IT202000027290A1 - Bioreattore, apparato e procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili - Google Patents

Bioreattore, apparato e procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili Download PDF

Info

Publication number
IT202000027290A1
IT202000027290A1 IT102020000027290A IT202000027290A IT202000027290A1 IT 202000027290 A1 IT202000027290 A1 IT 202000027290A1 IT 102020000027290 A IT102020000027290 A IT 102020000027290A IT 202000027290 A IT202000027290 A IT 202000027290A IT 202000027290 A1 IT202000027290 A1 IT 202000027290A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
bioreactor
culture
culture medium
tissue
fragments
Prior art date
Application number
IT102020000027290A
Other languages
English (en)
Inventor
Gerardo Catapano
Roberto Gualtieri
Riccardo Talevi
Original Assignee
Gerardo Catapano
Roberto Gualtieri
Riccardo Talevi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gerardo Catapano, Roberto Gualtieri, Riccardo Talevi filed Critical Gerardo Catapano
Priority to IT102020000027290A priority Critical patent/IT202000027290A1/it
Priority to PCT/IB2021/060556 priority patent/WO2022101874A1/en
Priority to US18/037,019 priority patent/US20230416685A1/en
Priority to EP21830328.7A priority patent/EP4244332A1/en
Publication of IT202000027290A1 publication Critical patent/IT202000027290A1/it

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C12M25/04—Membranes; Filters in combination with well or multiwell plates, i.e. culture inserts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C12M41/16—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature by recirculation of culture medium at controlled temperature

