ES2197474T3 - Dispositivo para el cultivo y/o el tratamiento de celulas. - Google Patents

Abstract

Dispositivo para el cultivo y/o tratamiento de células con las características siguientes: 1.1 sobre un soporte permeable al agua (1) se dispone una primera cámara (cámara celular 5) 1.2 la primera cámara (cámara celular 5) se ha configurado por medio de una primera lamina (2) permeable al gas, no permeable a los líquidos, que se coloca sobre el soporte (1), y una segunda lamina microporosa (3), que se dispone sobre la primera lamina (2) o bien forma con esta una sola pieza, 1.3 al menos una de ambas láminas (2, 3) es elástica de tal forma que el volumen final de la primera cámara (5) puede absorber un múltiplo de su volumen de partida y 1.4 la primera cámara (5) posee al menos una tubería de entrada y/o de salida (7, 9).

Description

Dispositivo para el cultivo y/o el tratamiento de células.

La invención hace referencia a un dispositivo para cultivar y/o tratar células.

En la DE 42 06 585 C2 se ha descrito un dispositivo para el cultivo en masa de células, especialmente de hepatocitos sobre soportes de cultivo celular tipo placas, donde en un soporte de cultivo celular permeable al gas se disponen las células en una capa de colágeno. El dispositivo presenta una construcción tipo sándwich, donde varios soportes de cultivo celular se han provisto con células con capas de colágeno entre ellas. El inconveniente de este dispositivo es que siempre existen cámaras de células bien definidas con determinados volúmenes. Además es difícil observar las células en las cámaras de células, para constatar posibles cambios o estados de evolución.

En la DE 42 22 345 A1 se ha descrito un método para el cultivo de un tipo de célula en un proceso de cocultivo con células hepáticas, donde se realiza un cultivo de células hepáticas sobre un soporte en un proceso sándwich. Entre las células hepáticas y el soporte se dispone una primera capa matriz para el anclaje de las células hepáticas y sobre las células hepáticas se sitúa una segunda capa matriz.

En la USP 5.449.617 se ha descrito un recipiente para el cultivo en el cual se realiza el cultivo en carcasas rígidas. Una desventaja será la elevada proporción de volumen muerto. Para conseguir un mejor y más uniforme abastecimiento de células con oxígeno, preferiblemente se debe girar el aparato. Este es un factor de estrés continuado especialmente para células que crecen adheriéndose. La fabricación de cultivos de hepatocitos según la técnica del sándwich no es posible a largo plazo, puesto que rotaciones de este tipo conducen a una alteración de las capas de colágeno. La escala up solamente es posible con un volumen muerto elevado en este proceso. La escala up presenta una limitación notable ya que un incremento del volumen permite también alcanzar rápidamente los límites de la escala up, ya que de forma continuada se consiguen nuevas condiciones. Estas están también condicionadas por el hecho de que el contrapeso conseguido por la rotación conduce a cargas de presión y de cizalladura elevadas. En caso de que estas rotaciones no se hagan, ya no se garantiza un abastecimiento uniforme de células con oxígeno. Eso está condicionado por la disposición lateral de las láminas/membranas permeables al gas respecto al espacio de cultivo celular.

En la US-PS 4.748.124 se ha descrito la aplicación de unos volúmenes determinados para las cámaras del sistema de cultivo. Para ello, la cámara de cultivo se mantiene en un estado comprimido. Esto tiene el inconveniente de que deben definirse estas cámaras en determinadas dimensiones antes del inicio del cultivo. Esta definición del lugar del cultivo se considera una ventaja. Realmente se trata de un inconveniente decisivo, ya que debido a él no es posible una adaptación a las diferentes fases de cultivo y un crecimiento del sistema de cultivo del tipo 3-D. Solamente una flexibilidad de este tipo facilita, sin embargo, el empleo del sistema para el desarrollo de órganos de tipo artificial a partir de un número pequeño de cultivos de partida.

