KR102529065B1 - 전기천공용 일회용 카트리지 - Google Patents

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밀테니 비오텍 비.브이. & 씨오. 케이지
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Abstract

본 발명은 세포의 전기천공을 위한 일회용품으로서, 일회용품의 내부에 유체 구획; 세포 현탁액을 유체 구획에 제공하기 위한 제1 유체 포트, 및 세포 내로 전기천공되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 유체를 유체 구획에 전달하기 위한 제2 유체 포트; 유체 구획 내에 배치된 제1 전극 및 제2 전극; 유체 구획으로부터 유체를 전달하는 적어도 하나의 출구 포트로서, 제1 및 제2 유체 포트가 유체 구획에 대한 유체 소통수단을 갖는 혼합 채널에 대한 유체 소통수단을 갖는, 출구 포트를 포함하는, 일회용품에 관한 것이다.

Description

전기천공용 일회용 카트리지{DISPOSABLE CARTRIDGE FOR ELECTROPORATION}
배경
본 발명은 세포의 전기천공을 수행하기 위한 일회용 디바이스, 일회용품을 이용한 세포의 전기천공을 위한 방법 및 일회용품을 포함하는 밀폐된 시스템에 관한 것이다.
전기천공, 또는 전기투과(electropermeabilization)는 세포막의 투과성을 증가시키기 위해 세포에 전기장을 가하여, 핵산이 세포 내에 도입되도록 하는 분자생물학 기법이다.
전기천공은 세포, 특히 포유동물 세포 내에 핵산을 도입하기 위해 이용된다. 전달된 핵산은 일시적 단백질 발현에 이용될 수 있다. 특히 mRNA 전기천공은 관심 단백질을 일시적으로 발현하는데 이용된다. 플라스미드는 일시적 발현 뿐만 아니라 안정한 통합에 이용될 수 있다. 유전체로의 플라스미드의 통합은 상동 재조합에 의해 부서진 유전체 세그먼트를 대체할 이중 가닥 절단부 및 상동 서열을 도입시킴에 의해 개선될 수 있다. 다른 가능성은 트랜스포사제 모티브(motivs)의 측면에 있는 유전 정보를 유전체에 통합시키기 위해 트랜스포사제를 이용하는 것이다. 전달된 핵산은 또한 누클레아제를 인코딩할 수 있다. 부위 특이적 누클레아제는 비상동 말단 연결에 의해 유전자를 녹아웃시키기 위한 일반적인 도구이다.
이에 의해, 전기천공은 녹아웃 또는 유전자이식 세포를 생성하는 방법에 이용될 수 있다. 동물 배아 세포를 이용하여, 이식유전자 또는 녹아웃 세포는 또한 유전자이식 또는 녹아웃 동물을 개발하는데 이용될 수 있다. 핵산 전기천공에 의해 변형된 세포는 종양 치료, 유전자 유법, 또는 다른 세포-기반 요법에 이용된다.
전기천공은 세포로 전달되는 핵산을 함유하는 세포 현탁액에 가해지는 전기장을 생성하는 특수 제작 제품인 전기천공기에 의해 수행된다. 일반적으로, 세포 현탁액을 양쪽에 2개의 전극을 갖는 유리 또는 플라스틱 큐벳에 피펫팅한다. 전기천공에 앞서, 세포 현탁액을 형질전환되는 핵산과 혼합시킨다. 혼합물을 큐벳에 피펫팅하고, 전압 및 전기용량을 설정하고, 큐벳을 전기천공기에 삽입한다. 전기천공기는 전기장을 인가할 것이다. 전기장은 전계 강도, 예컨대 전극의 간격에 따라 가해지는 전압, 시간 및 전기용량에 의해 정의된다. 지수함수형 붕괴 펄스의 경우, 전압 및 전기용량이 설정되고 세포 현탁액을 통과하는 전류로 인해 전기장이 붕괴된다. 구형파 펄스의 경우, 높은 전기용량이 이용되고 주어진 시간 동안 전기장이 인가된다. 높은 전기용량으로 인해, 세포 현탁액을 통과하는 전류에 의한 전기장의 붕괴는 최소여야 한다. 전기천공 동안, 전기장은 세포막에 구멍을 생성하여, 핵산과 같은 더 큰 분자가 또한 세포막을 통과하도록 한다. 세포막과 같은 양층 지질막은 문헌[Tsong, T.Y., "Electroporation of cell membranes", Biophys J, 1991. 60(2): p. 297-306]에 기재된 바와 같이 강렬한 막횡단 전위에 의해 방해될 수 있다. 막횡단 전기장이 세포막의 절연 강도를 초과하는 경우, 막 전도도는 급격하게 증가한다. 이러한 파괴 전위는 5 nm 두께의 지질 양층에 대해 μs 내지 ms 전계 지속기간 동안 150 and 500 mV인 것으로 Tsong 등에 의해 보고되었다. 이는 300-1000 V/cm의 절연 강도로 해석된다. 저분자량 분자의 침투는 문헌[Rols, M.P. and J. Teissie, "Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration". Biophys J, 1998. 75(3): p. 1415-23]에 의해 전기장 강도 >0.3 - 0.4 kV/cm에 대해 검출되었다. 막 투과에 대한 임계 전계 강도는 문헌[Wolf, H., et al., "Control by pulse parameters of electric field-mediated gene transfer in mammalian cells", Biophys J, 1994. 66(2 Pt 1): p. 524-31]에서 580 V/cm로 기재되었다.
세포막이 겪는 전위차는 하기에 기재되었다:
Figure 112016086766150-pat00001
따라서, 전위차는 초기 전기장 강도 E0 및 세포의 반지름 r에 비례한다 (Neumann, E., et al., Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. Embo J, 1982. 1(7): p. 841-5).
5 μm의 전형적인 세포 반지름의 경우, 예컨대 300 mV의 투과 임계는 400 V/cm 초과의 전기장 강도에 의해 달성될 수 있다. 더 작은 세포의 경우 (r=1 μm), 요구되는 전계 강도는 적어도 2000 V/cm으로 추정될 수 있다.
세포로의 핵산의 수동 확산 외에, 전기장에서 핵산의 추가 전기영동이 적용될 수 있다. 전기영동에 필요한 전기장은 전기천공을 위한 것보다 작을 수 있다. 지수함수형 붕괴 펄스는 아마도 처음에 높은 전기장으로 세포막을 투과하고 붕괴 전계는 후속하여 핵산을 세포 내로 수송한다. 구형파 펄스의 경우, 전기천공과 전기영동을 조합시키기 위해 2개 이상의 펄스가 생성될 수 있다.
핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA가 더 안정하기 때문에, 플라스미드와 같은 DNA를 세포 현탁액과 함께 혼합시키는 것은 일반적으로 DNA를 손상시키지 않는다. 반대로, RNA는, 예컨대 세포에 의해 분비된 RNase에 의해 또는 오염된 완충제로부터 분해되는 경향이 있다. 따라서, RNA는 RNA가 세포에 진입할 수 있기 전에 RNA 분해 위험을 최소화하기 위해 일반적으로 전기천공 단계 전에 첨가된다. 세포 내에서, RNA는 핵산 결합 단백질 및 번역 기작에 의해 보호되어진다.
자동화 전기천공 디바이스의 경우, 핵산, 특히 RNA는 또한 전기천공 직전에 세포 현탁액과 혼합되어야 한다. 현재, 핵산과 세포 현탁액을 혼합시킨 후에 이어지는 전기천공 단계는 자동으로 수행될 수 없다. 반-자동화 또는 자동화 전기천공을 위한 다수의 디바이스가 존재하는 반면, 예컨대 핵산 및 세포 현탁액을 혼합시시키는 샘플 제조는 전기천공 공정 이전에 수행되어야 한다. 혼합 공정은 세포 현탁액 및 핵산 용액과 같은 2개의 용액을 일정한 비율로 첨가시켜 균질한 혼합물을 생성하는 것을 포함한다.
전기천공 공정 동안 핵산의 농도가 중요하며 재현가능한 결과를 위해, 공정 동안 정의된 비율이 유지될 필요가 있다. 이는 혼합물의 균질성을 위해서도 마찬가지이다. 균질한 세포 전기천공을 위해, 국소적 핵산 농도는 모든 세포에 대해 동일하여야 한다. 균질 혼합에서 핵산이 없거나, 낮은 양 및 높은 양의 핵산을 지니는 세포의 혼합물이 발생할 것이다. 전기천공된 세포가 일반적으로 전기천공 후에 또는 심지어 환자에 제공된 후에 배양될 것이므로, 혼합 및 전기천공 공정은 멸균 환경에서 수행되어야 한다.
따라서, 멸균 조건 하에 핵산 및 세포의 혼합을 허용하고 세포의 전기천공을 가능하게 하는 디바이스가 당 분야에서 요구된다.
개요
본 발명은 세포의 전기천공을 위한 일회용품으로서,
일회용품의 내부의 유체 구획;
세포 현탁액을 유체 구획에 제공하기 위한 제1 유체 포트, 및 세포 내로 전기천공되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 유체를 유체 구획에 전달하기 위한 제2 유체 포트;
유체 구획 내에 배치된 제1 전극 및 제2 전극;
유체 구획으로부터 유체를 전달하는 적어도 하나의 출구 포트로서, 제1 및 제2 유체 포트가 유체 구획에 대한 유체 소통수단을 갖는 혼합 채널에 대한 유체 소통수단을 갖는, 출구 포트를 포함하는, 일회용품에 관한 것이다.
일회용 카트리지는 주어진 비율의 적어도 2개의 유체를 혼합시켜 균질하고 조합된 유체가 달성되게 한다. 이러한 혼합은 부피 혼합 비율을 정의하고 균질한 유체 혼합을 가능하게 하는 미세유체 디바이스에 의해 확립된다. 카트리지는 멸균 세포 처리를 허용하는 튜브 세트에 장착될 수 있다. 연동 펌프 또는 진공 펌프를 이용하여 유체를 전기천공 어셈블리 안 및 밖으로 이동시켜, 누출 또는 결함의 위험을 최소화한다. 배관 세트는 또한 세포 분리 또는 세포 배양과 같은 다른 세포 공정 단계와 조합될 수 있다.
다양한 예시적 설명이 하기 도면을 참조하여 기재된다:
도 1은 일회용 전기천공 카트리지 어셈블리의 일반적 구체예의 투시도이다;
도 2는 일회용 전기천공 카트리지 어셈블리의 측면도이다;
도 3은 일회용 전기천공 카트리지 어셈블리의 위에서 본 투시도이다;
도 4a는 도 3의 일회용 전기천공 카트리지 어셈블리의 하반부의 외부 표면의 평면도이다; 도 4b는 도 1의 일회용 전기천공 카트리지 어셈블리의 하반부의 내부 표면의 평면도이다;
도 5a 도 3의 일회용 전기천공 카트리지 어셈블리의 상반부의 외부 표면의 평면도이다; 도 5b는 도 3의 일회용 전기천공 카트리지 어셈블리의 상반부의 내부 표면의 평면도이다;
도 6a 도 1의 일회용 전기천공 카트리지 어셈블리의 아랫면의 평면도이다; 도 6b는 도 1의 일회용 전기천공 카트리지 어셈블리의 윗면의 평면도이다; 및
도 7은 도 3의 일회용 전기천공 카트리지 어셈블리의 아랫면의 투시도이다.
도 8은 전기천공 큐벳 내에서 혼합 비 및 진공의 의존성을 도시한다.
도 9는 mCherry/eGFP 발현에 의해 모니터된 트랜스펙션 효율을 지닌 Jurkat 세포의 전기천공 결과를 도시힌다.
도면은 반드시 일정한 비례로 그려진 것은 아니며, 같은 숫자는 동일한 특징부를 언급할 수 있음이 이해되어야 한다.
상세한 설명
본 발명의 디바이스는 세포 및 세포 내로 전기천공되는 적어도 하나의 화합물을 소정의 부피 혼합 비율로 포함하는 적어도 2개의 유체를 혼합시키고 혼합된 유체에 전기장을 가함에 의해 세포의 트랜스펙션을 가능하게 한다.
세포 내로 전기천공되는 화합물은 핵산, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 펩티드, 단백질 및 소분자, 예컨대 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 약물, 또는 약물 전구체와 같이 전기천공에 유용하다고 당 분야에 공지된 임의의 화합물일 수 있다. 하기에서, 전기천공되는 화합물로서 용어 "핵산"은 전기천공되는 그러한 모든 화합물, 예컨대 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 펩티드, 단백질 및 소분자, 예컨대 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 약물, 또는 약물 전구체와 유의어로서 이용된다.
균질하게 혼합된 유체 상에서 전기천공을 수행하고 채널에서 층류를 방지하기 위해, 일회용품의 혼합 채널은 구불구불한 형상을 지니며/거나 교반기 엘리먼트 및/또는 혼합 챔버를 포함한다. 세포 현탁액 및 핵산 용액을 혼합한 후에, 전기장을 가하는데, 이는 세포막에 기공을 유도한다. 그 후 핵산은 확산 또는 전기영동에 의해 기공을 통해 세포에 진입할 수 있다.