Description

Descrizione di Brevetto di Invenzione Industriale avente per titolo: ?BIOREATTORE, APPARATO E PROCEDIMENTO PER LA COLTURA IN VITRO DI TESSUTI RIPRODUTTIVI, E SIMILI?.
CAMPO TECNICO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un bioreattore, un apparato e un procedimento per la coltura in vitro di frammenti di tessuti riproduttivi come i tessuti ovarici, i tessuti endometriali e simili.
Il bioreattore, l?apparato e il procedimento possono essere utilizzati per una vasta gamma di colture di frammenti, incluso, ma non limitato a, tessuti ovarici, tessuti endometriali umani oppure animali, freschi o crioconservati.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
Sono note varie tipologie di bioreattori per la coltura in vitro di cellule e frammenti di tessuti, umani ma non solo.
Alcuni di tali bioreattori sono del tipo cosiddetto a perfusione.
Essi comprendono, tipicamente, una camera di coltura aperta su due lati contrapposti, in corrispondenza dei quali sono previste, rispettivamente, un?apertura di ingresso ed un?apertura di uscita di un mezzo di coltura liquido. Quest?ultima ha la funzione di consentire la coltura del tessuto in ambiente controllato, e di perfondere i tessuti con le opportune sostanze nutritive e stimoli biochimici necessari per la loro crescita.
All?interno della camera di coltura ? presente un cosiddetto scaffold tissutale, cio? una struttura atta ad alloggiare i tessuti in coltura.
Si tratta solitamente di una struttura di geometria molto complessa, cio? una sorta di impalcatura spesso tridimensionale, che pu? essere di varia natura chimicofisica, e che sostiene meccanicamente l?architettura cellulare o i frammenti di tessuto.
Nelle applicazioni pi? tipiche, tali scaffold sono realizzati in materiale poroso polimerico biocompatibile.
Normalmente il bioreattore ? inserito, nell?ambito di un circuito chiuso, all?interno di un apposito impianto di alimentazione del mezzo di coltura.
In particolare, l?apertura di ingresso e l?apertura di uscita del bioreattore sono collegate a rispettivi tratti di condotto del suddetto impianto di alimentazione.
Pertanto, all?interno della camera di coltura del bioreattore, il mezzo di coltura entra e fluisce intorno o attraverso i frammenti di tessuto o lo scaffold, cos? da perfondere di liquido, in modo capillare, le cellule contenute all?interno dei frammenti di tessuto o dello scaffold, per poi abbandonare il bioreattore; si realizza cos? una circolazione continua che garantisce un costante ricambio di liquido e di specie disciolte in esso presenti.
I bioreattori a perfusione descritti sono utilizzati molto frequentemente per la coltura di determinate tipologie di cellule o tessuti, come ad esempio quelli di osso, ma non solo; in queste ultime applicazioni, tali bioreattori consentono di ottenere risultati abbastanza soddisfacenti.
Tuttavia, si ? osservato che, in colture di differenti e specifiche tipologie di cellule, i bioreattori congegnati in questo modo sono perfezionabili da molti punti di vista. Ad esempio, nell?ambito di applicazioni per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, come il tessuto ovarico o endometriale, oppure applicazioni per l?attivazione del tessuto in vitro seguita da impianto/trapianto in vivo, oppure ancora ulteriori applicazioni quali quelle per lo studio delle interazioni fra l?endometrio e l?embrione in vitro, e per la valutazione in vitro della tossicit? di sostanze biologiche, chimiche e di farmaci, i bioreattori disponibili aventi le caratteristiche precedentemente descritte non sono giudicati pienamente soddisfacenti.
In particolare, i suddetti bioreattori hanno mostrato carenze nella perfusione e trasferimento delle sostanze nutritive e dell?ossigeno disciolto alle cellule contenute nei frammenti di tessuto o nello scaffold, ed anche in relazione alla possibilit? di controllare, in modo preciso e dettagliato, l?evoluzione della crescita dei tessuti all?interno del frammento o dello scaffold medesimo.
SCOPI DELL?INVENZIONE
Il compito tecnico della presente invenzione ? quindi quello di migliorare lo stato della tecnica nel settore della coltura in vitro dei tessuti riproduttivi, come i tessuti ovarici, i tessuti endometriali e simili.
Nell?ambito di tale compito tecnico, costituisce uno scopo della presente invenzione mettere a punto un bioreattore, un apparato ed un procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi e simili che consentano di superare gli inconvenienti precedentemente lamentati.
Un altro scopo della presente invenzione ? realizzare un bioreattore, un apparato ed un procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili, maggiormente efficienti per quanto riguarda la perfusione e il trasferimento controllato delle sostanze nutritive e dell?ossigeno disciolto nel mezzo di coltura e di stimoli biomeccanici ai tessuti in coltura.
Ancora uno scopo della presente invenzione ? rendere disponibili un bioreattore un apparato ed un procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili, migliorati e perfezionati in relazione alla possibilit? di controllare, in modo preciso ed accurato, l?evoluzione della crescita dei tessuti in coltura.
Un ulteriore scopo della presente invenzione ? mettere a punto un bioreattore, un apparato ed un procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili, costruttivamente semplici ed economici.
Un altro scopo della presente invenzione ? quello di realizzare un bioreattore, un apparato ed un procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili, di utilizzo semplice, pratico ed efficace.
Tale compito e tali scopi sono tutti raggiunti da un bioreattore per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili, secondo la allegata rivendicazione 1.
Il bioreattore comprende un primo componente ed un secondo componente, reciprocamente collegati, che definiscono tra loro almeno una camera di coltura. Il primo componente comprende una porta di ingresso per introdurre un mezzo di coltura all?interno della camera di coltura, mentre il secondo componente comprende una porta di uscita, per consentire l?uscita del mezzo di coltura dalla camera di coltura.
Inoltre, il bioreattore comprende almeno un supporto poroso, previsto all?interno della camera di coltura, atto a supportare meccanicamente dei frammenti di tessuto riproduttivo, ed eventualmente degli schermi, posizionati sopra, e sotto, i frammenti di tessuto riproduttivo, con riferimento alla posizione d?uso verticale, o sostanzialmente verticale, del bioreattore.
Gli schermi hanno la funzione, insieme al supporto poroso, di mantenere i frammenti di tessuto riproduttivo, in modo sicuro, in rispettive posizioni controllate, cos? da poter regolare con precisione la velocit?, e la distribuzione nella camera, del mezzo di coltura che li lambisce, nonch? l?applicazione degli stimoli meccanici direttamente o indirettamente applicati ai tessuti.
Questa soluzione consente di incrementare notevolmente l?efficienza del bioreattore in relazione alla perfusione delle sostanze nutritive ai tessuti in coltura, rispetto alle soluzioni attualmente note.
Inoltre, i frammenti di tessuto, mantenuti nelle rispettive corrette posizioni di coltura ma comunque nelle loro superfici, possono essere pi? facilmente ed agevolmente controllati nella loro evoluzione.
Tale compito e tali scopi sono, inoltre, tutti raggiunti da un apparato per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili, secondo la allegata rivendicazione 9.
L?apparato comprende almeno un bioreattore, secondo la presente invenzione, ed un circuito per la circolazione di un mezzo di coltura all?interno del bioreattore, ed almeno una pompa, montata lungo il suddetto circuito, atta ad attivare la circolazione del mezzo di coltura all?interno del bioreattore.
L?apparato comprende, altres?, almeno un serbatoio, che contiene il mezzo di coltura, installato lungo il suddetto circuito, ed almeno uno scambiatore di gas, installato lungo il circuito, atto a consentire un efficace scambio di gas con il mezzo di coltura.