Adicionalmente en la US-PS 4.748.124 se ha introducido la limitación al uso de membranas de diálisis. Esto es un gran inconveniente para las células primarias como por ejemplo, hepatocitos, que transportan productos y catabolitos o toxinas ligadas a proteínas con un peso molecular esencialmente elevado (deben absorber y ceder). Solamente las membranas microporosas pueden garantizar esto con una permeabilidad proteínica.

La presente invención tiene el cometido de crear un dispositivo, con el cual pueda reaccionarse de modo muy variable en diferentes circunstancias, especialmente cambios de volumen (aumento y disminución del volumen) en el tratamiento y/o cultivo de las células, donde al mismo tiempo sea posible una observación y además pueda darse también la posibilidad de un cultivo a granel.

Este cometido se resuelve conforme a la invención por medio de las características mencionadas en la reivindicación 1.

El dispositivo conforme a la invención es apropiado para un sistema de cultivo a granel por su simple construcción. Además, puede adaptarse a las exigencias correspondientes. Así por ejemplo, empezando con un volumen muy pequeño y un número de células pequeño, que se tratan o cultivan en la cámara de células o en el compartimento celular, éste se incrementa un múltiplo del volumen de partida. Esto significa que, por ejemplo, se empieza con una cantidad muy pequeña del material que se va a analizar y se deja crecer en la cámara de células. De esta forma, se consigue un ahorro de costes especialmente en el caso de sustancias caras.

Mediante la posibilidad de introducir sobre el soporte estable oxígeno o bien aire, que pueda ser difundido por las láminas permeables al gas en la cámara celular, pueden colocarse una o varias unidades de este tipo, a modo de sándwich, una sobre otra en un armario térmico convencional. Debido a la combinación de la estructura del soporte con la oxigenación no se necesitan apenas dispositivos de bombeo para el abastecimiento de oxígeno y de dióxido de carbono, por lo que el manejo resulta más sencillo.

También es una ventaja que la cámara celular en el dispositivo conforme a la invención pueda observarse siempre del mismo modo.

En la reivindicación 2 se muestra otra configuración ventajosa de la invención.

Mientras que en la cámara celular inferior las células pueden ser tratadas y/o cultivadas, la cámara superior se ha previsto para la alimentación del medio de cultivo, que es difundido en la cámara celular a través de la lámina microporosa o membrana. Para ello la segunda lámina debe ser microporosa y permeable a líquidos. Otra ventaja de una alimentación de medio de cultivo de este tipo consiste en que para las células se dan unas condiciones (estrés) de cizalladura claramente inferiores. Las células pueden introducirse por arriba y por abajo en el colágeno y el medio de cultivo se añade por arriba.

Otra posibilidad de aprovechamiento de la segunda cámara consiste en que ésta puede utilizarse para la producción o bien ``cosecha'' de sustancias, que se forman en la cámara celular. Así, por ejemplo, pueden cultivarse glóbulos blancos en la cámara celular, estos son expuestos a un antígeno, de tal forma que las células empiezan a producir anticuerpos. Estos anticuerpos se difunden luego por la segunda lámina en la segunda cámara y desde allí pueden ser retirados. De esta forma, las células se quedan en la cámara celular. Únicamente hay que tener cuidado de que la segunda lámina entre la cámara celular y la segunda cámara posea una microporosidad decisiva, de forma que solamente las sustancias deseadas puedan ser perfundidas a través de la lámina.

Otra ventaja es que el medio que se encuentra en la segunda cámara pueda ser intercambiado sin alterar las células que se encuentran en la cámara celular. Lo mismo sirve pero a la inversa. De esta forma, se obtiene un sistema capaz de regenerarse a largo plazo.

Las configuraciones preferidas se obtienen de las restantes reivindicaciones y del ejemplo de ejecución descrito conforme al principio con ayuda de las figuras.

Se muestra:

Fig. 1 una representación esquemática de la explosión de un dispositivo conforme a la invención en una visión lateral

Fig. 2 a modo de corte, una representación ampliada de un corte vertical

Fig. 3 una representación esquemática del dispositivo conforme a la invención en una variación, y

Fig. 4 un miembro superior de una pieza tubular de un tubo de alimentación o de salida en una representación ampliada de la planta.