디바이스의 한 구체예에서, 적어도 2개의 유체의 부피 혼합 비율은 상이한 미세유체 저항을 갖는 적어도 2개의 미세유체 채널에 의해 규정되며, 즉 제1 유체 포트 및 제2 유체 포트 유체 포트에는 유체에 대해 상이한 미세유체 저항을 갖는 채널이 제공된다.
각각의 유체의 흐름은 개개 채널, 예를 들어 도 4a의 채널 (112 및 122)의 저항에 의존적이다. 낮은 저항을 갖는 적어도 다른 채널에 비해 보다 적은 유체가 높은 저항을 갖는 채널을 통과할 것이다. 이에 의해, 혼합 비는 적어도 두 개의 투입 채널의 저항 비에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 제1 유체 포트 및 제2 유체 포트에는 제1 유체 대 제2 유체의 혼합 비를 1:5 내지 1:10으로 유지하는 미세유체 저항을 갖는 채널들이 제공된다. 상이한 부피를 이용하여 각 용액의 정수압에서의 변화를 발생시킨다. 이에 의해, 정수압 차이는 미세유체 채널의 저항에 의해 결정되는 혼합 비를 손상시켰다(impaired).
유체는 디바이스로 펌핑되거나 흡입될 수 있다. 따라서, 일회용품의 제1 유체 포트 및 제2 유체 포트는 유체를 유체 구획으로 전달하는 적어도 하나의 펌프와 유체 소통하고/하거나 적어도 하나의 출구 포트는 적어도 하나의 진공 공급원과 유체 소통하여 유체를 유체 구획으로 흡입시킨다.
펌프 또는 진공 공급원은 한쪽에서 제1 유체 포트와 제2 유체 포트 사이에 적어도 100 mbar의 압력 차이를 제공하여야 하고 적어도 하나의 출구 포트는 다른 쪽에서 유체 내에 있다(is in field). 바람직하게는, 압력 차이는 100 내지 800 mbar, 특히 200 내지 500 mbar이다.
혼합된 유체는 압력 차이에 의해 디바이스의 2개의 전극판 사이의 유체 구획으로 밀어넣어진다. 충전 공정, 즉 유체 구획의 충전 수준은 제1 및 제2 전극 사이의 전기용량을 측정함에 의해 제어되고/거나 자동화될 수 있다. 충전은, 예를 들어 제1 및 제2 전극 사이의 최대 용량에 도달할 때까지 계속될 수 있다. 대안적으로, 접지 전극 (이후 설명됨) 사이의 전기 저항을 이용하여 유체 구획의 충전 수준을 결정할 수 있다. 대안적으로, 충전 수준은 유체 구획에 가해진 압력 차이를 제어함에 의해 결정될 수 있다. 유체 구획의 충전 수준을 제어함에 의해, 디바이스는 반-연속 모드로 동작할 수 있다.
전극판 사이의 부피를 채운 후에, 전기장이 가해진다. 전기장은 일반적으로 전기 펄스로서 제공된다. 펄스의 형상은 지수함수형 붕괴, 구형파 또는 상이한 조합일 수 있다. 중요하게는, 전기장 강도는 세포막에 기공을 생성하기에 충분하여야 한다. 그 후 핵산은 확산 또는 전기영동에 의해 세포에 진입할 수 있다. 이어서 전기천공된 세포는 임의로 세포의 특정 서브세트의 검출, 풍부화 및/또는 고갈 및/또는 세포 배양과 같은 추가 처리를 위해, 디바이스로부터 제거된다. 더 많은 세포 (보다 높은 양의 세포 또는 보다 높은 부피의 세포 현탁액)를 전기천공시키기 위해, 충전, 혼합, 전기천공 및 제거의 과정이 반복될 수 있다. 또한, 전기천공 공정 자체는 세척, 배양 또는 분리 단계의 유무와 함께, 동일한 세포 샘플에 대해 반복될 수 있다.
인가된 전기장은 알루미늄과 같은 금속으로부터 제조된 전극을 파괴할 수 있다. 동일한 전극판을 이용하여 디바이스의 여러 연속적인 전기천공이 가능하도록, 판들은 전기화학적 부식에 내성인 금속으로 코팅될 수 있다. 귀금속, 예컨대 금과 같은 전도성 코팅을 이용하여 전극판을 보호할 수 있다. 변형예에서, 본 발명의 일회용품은 금의 층으로 덮인 티타늄으로 제조된 제1 금속 전극 및 제2 금속 전극을 포함한다. 전극 사이의 상이한 전계 강도를 방지하기 위해, 전극은 전극들의 전체 표면 위에 서로 일정한 간격으로 평행하게 배열되어야 한다. 바람직하게는, 제1 금속 전극 및 제2 금속 전극은 +- 20 μm 미만의 간격 변동을 갖는 평행한 배열로 2-4 mm의 간격만큼 떨어져 있다. 더욱이, 전극의 표면은 핀 홀 또는 피크 없이 가능한 한 평탄해야 한다. 1 내지 10 μm의 거칠기 Rz를 갖는 전극이 바람직하다.
도 1은 단순화된 일회용 전기천공 카트리지의 투시도이다. 카트리지의 엘리먼트는 투입 포트(11), 제2 투입 포트(12), 및 이들이 혼합되는 컬럼(13)이다. 투입 포트(11), 제2 투입 포트(12), 및 혼합 컬럼(13)은 일회용 카트리지(10)의 투입 엘리먼트를 구성한다. 혼합 컬럼(13)을 나온 후에, 샘플 유체는 이어서 제1 전극(21) 및 제2 전극(23)을 포함하는 공동으로 들어간다. 전극(21 및 23)은 평행판 커패시터일 수 있어서, 엘리먼트(21 및 23)는 평면 또는 작은 갭으로 구분된 전도성 구조물이다. 전압이 탭(20 및 22)에 의해 판(21 및 23)에 가해지고 유체는 출구 포트(15)를 통해 일회용 카트리지를 나간다.
유체 샘플은 투입 포트(11)를 통해 도입될 수 있고, 예를 들어 RNA와 같은 추가 엘리먼트는 제2 투입 포트(12)를 통해 들어간다. 예를 들어, 세포 현탁액은 투입 포트(11)를 통해 도입될 수 있고 핵산 용액은 제2 투입 포트(12)를 통해 충전된다. 세포 현탁액 및 핵산 용액은 혼합 채널(13)에서 혼합되고 (21 및 23)의 정전판을 포함하는 공동으로 도입된다.