Tale compito e tali scopi sono, altres?, tutti raggiunti da un procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili, secondo la allegata rivendicazione 12.
Il procedimento comprende le fasi di fornire un apparato, per la coltura in vitro di frammenti di tessuti riproduttivi, secondo la presente invenzione, comprendente, a sua volta, almeno un bioreattore come precedentemente descritto.
Il procedimento comprende, inoltre, una fase in cui dei frammenti di tessuto riproduttivo sono inseriti all?interno della camera di coltura del bioreattore, posizionandoli sul supporto poroso, interposto tra il primo schermo ed il secondo schermo, a reciproche prefissate distanze.
Il procedimento comprende poi una fase di avviamento dell?apparato, in cui si alimenta il bioreattore con il mezzo di coltura, in modo che questo fluisca all?interno della camera di coltura, e lambisca, in modo controllato, le superfici dei frammenti di tessuto riproduttivo, mentre questo ? eventualmente soggetto a stimoli biomeccanici diretti per interazione con i componenti del bioreattore.
Cos? facendo, ed in particolare grazie al posizionamento dei frammenti di tessuto tra i due schermi del bioreattore, si ottiene una elevata efficienza degli stimoli biomeccanici diretti e fluidodinamici, e nella perfusione delle sostanze nutritive e dei gas, nel mezzo di coltura, e nel trasferimento/somministrazione di questi ultimi ai tessuti.
Nel medesimo tempo, le superfici libere dei frammenti di tessuto, all?interno della camera di coltura, consentono di modulare la crescita e l?evoluzione dei tessuti medesimi durante il periodo di coltura.
Le rivendicazioni dipendenti si riferiscono a forme di attuazione preferite e vantaggiose dell?invenzione.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI.
Questi ed ulteriori vantaggi saranno meglio compresi da ogni tecnico del ramo dalla descrizione che segue e dagli annessi disegni, dati quale esempio non limitativo, nei quali:
la figura 1 ? una vista schematica di un apparato per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi secondo la presente invenzione;
la figura 2 ? una vista schematica di un'altra versione di un apparato per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi secondo la presente invenzione, simile a quello di figura 1 ma privo di incubatore;
la figura 3 ? una vista schematica di un?altra versione dell?apparato secondo l?invenzione, comprendente una differente versione del bioreattore;
la figura 4 ? una vista schematica di un?ulteriore versione dell?apparato secondo l?invenzione, con ricircolazione parziale del mezzo di coltura;
la figura 5 ? una vista schematica di ancora un?altra versione dell?apparato secondo l?invenzione, anche questa con ricircolazione parziale del mezzo di coltura; la figura 6 ? una vista schematica di un?altra versione dell?apparato secondo l?invenzione, simile a quello di figura 3 ma privo di incubatore;
la figura 7 ? una vista assonometrica in esploso di un bioreattore che fa parte delle versioni degli apparati di cui alle figure 1,2; e
la figura 8 ? una vista assonometrica in esploso di un'altra versione di bioreattore, che fa parte dell?apparato di cui alle figure 3-6.
FORME DI ATTUAZIONE DELL?INVENZIONE.
Con riferimento alla figura 1, ? indicato complessivamente con il numero di riferimento 1 una versione di un apparato per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi secondo la presente invenzione.
Nella figura 1, l?apparato 1 ? rappresentato in modo schematico, con indicazione dei componenti essenziali.
Nella versione dell?invenzione della figura 1, l?apparato 1 comprende un incubatore 2.
Come meglio chiarito in seguito, la presenza dell?incubatore 2 ? opzionale all?interno dell?apparato 1.
L?incubatore 2 comprende una camera 3; la camera 3 ? termicamente coibentata. Inoltre, la camera 3 ? provvista di un riscaldatore regolabile e di un controllore della pressione parziale di ossigeno e anidride carbonica in fase gas 4, che la mantiene ad una temperatura ed a concentrazioni di ossigeno ed anidride carbonica nel mezzo di coltura ottimali per la coltura in vitro secondo la presente invenzione. Secondo un aspetto dell?invenzione, l?apparato 1 comprende un bioreattore 5; il bioreattore 5 si trova all?interno della camera 3 coibentata dell?incubatore 2.
L?apparato 1 comprende, inoltre, un circuito 6 per la circolazione di un mezzo di coltura M all?interno del bioreattore 5, ed almeno una pompa 7, montata lungo il circuito 6, atta ad attivare la suddetta circolazione del mezzo di coltura M all?interno del bioreattore 5, tramite il suddetto circuito 6.
L?apparato 1 comprende, altres?, almeno un serbatoio 8, che contiene il mezzo di coltura M.
Il serbatoio 8 ? installato lungo il circuito 6, il quale consente la circolazione del mezzo di coltura M all?interno del bioreattore 5.
Pi? in dettaglio, il circuito 6 comprende un condotto di invio 6a del mezzo di coltura verso il bioreattore 5, lungo il quale ? installata la pompa 7, che preleva il mezzo di coltura M stesso dal serbatoio 8.
Inoltre, il circuito 6 comprende un condotto di ritorno 6b, che convoglia il mezzo di coltura M, proveniente dal bioreattore 5, all?interno del serbatoio 8.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, l?apparato 1 comprende un dispositivo scambiatore di gas 9, installato lungo il circuito 6.
Lo scambiatore 9 ? atto a consentire lo scambio di gas (ad esempio, ma non limitatamente, ossigeno o anidride carbonica) con il mezzo di coltura M.
In una forma di attuazione preferita dell?invenzione, lo scambiatore 9 comprende (o ? costituito da) un tubo permeabile, che consente di somministrare, al mezzo di coltura M, l?ossigeno gassoso dell?ambiente all?interno della camera 3 dell?incubatore 2.
Il bioreattore 5 ? mostrato nel dettaglio di figura 7 ? comprende un primo componente 10 ed un secondo componente 11, reciprocamente collegati, che definiscono tra loro almeno una camera di coltura 12.
Nella camera di coltura 12, frammenti F di tessuto riproduttivo possono essere coltivati in comune, in posizioni controllate.
Il bioreattore 5 comprende, inoltre, almeno un supporto poroso 13, previsto all?interno della camera di coltura 12.
Il supporto poroso 13 ? atto a supportare i frammenti F di tessuto riproduttivo all?interno della camera di coltura 12, consentendo, nel medesimo tempo, il corretto flusso del mezzo di coltura M all?interno del bioreattore 5.
Il bioreattore 5 comprende, inoltre, degli schermi 14,15, previsti all?interno della camera di coltura 12.
Gli schermi 14,15 sono posizionati sopra, e sotto, i frammenti F di tessuto riproduttivo, con riferimento alla posizione d?uso verticale, o sostanzialmente verticale, del bioreattore 5, mostrata in figura 1.
Pi? in dettaglio, il bioreattore 5 comprende un primo schermo 14, atto ad essere posizionato sotto ai frammenti F di tessuto riproduttivo (e quindi sopra al supporto poroso 13).
Inoltre, il bioreattore 5 comprende un secondo schermo 15, atto ad essere posizionato sopra i frammenti F di tessuto riproduttivo.
Gli schermi 14,15 hanno la funzione di mantenere i frammenti F di tessuto riproduttivo in rispettive posizioni controllate, e/o di equalizzare spazialmente la velocit? del mezzo di coltura M fluido che fluisce attraverso la camera di coltura 12, e/o di esercitare un?azione di stimolo biomeccanico sul tessuto.
Il primo schermo 14 e/o il secondo schermo 15 possono essere realizzati utilizzando delle fibre cave, nelle quali scorre un liquido di riscaldamento o raffreddamento per scambiare calore e controllare la temperatura del terreno di coltura all?interno del bioreattore 5.