Sobre un soporte 1 en forma de una placa soporte en una estructura reticular, perforada, de perfil o alveolar, se coloca una lámina de teflón 2 elástica, permeable al gas. Sobre la lámina de teflón 2 se coloca una segunda lámina en forma de una lámina porosa permeable a líquidos. Sobre la lámina 3 se dispone una lámina de teflón 4 permeable a los gases. Las tres láminas presentan bordes impermeabilizados. De esta manera, entre la lámina de teflón 2 apoyada sobre la superficie inferior y la segunda lámina 3, que es microporosa, se forma una cámara 5 celular variable, capaz de expansionarse libremente hacia arriba y entre la segunda lámina 3 y la tercera lámina 4 se forma una segunda cámara 6 variable, y capaz de expansionarse hacia arriba. La segunda cámara 6 posee al menos un tubo de entrada 7 ó 8 y uno de salida 9 ó 10. Para conseguir una distribución uniforme de las sustancias que se introducen y una irrigación homogénea, se colocan la entrada y la salida de una cámara una frente a la otra, preferiblemente en diagonal. Para la cámara celular 5 existe básicamente una conexión o bien varias.

Como protección y para definir la posición puede colocarse sobre la tercera lámina 4 un armazón o varios soportes distanciadores 11. El soporte estable 1 , la cámara celular 5, la segunda cámara 6, que pueden servir como cámara de medio de cultivo o cámara de recogida, y el armazón o el soporte distanciador 11 forman una unidad, sobre la que se apilan otras unidades. El oxígeno puede, desde abajo a través del soporte 1 en la dirección de la flecha y desde el lado entre los soportes distanciadores 11, servir para alimentar las células 12 introducidas en la cámara celular 5. Del mismo modo, el medio de cultivo de la segunda cámara 6 puede ser perfundido a través de la lámina 3 microporosa o tipo diálisis en la cámara celular 5.

De la figura 2 puede verse como se forman la cámara celular 5 y la segunda cámara 6 y como se impermeabilizan las láminas 2,3 y 4 en sus bordes, para formar ambas cámaras. Para ello el armazón o los soportes distanciadores 11 tipo listones pueden estar dotados en su lado inferior de una estructura de diente de sierra como elemento sellante o de apriete. Las tres láminas 2, 3 y 4 se colocan sobre el marco soporte 1 y tras poner encima el soporte distanciador 11 se fijan por medio de la estructura 13 de diente de sierra, si el soporte distanciador 11 está unido al soporte 1 del modo no representado. Esto puede hacerse con tornillos por ejemplo. De este modo, se lleva a cabo una impermeabilización.

Las láminas 2, 3, 4 pueden soldarse o pegarse. Antes de colocar el bastidor o soporte distanciador 11, se introducen sin embargo los tubos de entrada 7 y 8 y los tubos de salida 9 y 10. Los tubos de salida y entrada pueden estar configurados como unidades prefabricadas. Para fabricar una conexión hacia fuera, puede usarse la pieza tubular 14 con un elemento superior 15 en forma de aro. La pieza tubular 14 posee una rosca exterior, sobre la que se atornilla una tuerca 16. Tan pronto como la lámina de teflón 2 se coloca sobre el soporte 1, se hace pasar un tubo de entrada 7 con la pieza tubular 14 y un tubo de salida 9 asimismo con la pieza tubular 14 del mismo tipo, a través de la membrana 2 y se introduce en un orificio del soporte 1. El elemento superior 15 descansa entonces sobre el lado superior del soporte 1 y la lámina 2 se pega debajo, y si es necesario se coloca un anillo obturante (anillo O). Se atornilla ahora desde abajo la tuerca 16, y se consigue una hermeticidad. A continuación, se dejan deslizar los tubos 17 ó 18 por la pieza tubular 14. De este modo, puede llenarse o vaciarse la cámara celular 5.

Tras colocar la lámina 3 microporosa ésta es perforada por la pieza tubular 14, que asimismo se fija a través de un orificio en el soporte 1. La pieza tubular 14 equivale para la segunda cámara 6 al tubo de entrada o de salida, siempre que no se prevea una conducción íntegra para la entrada y la salida.