핵산 용액과 혼합된 세포 현탁액은 판들(21 및 23) 사이의 갭을 통해 흐르고 2개의 판 사이에 가해진 전기장을 받는다. 당 분야에 널리 공지된 대로, 이러한 전기장은 세포막에 기공을 발생시켜, 핵산이 세포 내로 확산되도록 한다. 전기천공 후에, 개질된 세포는 이어서 일회용품으로부터 출구 포트(15)에 의해 제거될 수 있다.
본 발명에 따른 일회용품은 일회용품의 두 반쪽을 연결시켜 형성하는 것이 바람직하며, 상기 반쪽은 제1 또는 제2 전극을 각각 포함한다. 이러한 구체예는 도 2에서 측면도로 더욱 자세하게 도시된다. 일회용 전기천공 카트리지(10)는 윗면(100) 및 하부(200)의 두 부분으로 구성될 수 있다. 이러한 두 부분은 성형된 플라스틱으로 제조되고, 레이저 조사 또는 HF 필드에 의해 함께 용접될 수 있다. 일회용, 전기천공 카트리지(10)는 추가 포트(160) 및 2개의 출구 포트(140 및 150)를 추가로 포함할 수 있는데, 이의 기능은 아래에 기재될 것이다. 마지막으로, 일회용 전기천공 카트리지(100)는 또한 갭에 의해 분리된 2개의 전극판(210 및 220)을 포함할 수 있다. 2개의 전극 사이의 간격 (갭)은 인가된 전압 및 요구되는 전기장에 따라 선택될 것이다. 일반적인 전극 간격은 2 내지 4 mm이다. 2 kV/cm 초과, 예를 들어 100 μm의 높은 전기장을 가능케 하기 위해 더 작은 갭이 바람직할 수 있다. 또한, 갭은 입구 유체의 흐름을 허용하기에 충분하여야 하고 예컨대 전단 응력에 의해 세포를 손상시켜선 안 된다. 일부 구체예에서, 전기장은 약 2 kV/cm일 수 있다.
도 3은 어셈블링된 일회용 전기천공 카트리지(10)의 투시도이다. 어셈블링된 도면은 함께 도시된 윗면(100) 및 아랫면(200)을 포함하고 도 3은 또한 이러한 아랫면(100)에, 역시 아랫면(100)의 제1 전극판(210)과 함께, 2개의 투입 포트(110 및 120)를 도시한다.
윗면(200)에는 제2 전극판(220)과 함께 2개의 출구 포트(140 및 150)가 존재한다. 위 및 아래와 같은 용어는 임의적인 것이며, 카트리지(10)는 어떤 임의적인 방향에서 보여질 수 있음이 이해되어야 한다. 도 3은 또한 윗면(200) 상에 배출 포트(140 및 150)를 도시한다. 마지막으로, 윗면(200)은 또한, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 제1 투입 채널(110)에 연결된 혼합 채널(130), 및 제2 투입 채널(120)을 포함할 수 있다. 혼합 채널은 2개 투입 채널의 내용물을 혼합사키기 위한 것이다. 혼합 채널(130)은 구불구불한 형상 또는 두 유체의 병합을 지지하는 임의의 다른 구조를 지닐 수 있다. 혼합 채널(130)은 혼합된 유체를 전극판(210 및 220)을 함유하는 공동으로 도입시킨다. 혼합 채널(130)은 5 내지 15개의 구불구불한 턴을 포함할 수 있다. 구불구불한 턴은 두 성분, 즉 세포 현탁액 및 핵산 용액의 무질서한 혼합을 초래한다.
유체 구획은 거품 없는(bubble-free) 충전 및 배수가 가능하게 하는 바람직한 형상이다. 따라서, 혼합 채널 및 적어도 하나의 출구 포트는 유체 구획의 가장 반대편, 즉 유체 구획의 최고 및 최저 지점에 위치할 수 있다. 또한, 유체 구획 및 전극판(220 및 230)은 둔각 및/또는 예각과 같이, 죽은 공간을 피하는 특정 형상을 지닐 수 있다. 도 3에 예시된 대로, 유체 구획 및 임의의 판은 평행사변형, 또는 사다리꼴 형상을 지닐 수 있다.
이러한 평행사변형은 예시적 구체예이며, 유체 구획 및 전극의 형상은 직사각형, 원형, 사다리꼴, 또는 디바이스의 거품 없는 충전의 요건에 따른 임의의 다른 형상을 포함하는, 어떤 임의적 형상일 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 일회용품은 제1 유체 포트, 제2 유체 포트 또는 출구 포트 중 적어도 하나에 접지 전위를 인가하는 적어도 하나의 추가 전극을 추가로 포함한다. 이러한 구체예는 접지 탭(230 및 240)을 지니는 도 3-5에 도시된다. 이러한 탭을 이용하여 채널(112 및 122)에서 들어가는 유체 및 이에 따라 출구 채널(140 및 150)에 접지 전위를 인가할 수 있다. 투입 유체 및 전극판을 함유하는 공동으로부터 배출되는 유체는 접지 전위를 지닐 수 있다(at ground potential).
도 4a 및 4b는 도 3에 도시된 윗면(100) 특징부의 보다 상세한 일부를 예시한다. 도 4a는 상부(100)의 외부 표면을 도시하고, 도 4b는 상부(100)의 내부 표면을 도시한다. 도 4a에 도시된 대로, 상부(100)는 2개의 투입 포트(110 및 120)를, 전극판(210)과 함께 포함할 수 있다. 마지막으로, 상부는 또한 접지 탭(240)을 포함할 수 있다.
도 4b는 그 구조와 연관된 토포그래피를 갖는다. 예를 들어, 상부 구조물(100)의 내부 표면은 투입 포트(110)와 연관된 채널(112)을 지닐 수 있다. 이러한 채널(112)은 유체를 투입 포트(110)로부터 혼합 채널(130)에 전달하는 역할을 할 수 있다. 유사하게, 상부(100)의 내부 표면은 또한 제2 투입 포트(120)와 연관된 또 다른 채널(122)을 지닐 수 있다. 채널(122)은 제2 포트(120)를 통해 도입되는 추가 물질을 혼합 채널(130)에 전달하도록 작용한다. 채널(112 및 122)의 직경 및 길이는 미세유체 저항을 결정한다. 미세유체 저항 비율을 이용하여 투입 포트(110 및 120)을 통해 각각 전달되는 두 유체의 비를 결정한다. 묘사된 어셈블리에서, 채널(112)은 좁은 부분이 보다 짧은 채널(110)에 비해 더 긴 좁은 부분을 포함한다.