In alternativa, o in combinazione con quest?ultima soluzione, il primo schermo 14 e/o il secondo schermo 15 possono essere realizzati utilizzando delle fibre cave permeabili ai gas, nei quali scorre un gas contenente concentrazioni prefissate di ossigeno gassoso e anidride carbonica, per scambiare questi ultimi gas e controllare le loro concentrazioni disciolte nel terreno di coltura all?interno del bioreattore 5. Si precisa, altres?, che gli schermi 14,15 sono conformati e configurati in modo da mantenere una pluralit? di frammenti F di tessuto riproduttivo, all?interno della camera di coltura 12, in rispettive posizioni spaziali prefissate, e ad opportune distanze reciproche, che consentono:
un flusso controllato del mezzo di coltura M attorno a ciascun frammento F; l?applicazione di forze fluido/meccaniche controllate, che agiscono sulle superfici esterne dei suddetti frammenti F di tessuto;
per ogni frammento F, la condivisione, con gli altri frammenti F, del contenuto del mezzo di coltura M ed i sottoprodotti metabolici dei tessuti, in qualsiasi stadio di maturazione e crescita dei tessuti stessi.
Il supporto poroso 13, il primo schermo 14 ed il secondo schermo 15 sono serrati a pacco tra il primo componente 10 ed il secondo componente 11, con interposizione di due o pi? guarnizioni 16 di tenuta, ad esempio del tipo ad O-ring, o di altro tipo simile.
Il primo componente 10 pu? essere realizzato in qualsiasi materiale, ad esempio un polimero, metallo, ceramica o altri idonei materiali ancora.
Il primo componente 10 comprende una porta di ingresso 17, per introdurre il mezzo di coltura M all?interno del bioreattore 5, in particolare all?interno della camera di coltura 12.
La porta di ingresso 17 pu? avere qualsiasi geometria e/o posizione.
Inoltre, il primo componente 10 pu? comprendere almeno un distributore di flusso, di qualsiasi geometria e/o materiale, che pu? presentare delle scanalature, o simili, per incanalare il flusso del mezzo di coltura M.
Il secondo componente 11 pu? essere realizzato in qualsiasi materiale, ad esempio un polimero, metallo, ceramica, o altri idonei materiali ancora.
Il secondo componente 11 comprende una porta di uscita 18, per consentire l?uscita del mezzo di coltura M dal bioreattore 5 (in particolare dalla camera di coltura 12). La porta di uscita 18 pu? avere qualsiasi geometria e/o posizione.
Inoltre, il secondo componente 11 pu? comprendere almeno un collettore per il flusso del mezzo di coltura M verso la porta di uscita 18; il collettore pu? comprendere scanalature, o altri simili elementi.
Il primo componente 10 ed il secondo componente 11 sono reciprocamente associati tramite dei mezzi di collegamento 19.
I suddetti mezzi di collegamento 19 sono, preferibilmente, di tipo risolvibile, in modo da poter separare agevolmente, quando necessario, il primo componente 10 dal secondo componente 11.
Tipicamente, pu? essere necessario separare il primo componente 10 dal secondo componente 11 per inserire i frammenti F di tessuto riproduttivo all?interno della camera di coltura 12, oppure per rimuoverli dalla stessa.
I mezzi di collegamento 19 possono essere del tipo a vite, a baionetta, o simili, senza particolari limitazioni.
Ad esempio, i mezzi di collegamento 19 possono comprendere una filettatura esterna 20 realizzata nel primo componente 10, ed una madrevite realizzata nel secondo componente 21, o viceversa.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione, il bioreattore 5 comprende uno o pi? attuatori, previsti all?interno della camera di coltura 12.
I suddetti attuatori hanno, principalmente, la funzione di sollecitare, passivamente o attivamente, i frammenti F di tessuto riproduttivo, durante la coltura, con sollecitazioni fluidiche e/o meccaniche controllate, incluse (ma non in modo limitativo) le sollecitazioni di compressione o di trazione.
L?uno o pi? attuatori previsti all?interno della camera di coltura 12 possono essere di qualsiasi tipologia idonea a questo tipo di applicazione, senza particolari limitazioni.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, il primo componente 10, oppure il secondo componente 11, oppure entrambi, sono provvisti di mezzi di scambio termico e di controllo della temperatura del bioreattore 5.
Tali mezzi di scambio termico e di controllo della temperatura possono comprendere, ad esempio, una camicia, che contiene il bioreattore 5, all?interno della quale fluisce un fluido di riscaldamento/raffreddamento, e/o una cella di Peltier, o altri simili dispositivi.
Nella figura 2 ? mostrata, sempre in modo schematico, un?altra forma di attuazione dell?apparato 1 per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi secondo la presente invenzione.
Questa forma di attuazione differisce da quella della figura 1 per il fatto che l?apparato 1 ? privo di incubatore.
Si sopperisce all?assenza dell?incubatore grazie al fatto che l?apparato 1 comprende uno scambiatore di calore 30.
Lo scambiatore di calore 30 ? inserito lungo il circuito 6 di circolazione del mezzo di coltura M.
Pi? in dettaglio, lo scambiatore di calore 30 ? inserito, lungo il condotto di invio 6a, immediatamente a valle dello scambiatore di gas 9, con riferimento al flusso di circolazione del mezzo di coltura M.
Lo scambiatore di calore 30 provvede a mantenere la temperatura del mezzo di coltura M in un prefissato ambito di funzionamento ottimale.
In questa forma di attuazione dell?apparato 1 lo scambiatore di gas 9, ad esempio ma non limitatamente, ? uno scambiatore di gas a membrane capillari cave per l?ossigenazione del sangue, che consente di somministrare al mezzo di coltura M l?ossigeno gassoso alimentato al comparto gas dello scambiatore mediante, ma non limitatamente, una bombola a gas compresso.
Grazie a questo accorgimento l?incubatore 2 ed il relativo riscaldatore regolabile 4, descritti nella precedente forma di attuazione, divengono superflui.
Lo scambiatore di calore 30 pu? essere di qualsiasi tipologia idonea a questo tipo di applicazione (preferibilmente di tipo coibentato).
Anche il bioreattore 5 deve essere adeguatamente coibentato.
Nella figura 3 ? mostrata, sempre in modo schematico, un?altra versione dell?apparato 1 per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi secondo la presente invenzione.
Questa versione differisce da quella della figura 1 per la conformazione del bioreattore 5.
Il bioreattore 5 di questa versione dell?invenzione ? mostrato nella figura 8.
Pi? in dettaglio, in questa versione dell?invenzione, rispetto a quelle precedentemente descritte, ? differente la conformazione e configurazione del primo componente 10 e del secondo componente 11 del bioreattore 5, ed inoltre la conformazione e configurazione dei mezzi di collegamento 19.
Infatti, in questa versione il primo componente 10 ed il secondo componente 11 hanno, entrambi, conformazione sostanzialmente discoidale.
Il primo componente 10 comprende, al centro, la porta di ingresso 17 per il mezzo di coltura M.
I mezzi di collegamento 19 comprendono, nel primo componente 10, una pluralit? di fori passanti 22, previsti sostanzialmente alla periferia del primo componente 10 stesso (ad esempio, sono previsti tre fori passanti 22).
Il secondo componente 11 comprende, al centro, la porta di uscita 18 per il mezzo di coltura M.
Inoltre, i mezzi di collegamento 19 comprendono, nel secondo componente 11, una pluralit? di fori filettati 23, previsti sostanzialmente alla periferia del secondo componente 11 stesso (ad esempio, sono previsti tre fori filettati 23).
I mezzi di collegamento 19 comprendono, altres?, delle viti 24, che si impegnano nei fori passanti 22 del primo componente 10, e nei corrispondenti fori filettati 23 del secondo componente 11.
In alternativa, le viti 24 possono impegnarsi in fori passanti (realizzati in luogo dei fori filettati 23) del secondo componente 11; la tenuta tra il primo componente 10 ed il secondo componente 11 ? assicurata mediante dei dadi e delle eventuali rondelle di bloccaggio.
? cos? possibile vincolare il primo componente 10 ed il secondo componente 11 l?uno all?altro in modo rimuovibile, per poter accedere alla camera di coltura 12 in caso di necessit?.