Preferiblemente, se ha previsto un aro obturante 19 entre el elemento superior 15 y el soporte 1. Con esta configuración, existe asimismo una posibilidad de salida y entrada para el medio que se introduce en la segunda cámara.

Al principio del tratamiento las tres láminas 2, 3 y 4 descansan directamente una sobre otra. Cuando se introduce el medio en la cámara celular 5, debido a la elasticidad de la lámina 3 y si se diera el caso de la lámina 2, se ajusta una distancia variable, de manera que se crea una cámara de tratamiento o cámara celular 5. Lo mismo ocurre para la segunda cámara 6, que se forma asimismo cuando se introduce un medio, por ejemplo, el medio de cultivo a través del tubo de entrada 8. En este caso se dilata además de la lámina 3 también la lámina 4 y existe sitio suficiente para que se forme la segunda cámara 6. Puesto que hacia arriba no existen limitaciones especiales, los volúmenes de la cámara celular 5 y de la segunda cámara 6 pueden dilatarse hacia arriba sin problemas. Partiendo de una ``distancia nula'' pueden alcanzarse alturas de 1 hasta 2 cm.

Si por ejemplo se cultiva en la cámara celular 5 médula ósea, es posible un aumento de volumen del orden de 100-1000. Se empieza, por ejemplo, con 100 microlitros hasta 5 ml, si se posee solamente una película delgada de células 12. Las células crecen en la cámara celular 5, por la multiplicación de las células madre hematopoyéticas. Puesto que los factores de crecimiento son muy caros, esto significa en el dispositivo conforme a la invención, que puede empezarse con pequeñas cantidades y de esta forma conseguir un ahorro de costes considerable. Sin embargo, no son precisas interrupciones en el tratamiento o bien un cambio de dispositivo, puesto que el sistema puede crecer con el tratamiento. Además, el principio de construcción permite que las células de médula ósea puedan permanecer en el bioreactor al multiplicarse las células madre.

El dispositivo conforme a la invención puede, por ejemplo, emplearse para la fabricación de anticuerpos o vacunas. En este caso en la cámara celular 5 se introducen componentes bacterianos o víricos de actividad inmunológica, que producen anticuerpos, que se difunden por la lámina 3, y pueden ser ``cosechados'' luego sin problemas en la cámara celular 5 de la segunda cámara 6. La cámara celular 5 puede subdividirse en caso de necesidad.

Una observación de los procesos en la segunda cámara 6 y/o de la cámara celular 5 es posible de un modo sencillo con el dispositivo conforme a la invención. Se puede observar éste sin problemas bajo el microscopio, y ciertamente sin que el cultivo en las cámaras pueda verse afectado. En la práctica puede observarse de este modo cada unidad individualmente, cada módulo.

En lugar de una adherencia de las láminas 2, 3 y 4 como se ha representado en la figura 2, éstas pueden adherirse al soporte 1 lateralmente o de forma periférica.

Según el tipo de célula y/o de forma de cultivo se tiene bastante con una única cámara, en este caso la cámara celular 5 y con solamente dos láminas, es decir la lámina 2 y 3. Así, por ejemplo, en la cámara celular 5 pueden cultivarse hongos, que debido a la elasticidad de la lámina 3 y si se diera el caso de la lámina 2, pueden crecer con el incremento correspondiente de volumen de la cámara celular 5.

Puede emplearse también una lámina intermedia 21 (representada en la cámara celular 5 en la fig. 2 a trazos), donde se forman dos segmentos de cámara celular. La segunda lámina 11 puede ser asimismo eventualmente microporosa.

Una de las ventajas esenciales del dispositivo conforme a la invención consiste en que debido al crecimiento conjunto de la cámara celular 5 y de la segunda cámara 6 en una cosecha de sustancias de la segunda cámara 6, las células en la cámara celular 5 no deben ser separadas y por tanto se pierden, como con la tecnología actual.

Esto significa, por ejemplo, que en la expansión de la médula ósea pueden expandirse las células madre hematopoyéticas y al mismo tiempo las células del estroma se quedan largo tiempo en el bioreactor, es decir, hasta que se alcanza el aumento suficiente del volumen de células madre (por ejemplo, 500 ml de 1 hasta 5 ml).