앞서 기재된 혼합 채널(130)은 채널(122)의 내용물을 채널(112)의 내용물과 혼합시키도록 작용하는 구불구불한 형상을 지닐 수 있다. 일회용품의 이러한 변형예에서, 채널(122)의 내용물과 채널(112)의 내용물은 혼합 챔버(114)에 의해 추가로 향상된다. 혼합 챔버(114)는 유체의 가능한 층류가 난류로 전환되는 용적을 제공한다.
한 예시적 구체예에서, 제2 투입 채널(110)은 핵산을 투입 채널(112)로 투입되는 세포 현탁액에 전달하는 역할을 한다. 핵산 용액은 투입 포트(120)로 도입된 투입 유체에 포함된 표적 세포와 혼합된다. 혼합 채널(130)에서 핵산은 표적 세포와 혼합되어, 공동으로 들어가는 유체가 그러한 조합된 엘리먼트를 지니도록 한다.
전극판(210)의 풋프린트가 또한 도 4b에 도시된다. 이러한 도면에서, 전극판(210)의 하부 코너는 배출 포트(160)에 커플링된 것으로 도시될 수 있다.
또한 도 4b에 금속 탭(240)이 도시된다. 이러한 탭을 이용하여 출구 포트(140 및 150)에 이에 따른 접지 전위를 인가할 수 있다. 전극판을 함유하는 공동으로부터 배출되는 유체는 접지 전위를 지닐 수 있다.
도 5a 및 5b는 하부(200)의 내부 및 외부 표면을 도시한다. 도 4a 및 4b와 마찬가지로, 전극 및 배출 및 포트가 도면에 포함된다. 그리고 특히 하부(200)는 전극(220) 및 이의 관련 금속 탭(220)을, 금속 탭(230)과 함께 포함할 수 있다. 앞서 기재한 대로, 전극판(220)은, 전극판(210) 및 전극판(220)에 의해 형성된 평행 판 커패시터의 반대 판의 역할을 할 수있다.
마지막으로, 아랫면(200)은 또한 출구 포트(140 및 150)를 함유할 수 있다. 도 5a에 도시된 대로, 출구 포트(150)는 공동의 솟은 어깨에 커플링될 수 있는 반면, 출구 포트(140)는 공동의 낮은 어깨에 커플링될 수 있다. 이러한 방식으로, 출구(150)는 공동으로부터 거품과 같은 공기를 없애는 역할을 할 수 있다.
도 6a 및 6b는 완성된 카트리지 어셈블리의 평면도이다. 도 6a는 아래에서 본 것인 반면, 도 6b는 위에서의 시선을 보여준다. 다시 한번, "아래" 및 "위"라는 용어는 임의적인 것이며, 카트리지는 명확성의 용이함을 위해 유지될 수 있지만, 도 6a는 아래에서 본 시야를 나타내고, 도 6b는 위에서 본 시야를 나타냄이 이해되어야 한다. 어느 경우든, 카트리지는 하부(200)에 이어진 상부(100)를 갖는, 어셈블링된 것으로 도시된다. 어셈블리에는, 다시 한번, 2개의 투입 포트(110 및 120) 및 출구 포트(140, 150, 및 160)가 포함된다. 접지 탭(230 및 240), 뿐만 아니라 전극판(220 및 210)도 도시된다.
상기 간략하게 기재된 바와 같이, 일회용 카트리지 어셈블리(10)는 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리카르보네이트와 같은 사출 성형된 플라스틱으로부터 구조화될 수 있다. 정전판(210 및 220)을 포함하는 다양한 구조물의 윤곽이 플라스틱 물질에 형성될 수 있다. 또한, 접지 탭을 위한 영역의 위치를 정한다. 도 6에서와 같이, 2개의 투입 포트(110 및 120)는 상부(100)에 고정된 것으로 도시되고, 출구 (140 및 150)을 향하거나 하부(200)에 커플링된 것으로 도시된다. 또한, 접지 탭(230 및 240)은 아래로부터 가장 잘 도시된다. 유체 오리피스(110, 120, 140, 150, 및 160)가 사출 성형된 플라스틱 물질에 형성될 수 있다. 동시에, 구불구불한 구조 및/또는 혼합 채널의 교반기 엘리먼트 및 임의의 혼합 챔버가 또한 일회용품의 적절한 부분에 형성될 수 있다. 접지 스트랩(230 및 240), 및 전극판(220 및 210)을 포함하는, 모든 금속 성분에 대한 위치 지정은 적절한 엘리먼트에서 형성될 수 있다. 사출 성형된 플라스틱은 이러한 성분들 각각에 대한 좌석 공간을 갖는 것이 발견될 수 있다. 금속 부품은 부품들로 직접 성형될 수 있다. 대안적으로, 접착제를 플라스틱 물질에 적용시키고, 금속 구조물을 제자리에 접착시킬 수 있다. 일단 전극판(220)이 하부(200)에 형성되고, 전극판(210)이 상부(100)에 형성되면, 상부 및 하부를 함께 어셈블링할 수 있다. 어셈블리는 레이저 용접, HF 용접, 플라스마 결합, 접착에 의해 고정될 수 있거나 또는 두 개의 플라스틱 부품을 함께 고정하기에 적합한 임의의 다른 기술이 이용될 수 있다.
제작 후에, 배관과 같은 추가 유체 엘리먼트가 2개의 투입 포트(110 및 120), 뿐만 아니라 출구 포트(140, 150, 및 160)에 연결될 수 있다. 뉴매틱 공급원이 배기구(160)에 커플링될 수 있다. 뉴매틱 엘리먼트는 전극 사이의 갭으로 액체를 흡입시키는 역할을 할 수 있다.