Il primo componente 10 ed il secondo componente 11 comprendono, inoltre, delle rispettive sedi 25, realizzate nelle rispettive facce, in uso, interne, per alloggiare la piastra di supporto perforata 13, il primo schermo 14, il secondo schermo 15, e l?una o pi? guarnizioni 16 di tenuta.
Grazie alla presenza di tali sedi 25, che alloggiano tutti i componenti interni del bioreattore 5, le facce interne del primo componente 10 e del secondo componente 11 combaciano perfettamente, in configurazione assemblata.
Questa versione del bioreattore 5, rispetto a quelle precedentemente descritte, presenta diverse caratteristiche principalmente per quanto riguarda la separazione del primo componente 10 dal secondo componente 11, che pu? avvenire senza ruotare l?uno rispetto all?altro, ma soltanto rimuovendo le viti 24.
Ci? pu? essere vantaggioso in determinate configurazioni del circuito 6, ad esempio se non ? possibile rimuovere i condotti 6a,6b, oppure se non si vuole esercitare una torsione sugli stessi per separare i due componenti 10,11.
Un?altra forma di attuazione dell?apparato 1 per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi secondo la presente invenzione ? illustrata schematicamente nella figura 4.
Questa forma di attuazione differisce da quella illustrata nella figura 3 per il fatto che la ricircolazione del mezzo di coltura M nel circuito 6 ? parziale, anzich? completa, come avviene, invece, nelle versioni delle figure 1-3.
L?obiettivo della realizzazione di una ricircolazione parziale, anzich? completa, ? quello di garantire l?alimentazione continua, lungo il circuito 6, di una determinata portata di un mezzo di coltura fresco M1, e di modulare la distribuzione della materia nel bioreattore.
A questo scopo, l?apparato 1 secondo questa versione comprende un serbatoio supplementare 31, che contiene, appunto, un mezzo di coltura fresco M1.
Inoltre, l?apparato 1 comprende un circuito supplementare 32 che alimenta una determinata portata del mezzo di coltura fresco M1 al circuito 6 principale.
Pi? in dettaglio, il circuito supplementare 32 sfocia in un apposito raccordo 33, previsto lungo il condotto di invio 6a, a monte della pompa 7.
Lungo il circuito supplementare 32 ? prevista inoltre una pompa supplementare 34, che provvede al prelievo del mezzo di coltura fresco M1 dal serbatoio supplementare 31.
Secondo un aspetto dell?invenzione, per una determinata portata di mezzo di coltura fresco M1 che viene alimentata nel circuito 6, una pari portata di mezzo di coltura M esausto viene eliminata dal circuito 6 medesimo.
In particolare, la portata di mezzo di coltura M esausto viene eliminata tramite un condotto di espulsione 35.
Il condotto di espulsione 35 ? previsto in corrispondenza della porta di uscita 18 del bioreattore 5 (ad esempio, esso pu? essere collegato ad un raccordo previsto lungo il condotto di ritorno 6b del circuito 6).
Un?altra forma di attuazione dell?apparato 1 per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi secondo la presente invenzione ? illustrata schematicamente nella figura 5.
Questa forma di attuazione differisce da quella della precedente figura 4 per il fatto che l?apparato 1 comprende una seconda pompa supplementare 36, per l?eliminazione del mezzo di coltura esausto M.
La seconda pompa supplementare 36 ? installata lungo il condotto di espulsione 35; essa consente di eliminare la prefissata portata del mezzo di coltura esausto M in modo rapido ed efficace, evitando cos? che si formino accidentali otturazioni o altre problematiche di deflusso lungo il condotto di espulsione 35.
Un?altra forma di attuazione dell?apparato 1 per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi secondo la presente invenzione ? illustrata schematicamente nella figura 6.
Questa forma di attuazione dell?invenzione differisce da quella illustrata nella figura 3 ? e cos? come descritto a proposito della forma di attuazione di figura 2 ? per il fatto che l?apparato 1 ? privo di incubatore.
Anche in questo caso, si sopperisce all?assenza dell?incubatore grazie al fatto che l?apparato 1 ? completamente coibentato, e comprende uno scambiatore di calore 30, inserito lungo il circuito 6 di circolazione del mezzo di coltura M.
Lo scambiatore di calore 30 ? inserito, lungo il condotto di invio 6a, immediatamente a valle dello scambiatore di gas 9, con riferimento al flusso di circolazione del mezzo di coltura M.
Lo scambiatore di calore 30 provvede a mantenere la temperatura del mezzo di coltura M in un prefissato ambito di funzionamento ottimale.
In questa forma di attuazione dell?apparato 1, lo scambiatore di gas 9, ad esempio ma non limitatamente, ? uno scambiatore di gas a membrane capillari cave per l?ossigenazione del sangue, che consente di somministrare al mezzo di coltura M l?ossigeno gassoso alimentato al comparto gas dello scambiatore mediante, ma non limitatamente, una bombola a gas compresso.
Ci? consente di eliminare la necessit? dell?incubatore 2; lo scambiatore di calore 30 pu? essere di qualsiasi tipologia idonea a questo tipo di applicazione.
Forma oggetto della presente invenzione anche un procedimento per la coltura in vitro di frammenti di tessuti riproduttivi.
Il procedimento comprende una fase di fornire un apparato 1 per la coltura in vitro di frammenti F di tessuti riproduttivi, avente le caratteristiche precedentemente descritte (in una qualsiasi delle forme di attuazione secondo le figure 1-6), in cui l?apparato 1 comprende almeno un bioreattore 5 (nella versione di figura 7, oppure quella di figura 8, in relazione alla specifica forma di attuazione considerata).
Il procedimento comprende, inoltre, una fase di fornire dei frammenti F di tessuto riproduttivo, e di inserirli all?interno della camera di coltura 12 del bioreattore 5, posizionandoli sul supporto poroso 13, interposti tra il primo schermo 14 ed il secondo schermo 15, a reciproche prefissate distanze.
Tali reciproche prefissate distanze consentono di ottenere, in particolare:
un flusso controllato del mezzo di coltura M, M1 attorno a ciascun frammento F di tessuto;
l?applicazione di forze fluido/meccaniche controllate, che agiscono sulle superfici esterne dei suddetti frammenti F di tessuto;
per ogni frammento F, la condivisione, con gli altri frammenti F, del contenuto del mezzo di coltura M, M1 ed i sottoprodotti metabolici dei tessuti, in qualsiasi stadio di maturazione e crescita dei tessuti stessi.
Il procedimento comprende, in seguito, una fase di avviare l?apparato 1, e di alimentare il bioreattore 5 con il mezzo di coltura M, M1.
Pi? in dettaglio, in questa fase del procedimento il mezzo di coltura M, M1 viene alimentato, all?interno della camera di coltura 12 e del circuito di circolazione 6, in modo tale da determinare, sulla superficie esterna dei frammenti F di tessuto riproduttivo, una distribuzione spaziale opportuna della concentrazione di ossigeno disciolto nel mezzo di coltura M, M1.
Tale distribuzione spaziale pu? essere costante, oppure pu? essere modificata in modo intermittente, graduale o continuo nel tempo, oppure secondo una modalit? di variazione che pu? essere la combinazione delle precedenti.
Inoltre, in questa fase del procedimento il mezzo di coltura M, M1 viene alimentato, all?interno della camera di coltura 12 e del circuito di circolazione 6, in modo tale da determinare, sulla superficie esterna dei frammenti F di tessuto riproduttivo, una opportuna distribuzione spaziale di nutrienti e metaboliti di scarto. Tale distribuzione spaziale pu? essere costante, oppure essa pu? essere modificata in modo intermittente, graduale o continuo nel tempo, oppure secondo una modalit? di variazione che pu? essere la combinazione delle precedenti.
In aggiunta, in questa fase del procedimento il mezzo di coltura M, M1 viene alimentato, all?interno della camera di coltura 12 e del circuito di circolazione 6, in modo tale da determinare, sulla superficie esterna dei frammenti F di tessuto riproduttivo, una opportuna distribuzione spaziale di segnali biochimici, compresi gli ormoni (ma non limitato a questi ultimi).
