JPH0213365A - 中空繊維バイオリアクター培養システムおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は細胞（特に哺乳動物細胞）をｉｎ　ｖｉｔｒｏ
で増殖させるための装置および方法に関する。

（従来の技術） 米国特許第３８８３３９３号および同第４２２０７２５
号（両方ともＫ　ｎａｚｅｋらに発行）は、哺乳動物細
胞を１ｎｖｉｔｒｏで維持・増殖させるための装置およ
び方法を開示している。Ｋ　ｎａｚｅｋらによって開示
されたこの装置は半透性管状部材、より詳細には半透性
中空繊維、から成るカートリッジを含む。Ｋ　ｎａｚｅ
ｋらによって開示された方法において、栄養培地中に懸
濁した細胞はバイオリアクターのシェル側に導入して、
中空繊維（゛毛細管”と呼ばれる）上に沈降させる。栄
養培地はその中に含まれるｍ砲に栄養分を与えて増殖を
促すために、バイオリアクターのチューブ側を通して連
続的に循環される。増殖中の細胞の老廃物は再循環“潅
流培地′°中に蓄積させ、その“潅流培地”は毎日また
は１日おきに排出して新しい栄養培地と取り換えられた
。栄養培地の交換は、細胞に対する有毒物質（例えば乳
酸）が細胞培ＩＩ物を死滅または減少させる水準に達し
ないようにするために必要であった。Ｋ　ｎａｚｅｋら
は液体栄養培地を１日おきにまたは毎日添加したり取り
出したりするための便利な方法として、彼らの回路内に
撹拌槽または保持タンクを包含していた。従って、Ｋ　
ｎａｚｅｋらは栄Ｉ！培地の取り換えに関して本質的に
バッチ法である通常の哺乳動物細胞培養法を採用したこ
とになる。

゛ビタファイバー■／プラス（商標名ＶｒＴＡＦ−ＩＢ
ＥＲ■／Ｐｌｕｓ）”は液体栄養培地をバッチ法ではな
く連続的に補給できるようにした点で、Ｋ　ｎａｚｅｋ
らの装置および方法に対する改良であると見なされる。

再循環液体培地中の栄養分および老廃物はより適切に制
御することができる。この増大した制御可能性は乳酸水
準に対して非常に感受性の細胞を培養する際に特に重要
である。酸または塩基の添加による自動ｐＨｆｆ＋ｌｌ
ｆＭについての対策はとられているが、栄養分の自動制
御については何の対策もとられておらず、それ故にこの
システムは栄養の枯渇を起こしやすい。

これらの従来技術のシステムにおいて、乳酸水準は液体
培地へのｐＨ支持薬（例えばフェノールレッド）の添加
により監視されたゆまた、この分野では、液体培地から
サンプルを定期的に採取して、慣用の乳酸分析機で乳酸
について分析することにより、乳酸水準を監視すること
が通常行われていた。

（発明が解決しようとする課題） 哺乳動物および他の細胞株を培養するための従来技術に
関連した以前からの問題は、他の微生物による細胞培養
物の汚染または破壊の危険性が常に存在するということ
である。本発明者らは、先に論じた従来技術の装置の撹
拌槽に設置された撹拌機を取り囲むシールまたはベアリ
ングが過去において外来微生物の侵入口になっているこ
とを見出した。また、撹拌それ自体はタンパク質変性の
原因であると見なされた。本発明者らは、液体培地の再
循環回路に新鮮な栄養溶液を注入することにより、その
栄養溶液の十分な混合が達成されることを発見した。従
って、本発明は撹拌槽または保持タンクの必要性を無く
し、それにより汚染微生物の侵入しうる入口を排除する
。さらに、昇圧下で操作することにより、本発明は汚染
微生物の侵入に対してより一層の防御をもたらす。

