ａを押し、自動チャージ／パルス手順起動
希釈媒質（Dilution Media）：１０％胎牛血清による６ｍｌＲＰＭＩ１６４０
後パルス培養（Post Pulse Incubation）５％ＣＯ₂内で３７℃にて２４−４８時間保持
選択手法：ＣＡＴ分析（assay）
図４において、組み合わせられた蠕動ポンプ１０２と通流チャンバー構造体１０４の別実施例が示されており、これらは組み立てと使用の容易化のために共通の搭載台１０６に搭載されている。蠕動ポンプ１０２はチューブ部材１１０を受領するためにローター構造体１０８を有している。制御パネル１１２はポンプユニットの多様なパラメータの選択と制御の手段を提供しており、スタート−ストップ方向性ポンプ作動（start-stop directional pumping）とポンプ作動レート（rate of pumping）及び時間の選択／制御が含まれている。このポンプ構造体には適当なデジタル式読み出しパネル（digital readout panel）１１４が提供されており、特定の選択パラメータあるいは操作条件の視覚的読み出しを提供する。
通流エレクトロポレーションチャンバー構造体はパネル１２０と１２２との間に形成された、使い捨てチャンバー収容用の溝１１８を備えた一般的にＵ形状の安全スタンド１１６を含んでいる。サイドパネル１２２には上側スリット１２４と下側スリット１２６とが提供されており、チャンバーに接続されたチューブ部材１２８と１１０とをそれぞれ受領している。
図５には通流チャンバー構造の詳細が図示されている。このチャンバーは長形で中央に配置された貫通スリット１３０を有した中央に配置された一般的には方形である板状部材１２８を含んでいる。貫通スリット１３０は一対の板状電極１３２と１３４の手段にて板状部材１２８の両側から挟まれている。中央板状部材１２８は好適には非導電性材料で製造されており、板状電極１３２と１３４とは好適には少なくともスリット１３０の両側に関係する表面に沿って金メッキ処理が容易な導電材料で作成されている。電極１３４には上側と下側にチューブ部材接合部が提供されており、それぞれチューブ部材１２８と１１０を接続しており、それぞれのチューブ部材を貫通スリット１３０の上下端部と直接的に連通させる。
通流チャンバーは、貫通スリット１３０を挟むように板状部材１２８の両側と封止状態に係合する電極１３２と１３４とを有している。これら電極１３２と１３４とは好適には中央板状部材１２８の両側にて適当な接着手段によって封止状態に接着されている。
組み立てられたチャンバーは安全スタンド１１６内で一対のスプリング式接触部材１３６と１３８（図６）との間で開口溝１１８内にスライド挿入される。これらの接触部材１３６と１３８とは銅合金等の適当な導電性材料で作成されており、それぞれ導電性保持体１４０と１４２内に搭載されている。これら保持体１４０と１４２とは導電性ケーブル１４４と１４６とに接続状態となる。一対の導電性ケーブル１４４と１４６とはそれぞれの保持体１４０と１４２にハンダ等の手段によって接続されたリード１４８と１５０とを含んでいる（図８）。
図７及び図８にはその接触構造が詳細に図示されている。保持体１４０と１４２とは収容体１１６の後方部に提供された開口部１５４を備えた取り外し自由な後方プレート１５２に搭載されている。後方プレート１５２はネジ等１５６の手段で固定されている。この実施例では、保持体１４０と１４２とは収容体１１６内で複数のピン体１５８によって後方プレート１５２に搭載されている。
スプリング式接触部１３６と１３８とはどのような適当な構造であってもよいが、好適形態では図６と図７に示すような形状を有している。図示のごとくに接触部１３６は梯子形状であり、側部に提供された平行側部材１６２間を延びる複数の弓形接触部材１６０を有している。このような構造によって、電極１３２と１３４とに接触するように押し付けられた自動清浄式接触部（self-cleaning contact）が提供される。
ケーブル１４４と１４６とは後方プレート１５２内でグロメット１６８を有した開口部１６６を通過して延びる。
図９には図５の９−９線に沿った断面図が示されており、電極１３４を通過する開口導管へのチューブまたは液管の接続部の詳細が示されている。チューブ１７０は開口部１７２を通って電極１３４へと延びており、貫通スリット１３０の上端と直接的に連通してチャンバーと連通する。チューブ部材１２８はチューブ１７０に通常の手法で取り付けられている。
以上、本発明によるエレクトロポレーションを利用した体外における薬物及び遺伝子の運搬のための装置並びに方法の好適実施例を解説してきたが、当業者であればこれらの実施例の改良及び変形は充分に可能であろう。よって、本発明の保護範囲は本明細書の「請求の範囲」によってのみ限定されるべきである。

Claims