Quest?ultima distribuzione spaziale pu? essere costante, oppure essa pu? essere modificata in modo intermittente, graduale o continuo nel tempo, oppure secondo una modalit? di variazione che pu? essere la combinazione delle precedenti.
Infine, in questa fase del procedimento il mezzo di coltura M, M1 viene alimentato, all?interno della camera di coltura 12 e del circuito di circolazione 6, in modo tale da determinare, sulla superficie esterna dei frammenti F di tessuto riproduttivo, una opportuna distribuzione spaziale di segnali biofluidomeccanici.
Quest?ultima distribuzione spaziale pu? essere costante, oppure essa pu? essere modificata in modo intermittente, graduale o continuo nel tempo, oppure secondo una modalit? di variazione che pu? essere la combinazione delle precedenti.
Queste soluzioni ed accorgimenti favoriscono la crescita a lungo termine dei follicoli di sopravvivenza dei tessuti.
In una forma di attuazione del procedimento secondo l?invenzione, i frammenti F di tessuto riproduttivo sono scelti dal gruppo comprendente tessuto riproduttivo fresco e tessuto riproduttivo crioconservato.
In un?altra forma di attuazione del procedimento secondo l?invenzione, i frammenti F di tessuto riproduttivo sono scelti dal gruppo comprendente tessuto corticale fresco o crioconservato.
In un?altra forma di attuazione del procedimento secondo l?invenzione, i frammenti F di tessuto riproduttivo sono scelti dal gruppo comprendente tessuto medullare fresco o crioconservato.
In ancora una forma di attuazione del procedimento secondo l?invenzione, i frammenti F di tessuto riproduttivo sono scelti dal gruppo comprendente tessuto ovarico fresco o crioconservato, completamente o parzialmente privato del tessuto medullare e/o della tunica albuginea, la cui tunica ? permeabilizzata e/o ammorbidita con mezzi meccanici e/o chimici e/o enzimatici.
Il procedimento pu? inoltre comprendere una fase di azionare uno o pi? attuatori del bioreattore 5, previsti all?interno della camera di coltura 12, per sollecitare, passivamente o attivamente, i frammenti F di tessuto riproduttivo, durante la coltura, con sollecitazioni meccaniche controllate, incluse (ma non in modo limitativo) le sollecitazioni di compressione o trazione.
Vengono descritti, qui di seguito, alcuni esempi di applicazione del procedimento di coltura, utilizzando l?apparato 1, e quindi il bioreattore 5, secondo la presente invenzione.
Il primo esempio riguarda la coltura di tessuto ovarico bovino.
I frammenti F di tessuto ovarico bovino hanno dimensioni di 1 mm x 1 mm x 0.5 mm.
Le condizioni di coltura sono le seguenti:
tempo di riempimento del bioreattore: 1,5 min;
flusso nominale del mezzo di coltura: 0,23 mL/(min cm<2>);
rapporto volume tessuto/volume bioreattore: 0,08%;
deformazione locale massima (sollecitazioni meccaniche): 0%;
sforzo di taglio massimo: 3.10<-7 >N/m<2>.
Per una migliore comprensione, i risultati della coltura ottenuti con il procedimento secondo l?invenzione vengono confrontati con situazioni di tessuto fresco, e di coltura con piattini convenzionali (all?interno delle parentesi).
Tempo di coltura: 6 giorni;
Progressione dei follicoli dallo stato di primordiali a:
primari: 55% (tessuto fresco: 18,5%; piattini convenzionali: 75%);
secondari: 41.3% (tessuto fresco: 5,2%; piattini convenzionali: 3,6%).
Qualit? dei follicoli espressa come percentuale di follicoli di un certo grado (Grado I ? il migliore, Grado III il peggiore):
Grado I: 22,3 (tessuto fresco: 27,5%; piattini convenzionali: 12,3%);
Grado II: 43,7% (tessuto fresco: 42,8%; piattini convenzionali: 36,6%);
Grado III: 34% (tessuto fresco: 29,7%; piattini convenzionali: 51,1%).
Vitalit?: 71.7% (tessuto fresco: 79,1%; piattini convenzionali: 53%).
Il secondo esempio riguarda la coltura di tessuto ovarico umano.
I frammenti F di tessuto ovarico umano hanno dimensioni di 1 mm x 1 mm x 0.5 mm.
Vengono presentati i risultati di due differenti condizioni di coltura.
Le prime condizioni di coltura sono le seguenti:
tempo di riempimento del bioreattore): 1,5 min;
flusso nominale del mezzo di coltura: 0,23 mL/(min cm<2>);
rapporto volume tessuto/volume bioreattore: 0,08%;
deformazione locale massima (sollecitazioni meccaniche): 20%;
sforzo di taglio massimo: 3.10<-7 >N/m<2>.
Anche in questo caso, per una migliore comprensione, i risultati della coltura ottenuti con il procedimento secondo l?invenzione vengono confrontati con situazioni di tessuto fresco, e di coltura con piattini convenzionali (all?interno delle parentesi).
Tempo di coltura: 6 giorni;
Progressione dei follicoli dallo stato di primordiali a:
primari: 54,5% (tessuto fresco: 21,1%; piattini convenzionali: 75,5%); secondari: 28,2% (tessuto fresco: 3,3%; piattini convenzionali: 3,6%).
Qualit? dei follicoli espressa come percentuale di follicoli di un certo grado (Grado I ? il migliore, Grado III il peggiore):
Grado I: 33,9% (tessuto fresco: 41,2%; piattini convenzionali: 12,3%);
Grado II: 38,2% (tessuto fresco: 31,6%; piattini convenzionali: 36,6%);
Grado III: 27,9% (tessuto fresco: 27,2%; piattini convenzionali: 51,1%).
Vitalit?: 66% (tessuto fresco: 78,4%; piattini convenzionali: 47%).
Le seconde condizioni di coltura sono le seguenti:
tempo di riempimento del bioreattore: 0,5 min;
flusso nominale del mezzo di coltura: 0,41 mL/(min cm<2>);
rapporto volume tessuto/volume bioreattore: 0,25%;
deformazione locale massima (sollecitazioni meccaniche): 60%;
sforzo di taglio massimo: 5.10<-3 >N/m<2>.
Anche in questo ulteriore caso, per una migliore comprensione, i risultati della coltura ottenuti con il procedimento secondo l?invenzione vengono confrontati con situazioni di tessuto fresco, e di coltura con piattini convenzionali (all?interno delle parentesi).
Tempo di coltura: 6 giorni;
Progressione dei follicoli dallo stato di primordiali a:
primari: 44,1% (tessuto fresco: 21,1%; piattini convenzionali: 75,5%);
secondari: 14,1% (tessuto fresco: 3,3%; piattini convenzionali: 3,6%).
Qualit? dei follicoli espressa come percentuale di follicoli di un certo grado (Grado I ? il migliore, Grado III il peggiore):
Grado I: 56,4 (tessuto fresco: 41,2%; piattini convenzionali: 12,3%);
Grado II: 13,2% (tessuto fresco: 31,6%; piattini convenzionali: 36,6%);
Grado III: 30,4% (tessuto fresco: 27,2%; piattini convenzionali: 51,1%).
Vitalit?: 63,4% (tessuto fresco: 78,4%; piattini convenzionali: 47%).
Come si evince dai risultati degli esempi presentati, le caratteristiche dei tessuti coltivati che si ottengono con l?applicazione del procedimento secondo l?invenzione sono, in certi casi, anche migliori di quelle del tessuto fresco.
Inoltre, si osserva anche che tali caratteristiche sono decisamente migliori di quelle dei tessuti coltivati con i piattini convenzionali.
In generale, i parametri di funzionamento dell?apparato potrebbero variare come segue:
tempo di riempimento: da 0,5 ad 1,5 min;
flusso nominale del mezzo di coltura: da 0,23 a 0,41 mL/ min cm<2>;
rapporto volume tessuto/volume bioreattore: da 0,08 a 0,25%;
deformazione locale massima (sollecitazioni meccaniche): da 0 a 20%;
sforzo di taglio massimo: da 0 a 5.10<-3 >N/m<2>;
tempo di coltura: da 3 a 21 giorni.
Si ? cos? visto come l?invenzione raggiunge gli scopi proposti.
Le soluzioni di bioreattore, apparato e procedimento secondo la presente invenzione consentono di ottenere risultati migliori, rispetto a quelli raggiungibili con le apparecchiature e metodologie attualmente disponibili, sotto molteplici punti di vista, con accorgimenti costruttivi ed impiantistici semplici, economici e di facile controllo e gestione.
La presente invenzione ? stata descritta secondo forme preferite di realizzazione, ma varianti equivalenti possono essere concepite, senza uscire dall'ambito di protezione offerto dalle rivendicazioni che seguono.