本発明者らはまた、ｉ＆適栄養水準が、再循環回路内の
液体培地のｐＨ（慣用の９８プローブで測定）に応じて
、培地再循環回路への新しい栄養溶液のポンプ供給を制
御することにより、極めて効果的に維持されることを発
見した。このシステムにおいて、新しい栄養溶液は一定
のｐＨ（例えば、７．３または７．４）で加えられる。

従って、このシステムでは、従来技術と相違して、ｐＨ
の低下は回路へ供給する栄養分の量を増すことにより補
整され、塩基のみの添加により補整されるのではない。

先に記載したように、一部の哺乳動物細胞株は、従来の
操作方式に従って液体培地の変化の期間中ずつと増え続
ける細胞代謝産物の乳酸に対してとりわけ感受性である
。従って、乳酸の連続監視装置並びに乳酸水準の変化に
応答して新鮮な溶液を供給するポンプの速度制御装置を
備えることが望ましい。新しい液体培地の供給速度は、
回路内の十分量の液体を取り出して乳酸水準を適度に低
く維持するよう十分高くなければならない。一方、哺乳
動物細胞を培養するための通常の液体培地は、従来技術
と、同様に、本発明システムの操作においてら相当に費
用がかかる。従って、代謝老廃物含量を適度に低い水準
に維持するのに要するよりも有意に高い速度で液体培地
を取り出したり加えたりしないことが望ましい、今や、
このシステムの測　−定ｐＨに応答して供給速度を変化
させながらポンプを操作することにより、乳酸濃度を適
当な細胞培養のために最高水準より適度に低く維持する
ことが可能であり、栄養分の濃度を一定の目標水準に維
持することが可能であり、同時に有毒代謝産物の除去の
必要性と一致する液体栄養培地の消費を最小限に抑える
ことが可能であることが見出された。

（課題を解決するための手段） 従って、本発明のシステムは通常の管状膜カートリッジ
と、そのカートリッジのチューブ側を通して液体栄養培
地を循環するための循環ポンプを包含する。本発明はま
たカートリッジに入る前に液体培地に酸素を添加するた
めの酸素添加器を備えている。撹拌容器は液体培地の再
循環回路内のどの場所にも含まれない。ｐＨプローブは
検出されたｐＨに応答して供給ポンプの出力を調節する
装置と共に回路内に設置される。さらに、自動排出シス
テムとするために、液体培地を適当に加圧する手段と共
に、新しい栄養溶液の注入速度にほぼ等しい速度で液体
培地を取り出す手段が設けられる。撹拌容器を使用せず
に加圧下で操作することは、望ましくない微生物による
汚染を防止するのに非常に有効であることが分かった。

本発明方法は再循環回路内での液体の連続ボンブ輸送、
すなわちエンドレス回路内での連続循環を必要とする。

培地中の細胞はカートリッジのシェル側に導入される。

カートリッジは、細胞密度および生産性を最大限に増加
させるために、その長袖が水平面に対し４５°〜９０°
の角度となるように取り付けられる。再循環液体培地は
カートリッジの入口より上流のある地点で酸素添加され
る。新鮮な養分含有液体培地は、好ましくは酸素添加器
より上流でしかも循環ポンプより下流で、回路内に連続
的に導入される９バイオリアクターカートリツジから出
る液体培地は分割され、一部は新鮮な養分含有液体の供
給速度に等しい速度でバイオリアクターカートリッジの
出口に近い箇所で回路から連続的に排出される。回路内
のｐＨは、好ましくはバイオリアクターの出口と新しい
液体培地の供給地点との間のある箇所で、連続測定され
る。