Otra ventaja es que tras finalizar una serie de ensayos se pueden volver a utilizar al menos el soporte 1 y el soporte distanciador 11. Es únicamente necesario cambiar las dos cámaras, es decir, la cámara celular 5 y la segunda cámara 6, que están formadas por las láminas 2, 3 y 4 y forman prácticamente una bolsa. Pueden reutilizarse también las conducciones de entrada y salida 7 hasta 10.

Debido a la escasa disponibilidad de determinadas células de partida (por ejemplo, médula ósea humana) y/o del coste enorme de factores de crecimiento y de interleucinas, el volumen debe ser lo más bajo posible (aprox. 1 hasta 5 ml), pero por otro lado en el transcurso del cultivo debe poder aumentar de 100 hasta 1000 veces. Así por ejemplo la médula ósea de un paciente debe aumentarse extracorporealmente de tal manera que puedan transplantarse de nuevo unos 500 ml.

Adicionalmente, se requieren fases de cultivo específicas en, por ejemplo, células hepáticas, que durante la fase de crecimiento volúmenes elevados (200 hasta 300 ml, en una superficie de 1000 cm^{2}) de medio de cultivo se introducirán en el bioreactor a través del dispositivo conforme a la invención, para facilitar un crecimiento óptimo de las células y una fase de multiplicación para las siguientes 24 ó 48 horas en unas condiciones no perfundidas sin entretenimiento. Ya en la fase de crecimiento de las células es preciso evitar corrientes perturbadoras. Si el volumen de un bioreactor se ajustara ya inicialmente a unos volúmenes muy bajos, eso significaría sin embargo un tiempo de tolerancia muy reducido al interrumpirse la perfusión, puesto que el medio de cultivo se consumiría en cuestión de minutos. Adicionalmente se evitarían productos tóxicos de las células, catabolitos e incluso en el aislamiento celular de células primarias(p.ej. hígado) a través del aislamiento celular debido a la lisis celular que se produce por la colagenasa, productos en concentraciones locales altas y en caso de células sensibles la muerte de estas células.

En la preparación del cultivo de células hepáticas primarias se procede del modo siguiente:

En primer lugar se inyecta colágeno en solución líquida, por ejemplo, con 1 mmol HCl y 1,5 mg/ml de colágeno tipo I con 3 \mug/ml de fibronectina en la cámara celular 5 o bien en el compartimento celular y el colágeno que sobra se desecha rápidamente. Esta flexibilidad es una ventaja desde el punto de vista técnico ya que las burbujas de aire son tóxicas para las células. La separación del colágeno en exceso equivale a un ahorro de costes, puesto que este colágeno puede utilizarse para otros módulos.

El reactor o bien el dispositivo puede mantenerse a 37ºC, o bien ser irradiado con luz UV para conseguir una fijación del colágeno (reticulación). El colágeno puede añadirse a la cámara celular con o sin el concentrado 10 veces de un medio de cultivo, donde se consigue una inmediata neutralización del pH. Si esto no se hace, puede realizarse una neutralización del pH añadiendo una proporción elevada de medio de cultivo debido a la flexibilidad del dispositivo, puesto que el efecto de dilución a través del medio de cultivo facilita la regulación tampón necesaria. Generalmente, con la siembra de hepatocitos se ajusta una concentración de 1x10^{6} células por ml. En una superficie de cultivo de 1000 cm^{2} ya se han necesitado 200 ml. Este volumen es intercambiado al cabo de 2 hasta 4 h para eliminar las toxinas y el detritus celular y para poder dejar medio de cultivo nuevo otras 24 hasta 48 horas en los hepatocitos. Después, el medio se elimina del todo, de tal forma que solamente queda una capa celular no confluente. Esta se recubre entonces con aproximadamente 20 hasta 50 ml de colágeno en una mezcla en la cámara celular 5 con una solución concentrada 10 veces del medio de cultivo (p.ej. Williams E). Luego se aspira de nuevo el colágeno excesivo de la cámara celular 5. De esta forma la cámara celular 5 puede desplomarse y aproximarse a la lámina inferior permeable al gas o bien a la membrana 2 con las células que hayan crecido con la lámina mediana 3. Esto apoya la resistencia de la capa de colágeno y la protege de las influencias de la fuerza de cizalladura.