生血液細胞内に分子を搬入するための液体通流装置であって、その両端部に入口と出口を有した長形通流チャンバーを含んだ収容手段と、該長形通流チャンバー内で該入口と該出口との間に配置され、該チャンバーの両側に沿って延びており、内部に液体を通過させる一対の長形平行電極と、血液を前記電極間で通流チャンバー内を通過させる連続式分流手段と、前記血液を該通流チャンバーを通過させる前に該血液内に所定の分子を運搬する所定量の媒液を注入する手段と、前記電極に対して所定の振幅と持続時間の所定電気信号を適用し、所定の強度と持続時間の電界を発生させ、前記血液と媒体の混合物に対して反復的に適用し、該血液の所定の血液細胞の壁を一時的に透過性とし、該血液細胞を死滅させることなく該血液細胞内に分子を搬入させる手段と、を含んでいることを特徴とする液体通流装置。
前記収容手段は、方形断面形状であって、両端間の中央部に提供された長形貫通スリットを有した一般的に長形な非導電性板状部材を含んでおり、前記電極は、該貫通スリットを閉鎖するように挟んで該板状部材の両側に封止状態にて提供され、前記長形通流チャンバーを定義する長形導電性板状部材である、ことを特徴とする請求項１記載の装置。
前記入口と出口は前記電極の一方に形成されており、前記貫通スリットの両端部と連通していることを特徴とする請求項２記載の装置。
前記収容手段は、非導電性材料で成形されており、前記通流チャンバーを取り外し自由に受領するための開口溝部を提供する一対の平行側壁を有した一般的にＵ形状である収容器と、前記電極とエンゲージさせて電気的に接続させるための該側壁内のスプリング式電気接触部と、を含んでいることを特徴とする請求項３記載の装置。
前記Ｕ形状収容器は、前記入口と出口に接続されたチューブを通過させるためにその一方側にスリットを含んでいることを特徴とする請求項４記載の装置。
前記電極は実質的に前記通流チャンバーの全長に及んで延びていることを特徴とする請求項１記載の装置。
前記通流チャンバーは長形非導電性チューブ部材と、該チューブ部材の一方の端部に提供され、前記入口あるいは出口を定義する冠部材と、該チューブ部材の両側に沿って延びており、前記電極を定義する一対の長形導電性板状部材と、を含んでいることを特徴とする請求項６記載の装置。
前記通流チャンバーは、前記電極の一方を定義する長形導電性チューブ部材と、前記入口及び出口を定義する該チューブ部材の両端に提供された一対の冠部材と、該チューブ部材と共軸的に延びて他方の電極を定義する導電性ロッドとを含んでいることを特徴とする請求項１記載の装置。
前記通流チャンバーはその断面形状が実質的に方形であることを特徴とする請求項１記載の装置。
前記通流チャンバーは、長形非導電性チューブ部材と、該チューブ部材の一方の端部に提供され、前記入口あるいは出口を定義する冠部材と、該チューブ部材の両側に沿って延びており、前記電極を定義する一対の長形導電性板状部材と、を含んでいることを特徴とする請求項９記載の装置。
生血液細胞内に分子を搬入するための液体通流方法であって、その両端に入口と出口を有し、該入口と出口との間に配置された一対の長形平行電極を含んでおり、その間に液体を通過させる長形通流チャンバーを提供するステップと、連続式分流手段を選択的に接続するステップと、血液を連続的に供給するステップと、前記電極間で前記通流チャンバー内に該血液を通過させるステップと、前記供給された血液を該通流チャンバーに通過させる前に、所定の分子を運搬する所定量の媒液を該血液内に注入するステップと、前記電極に対して所定の振幅と持続時間の所定電気信号を適用し、所定の強度と持続時間の電界を発生させ、前記血液と媒体の混合物に対して反復的に適用し、該血液内の所定の血液細胞の壁を一時的に透過性とし、該血液細胞を死滅させることなく該血液細胞内に分子を搬入させるステップと、を含んでいることを特徴とする液体通流方法。
前記分子は、遺伝子と薬剤とで成る群から選択されたものであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
第１のカテーテルを介して血液を供給し、第２のカテーテルで戻すステップを含んでいることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
前記所定の血液細胞は赤血球と白血球とで成る群から選択されるものであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
前記電界は、所定の電気信号の適用先である一対の電極を有した通流チャンバー内の血液と媒液の混合物に対して適用されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
前記電気信号は、指数関数的に衰退するパルス、平方パルス、単極振動パルストレイン、及び双曲振動パルストレインで成る群から選択される電波を有していることを特徴とする請求項１５記載の方法。
前記電界は約０．２ｋＶ／ｃｍから２０．０ｋＶ／ｃｍの範囲の強度を有していることを特徴とする請求項１１記載の方法。
各前記パルスは約１０マイクロ秒から１００ミリ秒の範囲の持続時間を有していることを特徴とする請求項１６記載の方法。
前記通流チャンバーを通過するときには液体容積要素あたり約１パルスから１００パルスが存在することを特徴とする請求項１８記載の方法。
前記所定の血液細胞はリンパ球であり、前記電界は約０．５５ｋＶ／ｃｍの強度を有しており、前記電気信号は約５０から５５ミリ秒の持続時間を有したパルスと共に指数関数的に衰退するパルストレイン波形を有していることを特徴とする請求項１５記載の方法。