新しい液体培地用の供給ポンプは検出されたｐＨに応答
して調節される。

本発明の他の特徴および利点は、以下に図面と関連づけ
て示される好適な実施態様の説明を読むことにより当業
者には明らかとなるであろう。

（好適な実施態様の説明） 本発明の好適な実施態様は今や、本発明のいろいろな構
成装置を示す図面を参照しながら説明することにする。

バイオリアクター、好ましくは“′ビタファイバー”■
バイオリアクター（商標名“ＶＴＴＡＦＩ−ＢＥＲ”　
Ｖ　　Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）が１０に示される。“″
ビタファイバー°°■バイオリアクターは約０．４６５
ｚ”（約５平方フイート）の半透膜表面を有する一束の
ポリスルホン中空繊維を含むカートリッジであり、Ｗ、
　Ｒ，Ｇｒａｃｅ　＆　Ｃｏ、のアミコン部門（Ａ　Ｍ
　Ｉ　ＣＯＮ　Ｄ　１ｖｉｓｉｏｎ）から市販されてい
る。

バイオリアクター（１０）のシェル側に一対のベントが
設けられ、各ベントは三方弁（１２）によって閉じられ
、これらのベントはバイオリアクター（１０）のシェル
側への細胞の導入および細胞の取り出しを可能にする。

再循環回路（２０）は生化学実験室において通常用いら
れる生物適合性の管部材（例えばポリシリコーン製）を
適当に接続することにより構成される。回路（２０）中
の養分含有液体は慣用実験室管部材“Ｔ”（１２）で分
割され、一部は新鮮な液体培地が別の慣用実験室管部材
“Ｔ”（１８）接続部に注入される速度と等しい速度で
廃棄物ライン（１４）を通って連続的に排出される。こ
のシステム内の圧力は１〜２５ｐｓｉｇの範囲に維持さ
れる。圧力範囲の下限はこのシステムの内部を大気圧よ
り高い正圧に維持して外来微生物の侵入を防止する必要
性により決定され、そして上限は装置の耐圧力によって
のみ決定される。２５ｐｓｉｇは“ビタファイバー”■
バイオリアクターのおおよその上限であると考えられる
。最も好ましくは、このシステムは１６に示す慣用ダッ
クビル（ｄｕｃｋｂｉ　Ｉ　ｌ）チェックバルブにより
約１５ｐｓｉｇに維持される。

本発明者らはまた、水平面に対するバイオリアクターの
長軸の向きが細胞密度と所望代謝産物（例えばＩｇＧ）
の生産性の両方にとって重要であることを見出した９本
発明者らは、水平の中空繊維バイオリアクターでは、バ
イオリアクターカートリッジ内の還流の性質が高分子量
成長促進物質（例えばトランスフェリン成長因子および
アルブミン）をカートリッジの出口端に移送してそこに
蓄積させ、対応して入口端で枯渇させるようなものであ
ることを発見した。換言すれば、水平に設置されたバイ
オリアクターでは、上記の高分子量成長促進物質が細胞
培養物を通って均一に潅流されず、カートリッジの出口
端に近接した細胞培養物が高濃度の上記栄養分を受は取
ることになる。本発明者らはこのことをアゾ染料で標識
したラクトアルブミンを用いて実験的に証明した。本発
明者らはまた、バイオリアクターの長軸を水平面に対し
て４５°〜９０°の角度に向けることにより、高分子量
成長促進物質が細胞培養物全体を通してより一層均−に
分配されることを実験的に証明した。特に、本発明者ら
は、水平面に対して６０°またはそれ以上の角度で、細
胞培養物が水平に配置した同一のバイオリアクターの場
合に要する時間の半分で、最大の細胞密度および生産性
に達することを見出した。６０°を越える角度に向ける
ことにより得られる利点はほとんどないことが実験的に
示された。

バイオリアクターを垂直方向に立たせることにより細胞
密度と生産性の点でごくわずかな利益が得られるが、こ
の利益はこの種のデザインが直面する製造上（包装上）
の諸問題により相殺されると考えられる。