Tras introducir la segunda capa de colágeno (48 h después de la siembra celular) en la cámara celular 5 y esperar durante aprox. 1 hora, el medio de cultivo pasa a la segunda cámara superior.

Cuanto mayor es el contenido en volumen de medio de cultivo, menos problemas tendrá el reactor en una situación de funcionamiento.

Si se emplean hepatocitos primarios existe, contrariamente a la opinión establecida de ventaja, una proporción de células no parenquimales cómo mínimo superior al 1% (20 hasta 30%) que se mezclan en el cultivo, puesto que estos factores de crecimiento se producen localmente y facilitan la expansión espontánea de los hepatocitos no proliferantes. De no ser así los hepatocitos tendrían que ser estimulados con grandes cantidades de factores de crecimiento muy caros (por ejemplo, EGF = factor de crecimiento epidérmico, TGF = factor de crecimiento que se transforma o bien HGF = factor de crecimiento de los hepatocitos). Por medio de la GH = hormona de crecimiento puede intensificarse todavía más el vaciado o vertido de las células producidas endógenamente (a través de las NPC = células no parenquimales), y por tanto puede conseguirse una regeneración celular económica del bioreactor en funcionamiento a largo plazo.

Si debe utilizarse el sistema reactor como órgano bioartificial (por ejemplo, hígado), se necesita entonces un volumen mínimo, ya que para grosores de capa reducidos del plasma empleado el intercambio de materia por difusión es básicamente más eficaz y porque así los productos del reactor no se diluyen en concentraciones no fisiológicas. La altura vertical de la cámara de perfusión o bien de la segunda cámara 6 debe ser únicamente de 10 hasta 50 \mum.

Para poder realizar una aplicación in vivo en pacientes con fallo hepático, se conectan en paralelo los módulos del bioreactor utilizando conectores estériles, se retira totalmente el medio de cultivo a través del sistema de bombas de varios canales por aspiración, y se hace pasar el plasma del paciente (en combinación con un separador de plasma y un recipiente) a ser posible en capas delgadas a través de la segunda cámara 6 superior. Para ello es preferible hacer pasar de nuevo el plasma a través del reactor o del dispositivo por medio de una aspiración. Como medida de apoyo y de seguridad en la zona de la perfusión, una bomba conectada del mismo modo delante del reactor puede facilitar el mantenimiento de unas condiciones de perfusión constantes en una zona del reactor con grosores de capa mínimos.

Otra aplicación puede ser el cultivo de queratinocitos en las películas permeables de gas o bien láminas como por ejemplo, el teflón. Para grosores de capa bajos de esta película (por ejemplo, 25 \mum) se obtiene una elevada permeabilidad al oxígeno. Cuando, como es habitual, los queratinocitos se expanden en láminas, existe el problema de que al utilizar estas láminas como recubrimiento de heridas (por ejemplo, después de quemaduras y eliminación de los restos de piel quemados por escarectomía) las células que crecen en las láminas tras pegar la lámina a la herida se orientan de forma errónea, puesto que la cicatrización siempre se realiza en el lado expuesto al aire.

Utilizando la lámina 2 permeable al gas como sustrato de adherencia, se produce inicialmente una adherencia y proliferación de queratinocitos, y además puede realizarse un crecimiento de varias capas. Si en la evolución del cultivo aumenta el grosor de capa medio que se deposita en las células en la segunda cámara 6, de manera que aparecen limitaciones en cuanto al abastecimiento de O_{2}, puede realizarse una reorientación de las células con una recicatrización en el lado inferior. El abastecimiento de O_{2} depende del grosor de capa del medio según la ley de difusión de Ficksen, y el O_{2} tiende a 0 para grosores de capa de 1 mm pericelular.