전압 공급기(300)가 금속 탭(210 및 220)에 커플링되어, 2개의 전극판(210 및 220) 사이에 전압 전위를 인가할 있다. 그 후 진공이 출구 포트(140 또는 150), 및 이에 의해 또한 채널(130) 및 투입 포트(110), 뿐만 아니라 제2 투입 포트(120)에 가해진다. 유체 익스트림을 혼합 채널(130)에서 혼합시키고, 유체가 공동을 통해, 전극(210 및 220) 사이로 통과하게 한다. 전극 사이의 공간이 채워진 후에, 전기장을 인가할 수 있다. 전기장은 세포막에 기공을 유도하여, 핵산이 확산 또는 전기영동에 의해 표적 세포에 들어가게 한다. 출구 포트(160)를 통한 배출시에, 유체 스트림은 핵산이 부하된 표적 세포를 포함한다. 이것이 일어나는 총 시간은 적용에 따라 다르지만, 약 10 내지 20분일 수 있다. 총 공동 부피는 약 0.05 내지 5 ml일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이미 기재된 일회용품에서 세포의 전기천공을 위한 방법이며, 세포 현탁액을 제1 유체로서 제1 유체 포트에 제공하고, 세포 내로 전기천공되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 유체를 제2 유체로서 제2 유체 포트에 제공하고; 제1 및 제2 유체 포트 및 적어도 하나의 출구 포트 사이에 압력 차이를 가함에 의해 제1 및 제2 유체를 소정의 혼합 비로 유체 구획에 제공하고; 제1 및 제2 전극 사이에 전기장을 인가하여 세포를 적어도 하나의 화합물로 전기천공시키고; 유체를 유체 구획으로부터 제거한다.
본 발명의 방법은 여러 변형예로 수행될 수 있다. 자동 연속 또는 반-연속 처리가 가능하도록, 제1 및 제2 유체를 유체 구획에 소정의 충전 수준으로 제공한다. 유체 구획의 충전 수준은 제1 및 제2 전극 사이의 전기용량을 측정함에 의해, 예를 들어 최대 용량에 도달할 때까지의 전기용량을 측정함에 의해 결정될 수 있다. 또 다른 변형예에서, 충전 수준은 접지 전극(도 3에서 230 및 240) 사이의 저항을 측정함에 의해 결정된다. 더욱이, 충전 수준은 일회용품에 가해지는 압력 차이를 통해 제어될 수 있다.
방법의 또 다른 변형예에서, 유체를 유체 구획으로부터 제거한 후에, 전기천공된 세포를 검출하고 유체로부터 고갈시킨다. 이렇게 농축된 전기천공된 세포는 추가로 처리되고/거나 배양될 수 있다. 전기천공된 세포의 검출 및 이들의 고갈은 FACS 또는 자기 분류와 같이 세포 분류를 위해 당분야 숙련자에게 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 다른 한편으로, 전기천공되지 않은 세포 (전기천공된 세포로부터 고갈된)은 전기천공의 전체 수율을 향상시키기 위해 또 다른 전기천공 공정 단계에 제공될 수 있다.
방법의 또 다른 변형예에서, 전기천공된 세포는 유체를 유체 구획으로부터 제거한 후에 배양된다. 당분야 숙련자에게 공지된 임의의 방법이 배양에 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 배양은 예를 들어 WO2009072003A2 및/또는 WO2013072288 A1에 기재된 대로 원심분리기 챔버에서 수행된다. 본 발명의 이러한 변형예에서, 세포 배양의 분야에 알려진 다양한 세포 배양 액체 (배지)가 이용될 수 있고, 이는 각각 임의로 예컨대 우태아 혈청, 인간 혈청 또는 혈청 대용물 또는 다른 영양소 또는 사이토카인과 같은 세포 자극제가 보충된 배지인 DMEM, HBSS, DPBS, RPMI, Iscove's 배지, X-VIVO™ 중 하나 이상을 포함한다. 배지는 상기 언급된 배지와 같은 표준 세포 배지 또는 예컨대 일차 인간 세포 배양 (예컨대, 내피 세포, 간세포 또는 각질세포에 대한) 또는 줄기 세포 (예컨대, 수지상 세포 성숙, 조혈 증식, 각질세포, 중간엽 줄기 세포 또는 T 세포 증식)를 위한 특수 배지일 수 있다. 배지는 알부민 및 운반 단백질, 아미노산 및 비타민, 항생제, 부착 인자, 성장 인자 및 사이토카인, 호르몬 또는 용해제와 같은 당 분야에 널리 공지된 보충제 또는 시약을 지닐 수 있다. 다양한 배지가 예컨대 LifeTechnologies 또는 Sigma-Aldrich로부터 시판된다.
배양 공정 동안의 온도는 전기천공된 세포 유형에 적절한 경우 제어되고 조정될 수 있다. 더욱이, 적절하고 당분야 숙련자에게 공지된 경우 세포에 O2, N2 및 CO2와 같은 가스가 공급될 수 있다. 세포 배양 단계가 원심분리기 챔버에서 수행되는 경우, 원심분리기 챔버가 회전하는 동안 세포에 세포 배양 액체 및 가스가 공급될 수 있다.
전기천공되는 세포 유형은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 방법을 이용하여, 특히 종양, 혈액, 조직, 골수 또는 세포주와 같은 임의의 포유동물 또는 인간 공급원에서 비롯될 수 있는 진핵생물 세포가 처리될 수 있다. 예를 들어, 인간 세포, 섬유모세포, 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 세포, 각질세포, 멜라닌세포, 중간엽 줄기 세포, 상피 세포, T-세포, 조절성 T-세포, B-세포, NK-세포, 신경 세포, 수지상 세포, 줄기 세포 (성체, 배아, 조혈), 상피에서 비롯된 세포, 외배엽, 내배엽, 내피, 중배엽, 상피 조직, 기저층, 혈관, 결합 조직, 섬유 조직, 근육 조직, 내장 또는 평활근, 골격근, 심근, 신경 조직, 뇌, 척수, 뇌신경, 척수 신경 또는 운동 신경으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 유형이 적합하다.
본 발명의 디바이스 및 방법은 세포의 연속 또는 반-연속 전기천공 방법에 이용될 수 있고, 그 후 임의로 전기천공된 세포의 배양 (증식) 단계가 이어진다. 세포 손실 및/또는 오염을 감소시키기 위해, 밀폐된 (환경에 관해) 시스템이 제안된다. 따라서, 본 발명의 추가 목적은 기재된 바와 같은 일회용품, 세포 현탁액을 함유하는 제1 저장 용기; 세포 내로 전기천공되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 유체를 함유하는 제2 저장 용기; 전기천공된 세포용 제3 저장 용기; 펌프 및/또는 진공 공급원; 및 저장 용기 및 일회용품 사이에 유체 소통수단을 제공하는 배관 세트를 포함하는 세포의 전기천공을 위한 시스템이고, 시스템은 외부 대기에 대해 밀폐된다. 바람직하게는, 제3 저장 용기는 배양 챔버로서 형성된다. 필요한 경우, 고갈되고/풍부화된 세포 분획, 세척 유체, 배양 배지 또는 폐기물을 위한 추가 저장 용기가 제공될 수 있다.