信号を発するｌ）Ｈプローブが２０に示され、この信号
は新鮮な培地の供給ポンプ（２２）の運転を支配する。

再循環回路内に有毒代謝産物が蓄積すると、主として哺
乳動物細胞の代謝産物である乳酸の存在ゆえに、ｐＨが
下がる傾向にある。一方、グルコース、ビタミン類およ
びアミノ酸類を含有する一ｉ的な栄養培地はわずかに塩
基性であり、例えばｐＨ７，３または７．４である。従
って、ポンプ（２２）による一定ｐＨでの新鮮培地の供
給は、培養しようとするそれぞれの細胞株に対し１ｌｌ
ｉｐＨとして選ばれた特定レベルにｐＨを維持するため
に、ｐＨプローブ（１８）からの信号に応答して調節さ
れる。

“ビタファイバー■／プラス″システムのような単なる
ｐＨ制御とは対照的に、本方法により再循環回路内では
栄養分が一定水準に保たれる。再循環回路内の！＆適ｐ
Ｈは一最に６．５〜７．５の範囲であり、ハイブリドー
マ細胞からのＩｇＧ生産の場きはｐＨが好ましくは約６
，８であるだろう。乳酸水準は本発明システムではｐＨ
に応じて正確に制御されるので、従来技術のように液体
培地中にｐＨ指示薬を加える必要がない。しかしながら
、この種の指示薬は所望により任意に加えることができ
る。

新鮮な養分含有液体培地は、ｐＨプローブ（２０）の下
流の地点でＴ”（１８）を通して螺動ポンプ（２２）に
より回路に連続的に供給される。回路（２０）内の連続
循環はギヤーポンプ（２４）によってもたらされる。

再循環ポンプ（２４）の下流には酸素添加器（２６）が
設けられる。酸素添加器（２６）として、本発明者らは
内径５．０８ｃｚ（２インチ）のポリスルホン管内に配
置した内径０．３３５ｃｍ（０，１３２インチ）外径０
．４６５ｃｚ（０，１８３インチ）のシリコーンチュー
ブを使用した。

空気はエアーポンプ（２８）によって酸素添加器（２６
）のシェル側に送り、液体培地は酸素添加器のチューブ
の中を通過させる。回路（２０）内の循環液体培地の酸
素分圧は好ましくは１００〜１５０ｉｕ＋Ｈｇに維持さ
れる。実際に、本発明者らは約１３８＋＋ｕＨｇの酸素
分圧を保つのに成功した。エアーポンプ（２８）は市販
されている慣用のダイヤフラムポンプである。

酸素添加器（２６）を出た後、循環液体培地はＰａ１ｌ
Ｂ　ｉｏｍｅｄｉｅａｌ　Ｐ　ｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているポリプロピレン膜
フィルターのような５ミクロンフィルター（３０）を通
過させる。

バイオリアクター（１０）、ｐＨプローブ（２０）、酸
素添加器（２６）およびフィルター（３０）を含むイン
キュベーターオーブンは３２に示される。オーブンの内
部は培養しようとする個々の細胞株に対し最適な温度に
保たれ、一般には約３７℃であるだろう。

本発明の装置および方法は数多くの様々な医学および生
化学的用途において使用されるであろう。

例えば、開示された装置および方法はハイブリドーマ細
胞株からＩｇＧのような免疫グロブリンを生産するのに
特に有用であることが分かった。このシステムおよび方
法はまた動物肝組織、ヒト肺組織、並びに種々のヒトお
よび動物癌のような中空繊維システムで首尾よく培養さ
れた他の細胞株を培養するのにも用いられる。

