JP2017051182A - 電気穿孔のための使い捨てカートリッジ - Google Patents
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Abstract
Description
ここで、電気穿孔法は、ノックアウト細胞もしくはトランスジェニック細胞の処理に利用可能である。動物の胚細胞、トランスジェニック細胞もしくはノックアウト細胞を用いて、トランスジェニック動物もしくはノックアウト動物を発生させることもできる。核酸での電気穿孔によって修正された細胞は、癌治療、遺伝子治療又は他の細胞ベースの治療に利用されている。
ΔVmax=(3/2)E0r
によって記述されてきた。つまり、電位差は、初期電界強度E0と細胞の半径rとに比例する(Neumann,E., et al., Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. Embo J, 1982.1(7)のp.841-5)。
各流体の流れは、対応する各チャネル、例えば図4aのチャネル112,122の抵抗に依存する。高い抵抗を有するチャネルを通る流体量は、低い抵抗を有する少なくとも他方のチャネルに比べて、小さくなる。このため、混合比は、少なくとも2つの入力チャネルの抵抗比によって定めることができる。好ましくは、第1の流体ポート及び第2の流体ポートに、第2の流体に対する第1の流体の混合比を1:5から1:10までに維持するための微少流体抵抗を有する複数のチャネルが設けられる。異なる体積を用いることにより、各溶液の静水圧に変化が生じる。ここで、静水圧の差は、微少流体チャネル抵抗によって定められる混合比を損なう。
微少流体チャネルを用いて混合比を求めるために、細胞懸濁液を模倣するリン酸緩衝液と核酸溶液を模倣するインク溶液とを使用した。図1−図7に示されている電気穿孔カートリッジを真空路に接続することで、カートリッジにこれらの溶液を充填し、このようにして混合された液を再びカートリッジから除去した。幾つかの充填ステップで混合液を収集し、緩衝液とインクとの混合割合の差によって定められる標準値にしたがって混合比を求めた。
本発明の装置の信頼性を向上させるために、Jurkat細胞の懸濁液を電気穿孔し、電気穿孔後にフローサイトメータで細胞を分析した。結果を図9a−図9gに示しており、a)は、プラスミドなしでの制御の電気穿孔細胞、b)は、mCherryプラスミドのみでの制御の電気穿孔細胞、c)は、eGFPプラスミドのみでの制御の電気穿孔細胞、d)は、電気穿孔前に手動混合された、mCherryプラスミド及びeGFPプラスミドでの制御の電気穿孔細胞、e)は、微少流体混合を行わず、mCherryプラスミドを予混合し、続いてeGFPプラスミドを添加した電気穿孔細胞、f)は、微少流体混合を行って、mCherryプラスミドを予混合し、続いてeGFPプラスミドを添加した電気穿孔細胞である。以下、図9に即して説明する。
Claims (15)
- 細胞を電気穿孔するための使い捨て製品であって、
前記使い捨て製品内部の流体区画と、
前記流体区画に細胞懸濁液を供給するための第1の流体ポート、及び、細胞内へ電気穿孔される少なくとも1つの化合物を含む流体を前記流体区画へ送給するための第2の流体ポートと、
前記流体区画内に配置された第1の電極及び第2の電極と、
前記流体区画から流体を送出するための少なくとも1つの出口ポートと、
を含み、
前記第1の流体ポート及び前記第2の流体ポートは、混合チャネルへの流体連通部を有しており、前記混合チャネルは、前記流体区画への流体連通部を有している、
使い捨て製品。 - 前記混合チャネルは、蛇行形状を有する、及び/又は、攪拌素子もしくは混合室を含む、
請求項1記載の使い捨て製品。 - 前記第1の流体ポート及び前記第2の流体ポートには、各流体に対してそれぞれ異なる微少流体抵抗を有する複数のチャネルが設けられている、
請求項1又は2記載の使い捨て製品。 - 前記第1の流体ポート及び前記第2の流体ポートには、第2の流体に対する第1の流体の混合比を1:5から1:10までに維持するための微少流体抵抗を有する複数のチャネルが設けられている、
請求項3記載の使い捨て製品。 - 前記第1の流体ポート及び前記第2の流体ポートは、前記第1の流体ポート及び前記第2の流体ポートからの流体を前記流体区画へ送給する少なくとも1つのポンプに流体連通されている、
請求項1から4までのいずれか1項記載の使い捨て製品。 - 前記少なくとも1つの出口ポートは、少なくとも1つの真空源に流体連通されており、これにより、前記第1の流体ポート及び前記第2の流体ポートからの流体が前記流体区画へ吸引される、
請求項1から4までのいずれか1項記載の使い捨て製品。 - 前記混合チャネルと前記少なくとも1つの出口ポートとは、前記流体区画に流体を気泡なく充填できるようにするために、前記流体区画の正対する側に配置されている、
請求項1から6までのいずれか1項記載の使い捨て製品。 - さらに、少なくとも1つの付加的な電極が設けられており、
前記付加的な電極は、前記第1の流体ポートもしくは前記第2の流体ポートもしくは前記出口ポートの少なくとも1つにグラウンド電位を印加する、
請求項1から7までのいずれか1項記載の使い捨て製品。 - 第1の金属電極及び第2の金属電極は、金層で覆われたチタンを含む、
請求項1から8までのいずれか1項記載の使い捨て製品。 - 請求項1から9までのいずれか1項記載の使い捨て製品内の細胞を電気穿孔する方法であって、
細胞懸濁液を第1の流体として第1の流体ポートに供給し、
細胞内へ電気穿孔される少なくとも1つの化合物を含む流体を第2の流体として第2の流体ポートに供給し、
前記第1の流体ポート及び前記第2の流体ポートと少なくとも1つの出口ポートとの間に圧力差を印加することにより、前記第1の流体及び前記第2の流体を所定の混合比で流体区画に供給し、
第1の電極と第2の電極との間に電界を印加し、これにより、細胞を少なくとも1つの化合物で電気穿孔し、
前記流体区画から各流体を除去する、
方法。 - 前記第1の流体及び前記第2の流体を所定の充填レベルまで前記流体区画に供給し、
前記第1の電極と前記第2の電極との間の容量を測定することにより、前記流体区画の充填レベルを求める、
請求項10記載の方法。 - 前記流体区画から流体を除去した後、電気穿孔された細胞を識別して、流体から瀉出させる、
請求項10又は11記載の方法。 - 前記流体区画から流体を除去した後、電気穿孔された細胞を培養する、
請求項10又は11記載の方法。 - 請求項1から9までのいずれか1項記載の使い捨て製品を含む細胞の電気穿孔装置であって、
細胞懸濁液を収容する第1のストレージコンテナと、
細胞内へ電気穿孔される少なくとも1つの化合物を含む流体を収容する第2のストレージコンテナと、
電気穿孔される細胞のための第3のストレージコンテナと、
ポンプ及び/又は真空源と、
各ストレージコンテナと前記使い捨て製品との間の流体連通を形成するチューブセットと、
を含み、
前記電気穿孔装置は、外気に対して閉鎖されている、
電気穿孔装置。 - 前記第3のストレージコンテナは、培養チャンバとして構成されている、
請求項14記載の電気穿孔装置。
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A711 | Notification of change in applicant |
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C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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C23 | Notice of termination of proceedings |
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C03 | Trial/appeal decision taken |
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C30A | Notification sent |
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A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
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R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
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