용어 "외부 대기에 대해 밀폐된"이란, 예를 들어 배관 세트로의 기계적 커넥터 (Luer 커넥터와 같이) 및 필요한 경우, 적절한 멸균 필터가 제공된 플라스틱 백과 같은 밀폐된 용기를 저장 용기로서 이용함에 의해, 시스템에 어떤 유체 또는 가스 교환을 배제하도록 구성된 시스템을 의미한다. 공정의 관점에서, 용어 "외부 대기에 대해 밀폐된"은 전기천공의 전체 공정 동안 멸균성을 유지하도록 구성된 시스템을 의미한다.
다양한 설명이 상기 개요된 예시적 구현예와 관련하여 기재되었으나, 다양한 대안, 변형, 변동, 개선, 및/또는 실질적인 등가물이, 공지되거나 존재하거나 또는 현재 예측할 수 없든지 간에, 상기 기재의 검토시에 자명해질 것이다. 더욱이, 특수한 방법, 치수, 물질 용도, 형상, 제작 기법 등과 관련된 자세한 설명은 단지 예시를 위한 것이며, 본 발명은 그러한 구체예로 제한되지 않는다. 상부, 하부, 왼쪽, 오른쪽, 뒤, 앞 등과 같은 설명은 임의적인 것이며, 시스템 및 방법은 모든 방향에서 수행될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 상기 개시된 예시적 구현예는 제한이 아니라 예시를 위한 것이다.
실시예
저항 채널에 의해 정의된 혼합 비
미세유체 채널을 이용한 혼합 비를 결정하기 위해, 세포 현탁액을 모방하는 포스페이트 완충 용액 및 핵산 용액을 모방하는 잉크 용액을 이용하였다. 도 1-7에 도시된 전기천공 카트리지를 진공선을 연결함에 의해 이러한 용액으로 채우고 이렇게 혼합된 용액을 카트리지로부터 다시 제거하였다. 수 회의 충전 단계에 대해, 혼합된 용액을 수집하고 상이한 비율의 완충제 및 잉크를 혼합시켜 결정된 표준 값에 따라 혼합 비를 결정하였다.
샘플 및 표준의 혼합 비를 결정하기 위해, 광학 광도계를 이용하여 잉크의 흡수를 측정하였다. 15 내지 20 ml의 포스페이트 완충 용액을 짧은 튜브에 의해 전기천공 카트리지의 투입 포트(120)에 연결된 백에 충전시켰다. 약 3 내지 4 ml의 잉크 용액으로 충전된 제2 백을 또 다른 짧은 튜브에 의해 전기천공 카트리지의 제2 투입 포트(110)에 연결시켰다. 각 튜브의 유체는 펀치 밸브에 의해 제어되었다. 연동 펌프를 또 다른 튜브를 통해 출구 포트(140)에 연결시켰다. 전기천공 카트리지에 대한 펌프의 연결은 또한 다른 펀치 밸브에 의해 제어될 수 있었다. 제4 튜브를 출구 포트(160) 상에 연결시켜 두 용액의 혼합물을 수집하는데 이용하였다. 배출 유체도 펀치 밸브에 의해 제어되었다. 약 1 ml를 전기천공 카트리지에 충전시키고, 각각의 제거된 혼합물의 흡광도를 측정하였다.
도 8에 도시된 대로, 연동 펌프가 개시될 때 2개의 투입 밸브 및 출구 밸브(140)가 동시에 개방되는 경우 혼합 비가 약 1:7로부터 1:60 이상으로 증가한다. 백 및 투입 튜브의 유체 수준이 감소함에 따라, 정수압 차이가 변화되고 이에 의해, 미세유체 혼합 비가 손상된다 (점선). 연동 펌프가 사전에 낮은 진공을 발생시킨 다음 밸브를 개방했을 때, 본 발명자들은 덜 급격하지만 혼합 비의 증가를 여전히 관찰하였다. 추가로 -100 mbar 미만으로 진공을 증가시켜 1:5.1의 일정한 혼합 비율을 제공하였다.
전기천공
본 발명의 디바이스의 신뢰성을 입증하기 위해, Jurkat 세포의 현탁액을 전기천공시키고, 전기천공 후에, 세포를 유세포분석기에 의해 분석하였다. 결과는 도 9a-g에 도시되며, a) 플라스미드가 없는 대조 전기천공, b) mCherry 플라스미드만을 이용한 대조 전기천공, c) eGFP 플라스미드만을 이용한 대조 전기천공, d) 전기천공 전에 수동으로 혼합된 mCherry 플라스미드 및 eGFP 플라스미드를 이용한 대조 전기천공, e) mCherry 플라스미드와 미리 혼합되고 후속하여 미세유체 혼합 없이 eGFP 플라스미드가 첨가된 전기천공 세포, f) 미세유체 혼합에 의해 첨가된 mCherry 플라스미드 및 eGFP 플라스미드와 미리 혼합된 전기천공 세포이다. 하기는 도 9를 참조한다:
임의의 핵산 없이, 형광성은 검출되지 않았다(a). 세포를 적색 형광 단백질 mCherry를 인코딩하는 플라스미드와 수동으로 혼합시키면, 세포의 약 35%가 적색 형광성에 의해 검출될 수 있는 바와 같은 적색 형광 단백질을 발현시킨다. 세포를 녹색 형광 단백질 GFP를 인코딩하는 플라스미드와 혼합시키면, 세포의 약 44%가 녹색 형광성에 검출될 수 있는 바와 같은 녹색 형광 단백질을 발현시킨다. 둘 모두의 플라스미드를 세포 현탁액과 수동으로 혼합시키면, 전기천공된 세포는 적색 및 녹색 형광을 발광시킨다. 적색 형광 단백질 mCherry를 인코딩하는 플라스미드를 지닌 세포를 수동으로 혼합시키고 짧은 튜브에 의해 전기천공 카트리지의 투입 포트(120)에 연결된 백에 적용시켰다. 녹색 형광 단백질 GFP를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 용액으로 충전된 제2 백을 또 다른 짧은 튜브에 의해 전기천공 카트리지의 제2 투입 포트(110)에 연결시켰다. 각각의 튜브의 유체를 펀치 밸브에 의해 제어하였다. 연동 펌프를 또 다른 튜브를 통해 출구 포트(140)에 연결시켰다. 전기천공 카트리지에 대한 펌프의 연결은 또한 다른 펀치 밸브에 의해 제어될 수 있었다. 출구 포트(160) 상에 연결된 제4 튜브를 이용하여 두 용액의 혼합물을 수집하였다. 배출 유체도 펀치 밸브에 의해 제어되었다. 약 0.8 ml의 세포 현탁액을 전기천공 카트리지에 충전시킨 다음 약 0.2 ml의 핵산을 충전시켰다. 그 후 전기 펄스를 인가하였다. 전기천공 후에, 세포 현탁액을 수집하고, 세포를 유세포분석법에 의해 분석하였다.