本発明はその精神または本質的特徴から逸脱することな
く他の特定形態に具体化することができる。従って、上
記実施態様はすべての点において例示としてみなされ、
制限するものとして解釈されるべきでなく、本発明の範
囲は前述の説明よりもむしろ特許請求の範囲により示さ
れ、それ故に特許請求の範囲の意味および均等範囲に含
まれるすべての変化は本発明に包含されるものである。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明システムの構成装置を示すフローチャート
である。 （外４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、シェルおよび該シェル内に固定され且つ流体入口端
   と流体出口端の間に伸長する複数の管状半透膜を有する
   管状膜カートリッジであつて、該管状膜が該シェルの内
   部を管内空間と管外空間とに分割するのに役立ち、該シ
   ェルが細胞および細胞産物の導入・排出用の、管外空間
   と連通し且つ互いに間隔をおいて配置された第一開口お
   よび第二開口を有する上記の管状膜カートリッジ；栄養
   分を含む液体培地を該管状膜を通して循環させるための
   循環ポンプ； 該液体培地に酸素を添加するための酸素添加器；周囲の
   大気に対し密閉されており且つ該流体入口端および該流
   体出口端と連通しているエンドレス循環回路であって、
   該循環ポンプおよび該酸素添加器を含むが撹拌槽を含ま
   ない上記のエンドレス循環回路； 新鮮な栄養分含有溶液を該回路に連続注入するための供
   給量を変えることのできる供給ポンプ；該回路内に配置
   されたｐＨプローブ、および該プローブにより測定した
   ｐＨの変化に応答して該供給ポンプの出力を調節するた
   めの手段；および該液体培地を大気圧より高い圧力に維
   持しながら、該回路への新鮮な栄養分含有溶液の注入速
   度に等しい速度で、該回路から該液体培地を連続的に取
   り出すための排出手段； を含む細胞培養システム。 ２、液体培地の取出し地点は該カートリッジの下流にあ
   って該循環ポンプの上流にあり、そして新鮮な栄養分含
   有液体培地の注入地点は該取出し地点の下流にあって該
   循環ポンプの上流にある、請求項１記載のシステム。 ３、該排出手段はチェックバルブから成る、請求項１記
   載のシステム。 ４、該回路はさらに固形分を除くためのフィルターを含
   む、請求項１記載のシステム。 ５、該カートリッジおよび該酸素添加器を含む内部を有
   するインキュベーターキャビネット、並びに該キャビネ
   ットの内部を細胞培養に適する室温より高い温度に維持
   するための手段をさらに含む、請求項１記載のシステム
   。 ６、細胞のための栄養分を含む液体培地を、周囲の大気
   に対して閉じられたエンドレス回路を通してポンプで連
   続循環させ、但し該回路は複数の半透膜管を有する管状
   膜カートリッジを含み、培養しようとする細胞は該カー
   トリッジのシェル側に導入され； 該回路中の液体培地に酸素を添加し； 該回路中の液体培地のｐＨを連続測定して、そのｐＨを
   表示する信号を発生させ； 測定したｐＨに従って供給量を変えながら、該回路に一
   定ｐＨで新鮮な栄養分含有液体培地を連続供給し；そし
   て 該回路から供給量と同じ量の液体培地を連続的に取り出
   す、 ことから成る細胞培養法。 ７、該回路からの液体培地の取出し地点はカートリッジ
   の出口端とポンプの間にあり、そして新鮮培地の供給地
   点は取出し地点とポンプの間にある、請求項６記載の方
   法。 ８、取出し地点と供給地点との間の該回路内のある地点
   でｐＨを測定する、請求項７記載の方法。 ９、液体培地の上記供給によりｐＨを６．５〜７．５の
   範囲に制御する、請求項６記載の方法。 １０、該回路内の圧力を１〜２５ｐｓｉに維持する、請
   求項１記載の方法。 １１、カートリッジに入る液体培地中の溶存酸素の分圧
   は１００〜１５０ｍｍＨｇである、請求項６記載の方法
   。 １２、管状膜カートリッジはその長軸が水平面に対し４
   ５°〜９０°の角度となるように配置する、請求項６記
   載の方法。 １３、中空繊維膜カートリッジのシェル側に細胞を導入
   し、但し、該カートリッジは水平面に対して４５°〜９
   ０°の角度にその長軸を方向づけ；そして 該カートリッジのチューブ側を通して栄養分含有液体培
   地を連続循環させる ことから成る細胞培養法。 １４、該カートリッジはその長軸を水平面に対して４５
   °〜９０°の角度に方向づける、請求項１記載のシステ
   ム。