Claims (16)

RIVENDICAZIONI
1. Bioreattore (5) per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili, comprendente un primo componente (10) ed un secondo componente (11), reciprocamente collegati, che definiscono tra loro almeno una camera di coltura (12), detto primo componente (10) comprendendo una porta di ingresso (17) per introdurre un mezzo di coltura (M; M, M1) all?interno di detta camera di coltura (12), detto secondo componente (11) comprendendo una porta di uscita (18), per consentire l?uscita del mezzo di coltura (M; M , M1) da detta camera di coltura (12), caratterizzato dal fatto che comprende almeno un supporto poroso (13), previsto all?interno di detta camera di coltura (12), atto a supportare dei frammenti (F) di tessuto riproduttivo, e degli schermi (14,15), posizionati sopra, e sotto, i frammenti (F) di tessuto riproduttivo, con riferimento alla posizione d?uso verticale, o sostanzialmente verticale, del bioreattore (5).
2. Bioreattore (5) secondo la rivendicazione 1, comprendente un primo schermo (14), atto ad essere posizionato sotto ai frammenti (F) di tessuto riproduttivo, e quindi sopra detto supporto poroso (13), ed un secondo schermo (15), atto ad essere posizionato sopra i frammenti (F) di tessuto riproduttivo.
3. Bioreattore (5) secondo la rivendicazione 2, in cui detti schermi (14,15) sono conformati e configurati in modo da mantenere una pluralit? di frammenti (F) di tessuto riproduttivo, all?interno della camera di coltura (12), in rispettive posizioni spaziali prefissate, e ad opportune distanze reciproche.
4. Bioreattore (5) secondo una delle rivendicazioni precedenti, comprendente uno o pi? attuatori, previsti all?interno di detta camera di coltura (12), atti a sollecitare, passivamente oppure attivamente i frammenti (F) di tessuto riproduttivo, durante la coltura, con sollecitazioni fluidiche e/o meccaniche controllate.
5. Bioreattore (5) secondo una delle rivendicazioni 2-4, in cui detto primo schermo (14) e/o detto secondo schermo (15) sono realizzati utilizzando delle fibre cave, nelle quali scorre un liquido di riscaldamento o raffreddamento per scambiare calore e controllare la temperatura del terreno di coltura all?interno del bioreattore (5).
6. Bioreattore (5) secondo una delle rivendicazioni 2-4, in cui detto primo schermo (14) e/o detto secondo schermo (15) sono realizzati utilizzando delle fibre cave permeabili ai gas, atte a consentire lo scorrimento di un gas contenente concentrazioni prefissate di ossigeno gassoso ed anidride carbonica, per scambiare questi ultimi gas e controllare le loro concentrazioni disciolte nel terreno di coltura all?interno del bioreattore (5).
7. Bioreattore (5) secondo una delle rivendicazioni 2-6, in cui detto supporto poroso (13), detto primo schermo (14) e detto secondo schermo (15) sono serrati a pacco tra detto primo componente (10) e detto secondo componente (11), con interposizione di due o pi? guarnizioni (16) di tenuta, ad esempio del tipo ad O-ring, o di altro tipo simile.
8. Bioreattore (5) secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui detti primo componente (10) e secondo componente (11) sono reciprocamente associati tramite dei mezzi di collegamento (19) di tipo risolvibile.
9. Apparato (1) per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, comprendente almeno un bioreattore (5) secondo una delle rivendicazioni 1-8;
almeno un circuito (6; 6, 32) per la circolazione di un mezzo di coltura (M; M, M1) all?interno di detto bioreattore (5);
almeno una pompa (7; 7, 34), montata lungo detto circuito (6; 6, 32), atta ad attivare la circolazione del mezzo di coltura (M; M, M1) all?interno di detto bioreattore (5);
almeno un serbatoio (8; 8, 31), che contiene il mezzo di coltura (M; M, M1), installato lungo detto circuito (6; 6, 32);
almeno uno scambiatore di gas (9), installato lungo il circuito (6; 6, 32), atto a consentire lo scambio di gas con il mezzo di coltura (M; M, M1).
10. Apparato (1) secondo la rivendicazione 9, comprendente un incubatore (2) che include una camera (3) termicamente coibentata, all?interno della quale ? contenuto detto bioreattore (5), oppure uno scambiatore di calore (30), previsto lungo detto circuito (6) di circolazione del mezzo di coltura (M; M, M1).
11. Apparato (1) secondo la rivendicazione 9 o 10, in cui la ricircolazione del mezzo di coltura (M, M1) ? parziale, detto apparato (1) comprendendo un serbatoio supplementare (31) che contiene un mezzo di coltura fresco (M1), un circuito supplementare (32) che alimenta una determinata portata del mezzo di coltura fresco (M1) al circuito principale (6), ed un condotto di espulsione (35) per l?eliminazione di una pari portata di mezzo di coltura esausto (M).
12. Procedimento per la coltura in vitro di frammenti di tessuti riproduttivi, comprendente le fasi di:
fornire un apparato (1) per la coltura in vitro di frammenti (F) di tessuti riproduttivi, secondo una delle rivendicazioni 9 o 10, comprendente almeno un bioreattore (5) secondo una delle rivendicazioni 1-8;
fornire dei frammenti (F) di tessuto riproduttivo, ed inserirli all?interno della camera di coltura (12) di detto bioreattore (5), posizionandoli su detto supporto poroso (13), interposti tra detto primo schermo (14) e detto secondo schermo (15), a reciproche prefissate distanze;
avviare detto apparato (1), cos? da alimentare detto bioreattore (5) con il mezzo di coltura (M; M, M1).
13. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui detto bioreattore (5) comprendente almeno un attuatore previsto all?interno di detta camera di coltura (12), ed in cui il procedimento comprende almeno una fase di azionare detto attuatore per sollecitare, passivamente o attivamente, i frammenti (F) di tessuto riproduttivo, durante la coltura, con sollecitazioni fluidiche e/o meccaniche controllate.
14. Procedimento secondo la rivendicazione 12 o 13, in cui detta fase di alimentare detto bioreattore (5) con il mezzo di coltura (M; M, M1) ? attuata in modo da determinare, sulla superficie esterna dei frammenti (F) di tessuto riproduttivo, una distribuzione spaziale opportuna della concentrazione di ossigeno disciolto nel mezzo di coltura (M; M, M1), e/o una opportuna distribuzione spaziale di nutrienti e metaboliti di scarto, e/o una opportuna distribuzione spaziale di segnali biochimici, e/o una opportuna distribuzione spaziale di segnali fluido/meccanici.
15. Procedimento secondo la rivendicazione 14, in cui detta distribuzione spaziale della concentrazione di ossigeno, e/o detta distribuzione spaziale di nutrienti e metaboliti di scarto, e/o detta distribuzione spaziale di segnali biochimici, detta distribuzione spaziale di segnali fluido/meccanici ? costante, oppure pu? essere modificata in modo intermittente, graduale o continuo nel tempo, oppure secondo una modalit? di variazione che pu? essere una combinazione delle precedenti.
16. Procedimento secondo una delle rivendicazioni 11-15, in cui detti frammenti (F) di tessuto riproduttivo sono scelti dal gruppo comprendente tessuto riproduttivo fresco e tessuto riproduttivo crioconservato, oppure dal gruppo comprendente tessuto corticale fresco o crioconservato, oppure dal gruppo comprendente tessuto medullare fresco o crioconservato, oppure dal gruppo comprendente tessuto ovarico fresco o conservato in crioconservatore, completamente o parzialmente privato del tessuto medullare e/o della tunica albuginea, la cui tunica pu? essere permeabilizzata ed ammorbidita con mezzi meccanici e/o chimici e/o enzimatici.
IT102020000027290A 2020-11-13 2020-11-13 Bioreattore, apparato e procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili IT202000027290A1 (it)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT102020000027290A IT202000027290A1 (it) 2020-11-13 2020-11-13 Bioreattore, apparato e procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili
PCT/IB2021/060556 WO2022101874A1 (en) 2020-11-13 2021-11-15 Bioreactor, apparatus and process for in vitro culture of reproductive tissues, and the like
US18/037,019 US20230416685A1 (en) 2020-11-13 2021-11-15 Bioreactor, apparatus and process for in vitro culture of reproductive tissues, and the like
EP21830328.7A EP4244332A1 (en) 2020-11-13 2021-11-15 Bioreactor, apparatus and process for in vitro culture of reproductive tissues, and the like