도 9e에서 볼 수 있는 바와 같이, 두 형광 단백질을 발현시키는 세포 외에, 약 7%가 적색 형광 단백질만을 발현시킨다. 이러한 세포는 녹색 형광 단백질 인코딩 플라스미드와 잘 혼합되지 않았다. 다음으로, 사용된 세포를 적색 형광 단백질 mCherry를 인코딩하는 플라스미드와 수동으로 혼합시키고 이러한 혼합물을 짧은 튜브에 의해 전기천공 카트리지의 투입 포트(120)에 연결된 백에 적용시켰다. 녹색 형광 단백질 GFP를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 용액으로 충전된 제2 백을 또 다른 짧은 튜브에 의해 전기천공 카트리지의 제2 투입 포트(110)에 연결시켰다. 각 튜브의 유체는 펀치 밸브에 의해 제어되었다. 연동 펌프를 또 다른 튜브를 통해 출구 포트(140)에 연결시켰다. 전기천공 카트리지에 대한 펌프의 연결은 또한 다른 펀치 밸브에 의해 제어될 수 있었다. 출구 포트(160) 상에 연결된 제4 튜브를 이용하여 두 용액의 혼합물을 수집하였다. 배출 유체도 펀치 밸브에 의해 제어되었다. 약 1 ml를 미세유체 혼합 채널 및 미세유체 혼합 엘리먼트(130)를 이용하여 전기천공 카트리지에 충전시켰다. 그 후 전기 펄스를 인가하였다. 전기천공 후에, 세포 현탁액을 수집하고, 세포를 유세포분석법에 의해 분석하였다. 도 9f는 전기천공된 세포가 두 형광 단백질 모두를 발현시킴을 보여주는데, 이는 세포와 녹색 형광 단백질 인코딩 플라스미드의 핵산 용액의 균질한 혼합을 나타낸다.

Claims (15)

  1. 세포의 전기천공을 위한 일회용품으로서,
    일회용품의 내부의 유체 구획;
    세포 현탁액을 유체 구획에 제공하기 위한 제1 유체 포트, 및 세포 내로 전기천공되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 유체를 유체 구획에 전달하기 위한 제2 유체 포트;
    유체 구획 내에 배치된 제1 전극 및 제2 전극;
    유체 구획으로부터 유체를 전달하는 적어도 하나의 출구 포트; 및
    제1 유체 포트로부터의 세포 현탁액과 제2 유체 포트로부터의 세포 내로 전기천공되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 유체를 혼합하기 위한, 일회용품의 내부의 혼합 채널을 포함하고,
    제1 및 제2 유체 포트가 혼합 채널에 대한 유체 소통수단을 갖고 혼합 채널이 유체 구획에 대한 유체 소통수단을 갖는, 일회용품.
  2. 제 1항에 있어서, 혼합 채널이 구불구불한 형상을 지니며/거나 교반기 엘리먼트 또는 혼합 챔버를 포함하는 일회용품.
  3. 제 1항에 있어서, 제1 유체 포트 및 제2 유체 포트에 유체에 대한 상이한 미세유체 저항을 갖는 채널이 제공되는 일회용품.
  4. 제 3항에 있어서, 제1 유체 포트 및 제2 유체 포트에 제1 유체 대 제2 유체의 혼합 비를 1:5 내지 내지 1:10으로 유지하는 미세유체 저항을 갖는 채널들이 제공되는 일회용품.
  5. 제 1항에 있어서, 제1 유체 포트 및 제2 유체 포트가 유체를 제1 유체 포트 및 제2 유체 포트로부터 유체 구획으로 전달하는 적어도 하나의 펌프와 유체 소통하는 일회용품.
  6. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 출구 포트가 적어도 하나의 진공 공급원과 유체 소통하여, 유체를 제1 유체 포트 및 제2 유체 포트로부터 유체 구획으로 흡입시키는 일회용품.
  7. 제 1항에 있어서, 혼합 채널 및 적어도 하나의 출구 포트가 유체 구획의 가장 반대편에 위치하여, 유체에 의한 유체 구획의 거품-없는 충전을 가능하게 하는 일회용품.
  8. 제 1항에 있어서, 제1 유체 포트, 제2 유체 포트 또는 출구 포트 중 적어도 하나에 접지 전위를 가하는 적어도 하나의 추가 전극을 추가로 포함하는 일회용품.
  9. 제 1항에 있어서, 제1 금속 전극 및 제2 금속 전극이 금의 층으로 덮인 티타늄을 포함하는 일회용품.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 일회용품에서 세포의 전기천공을 위한 방법으로서, 세포 현탁액을 제1 유체로서 제1 유체 포트에 제공하고, 세포 내로 전기천공되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 유체를 제2 유체로서 제2 유체 포트에 제공하고; 제1 및 제2 유체 포트 및 적어도 하나의 출구 포트 사이에 압력 차이를 가함에 의해 제1 및 제2 유체를 소정의 혼합 비로 유체 구획에 제공하고; 제1 및 제2 전극 사이에 전기장을 인가하여 세포를 적어도 하나의 화합물로 전기천공시키고; 유체를 유체 구획으로부터 제거하는, 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 제1 및 제2 유체를 유체 구획에 소정의 충전 수준으로 제공하고; 유체 구획의 충전 수준이 제1 및 제2 전극 사이의 전기용량을 측정함에 의해 결정되는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 유체를 유체 구획으로부터 제거한 후에, 전기천공된 세포를 검출하고 유체로부터 고갈시키는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 유체를 유체 구획으로부터 제거한 후에, 전기천공된 세포를 배양하는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 일회용품, 세포 현탁액을 함유하는 제1 저장 용기; 세포 내로 전기천공되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 유체를 함유하는 제2 저장 용기; 전기천공된 세포용 제3 저장 용기; 펌프 및/또는 진공 공급원; 및 저장 용기 및 일회용품 사이에 유체 소통수단을 제공하는 배관 세트를 포함하는 세포의 전기천공을 위한 시스템으로서, 시스템이 외부 대기에 대해 밀폐된, 시스템.
  15. 제 14항에 있어서, 제3 저장 용기가 배양 챔버로서 형성된 시스템.
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