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT102020000027290A IT202000027290A1 (it) 2020-11-13 2020-11-13 Bioreattore, apparato e procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili

Publications (1)

Publication Number Publication Date
IT202000027290A1 true IT202000027290A1 (it) 2022-05-13

Family

ID=74557004

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
IT102020000027290A IT202000027290A1 (it) 2020-11-13 2020-11-13 Bioreattore, apparato e procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230416685A1 (it)
EP (1) EP4244332A1 (it)
IT (1) IT202000027290A1 (it)
WO (1) WO2022101874A1 (it)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005056747A2 (en) * 2003-12-09 2005-06-23 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Pulse-medium perfusion bioreactor with improved mass transport for multiple 3-d cell constructs
EP2151491A2 (en) * 2008-08-06 2010-02-10 Associacion for the Advancement of Tissue Engineering and Cell Based Technologies & Therapies (A4TEC) Multichamber bioreactor with bidirectional perfusion integrated in a culture system for tissue engineering strategies
US20100075293A1 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Bioreactors, systems, and methods for vascularizing tissue constructs
FR2971255A1 (fr) * 2011-02-04 2012-08-10 Centre Nat Rech Scient Bioreacteur pour la culture cellulaire sur substrat tridimensionnel

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005056747A2 (en) * 2003-12-09 2005-06-23 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Pulse-medium perfusion bioreactor with improved mass transport for multiple 3-d cell constructs
EP2151491A2 (en) * 2008-08-06 2010-02-10 Associacion for the Advancement of Tissue Engineering and Cell Based Technologies & Therapies (A4TEC) Multichamber bioreactor with bidirectional perfusion integrated in a culture system for tissue engineering strategies
US20100075293A1 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Bioreactors, systems, and methods for vascularizing tissue constructs
FR2971255A1 (fr) * 2011-02-04 2012-08-10 Centre Nat Rech Scient Bioreacteur pour la culture cellulaire sur substrat tridimensionnel

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022101874A1 (en) 2022-05-19
US20230416685A1 (en) 2023-12-28
EP4244332A1 (en) 2023-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2197474T3 (es) Dispositivo para el cultivo y/o el tratamiento de celulas.
CA2054761C (en) Cell culture device
US5416022A (en) Cell culture apparatus
EP0537551B1 (de) Drucksteuersystem und Druckregelsystem für eine Vorrichtung zur Zellkultivierung und Gewinnung von Zellprodukten
CA2678893C (en) Methods to control cell movement in hollow fiber bioreactors
JPH05184351A (ja) 細胞培養装置
EP0419234A2 (en) Cell culture apparatus
US20040132175A1 (en) Cell culture chamber and bioreactor for extracorporeal culture of animal cells
CA2008585C (en) Apparatus for oxygenating medium
US7972841B2 (en) Exposure device
JPH0213365A (ja) 中空繊維バイオリアクター培養システムおよび方法
US20110124078A1 (en) Scalable cell culture bioreactor and cell culture process
EP2151491A2 (en) Multichamber bioreactor with bidirectional perfusion integrated in a culture system for tissue engineering strategies
CN1229489C (zh) 培养及/或处理细胞的装置
EP0095804A2 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Züchtung von Gewebezellen
IT202000027290A1 (it) Bioreattore, apparato e procedimento per la coltura in vitro di tessuti riproduttivi, e simili
US8039252B2 (en) Multi-chamber cell culture assembly
WO2016140213A1 (ja) 中空糸モジュールを用いた細胞培養方法
KR20020038764A (ko) 세포 배양방법, 막 모듈, 막 모듈의 용도 및 세포 배양용반응 시스템
CA2649192C (en) Bioreactor
Prenosil et al. Automated production of cultured epidermal autografts and sub‐confluent epidermal autografts in a computer controlled bioreactor
DE10208311B4 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Kultivierung von Gewebezellen
CN102061258A (zh) 细胞暴露缺氧环境实验装置
WO1990002170A1 (en) Membrane bioreactor
CN205188306U (zh) 细胞培养瓶