Entonces el bioreactor se concebirá en este lado o bien en la lámina 2 para este uso, de manera que como en un recipiente la lámina 2 podrá ser retirada en los puntos teóricos de rotura o bien superficies de despegado previstas (fijación no permanente), así que se puede lograr muy fácilmente un recubrimiento estéril de la herida con unos cultivos de queratinocitos de varias capas correctamente orientados.

Para ello por motivos técnicos de esterilidad el bioreactor puede poseer un revestimiento adicional y estéril (Envase o lámina extra, membrana o estructura permeable al gas, envase de papel o plástico con filtros estériles) que introduzca aire en el dispositivo.

Esta variabilidad del bioreactor, que permite sustituir volúmenes elevados y bajos, es una ventaja importante de la invención. Esta flexibilidad facilita también el cultivo de diferentes sistemas de células y órganos y el poder expandirlas en cultivos multicelulares y de varias capas.

Se trata por tanto de un principio de construcción sensible al volumen que facilita un procedimiento, en el cual pueden ajustarse temporalmente de modo fraccionado distintos volúmenes. Esto significa también que el reactor ``crece'' y en contraposición a la situación de la técnica actual posee un ``volumen muerto'' no deseado.

En el cultivo de células en la cámara celular inferior 5 o bien en el compartimiento y cerca del mismo no es necesario para el abastecimiento de oxígeno, que la lámina 4 superior sea permeable al gas. En general, se coloca la cámara celular 5 sobre el soporte 1. Sin embargo, si se diera el caso también es posible la disposición invertida, es decir que la cámara celular 5 se encuentre arriba y la segunda cámara abajo, donde en este caso la segunda cámara 6 se coloca en el soporte 1.

Las conexiones o bien conducciones de entrada y salida 7 hasta 10 pueden dirigirse (o mezclarse) todas hacia arriba o hacia abajo. La ventaja en la aplicación hacia arriba es que en la fabricación (por ejemplo, proceso de embutición profunda)éstas pueden integrarse igualmente en la lámina 4 o 3 superior (ver representación básica en la fig. 3). De la figura 3 puede deducirse que para evitar una aspiración o bien un pegado de las láminas 2, 3 y 4 en la zona de las conducciones de entrada y salida 7 hasta 10, se ha previsto el soporte distanciador 20 o las motas distanciadoras. Una adherencia opuesta o una aspiración puede evitarse.

El bioreactor o bien el dispositivo puede construirse de manera que la unidad de cultivo se erija como bolsa con las láminas 2,3,4 y con las conexiones correspondientes, junto a las cámaras 5 y 6. El bioreactor o bien la unidad de cultivo puede aplicarse y fijarse sobre el soporte 1 sustentador. Esto puede suceder mediante la sujeción o el empotrado en la bolsa a través de los orificios laterales.

La utilización únicamente de la bolsa no favorecía la funcionalidad del bioreactor, puesto que únicamente en la combinación con una estructura de apoyo o bien del soporte 1 se conseguía la flexibilidad exigida y un manejo simple. El llenado de la bolsa sin la estructura de apoyo o el soporte 1 conducía inmediatamente a un hundimiento del medio o de las células en el punto máximo y por tanto a la muerte de las células.

De forma ideal, el tamaño de los poros de la lámina 3 es de 0,2 \mum (límite de filtración estéril), donde además se consigue una protección estéril de la cámara celular 5. Es posible sin embargo utilizar tamaños de poro más grandes o más pequeños. Estos pueden elegirse tan pequeños que por ejemplo, los virus, que se emplean para los experimentos de transfección en por ejemplo, hepatocitos, o células de médula ósea o queratinocitos, se mantienen en la correspondiente cámara celular 5.

Como material de las láminas puede emplearse por ejemplo teflón, silicona, policarbonato o poliéster. Para la lámina 3 microporosa es especialmente apropiado el policarbonato o poliéster debido a su transparencia.

Las superficies de láminas y tubos pueden estar recubiertas de heparina, para que se reduzca una activación complementaria.

Con el dispositivo conforme a la invención pueden tratarse también células de plantas o algas, para producir por ejemplo oxígeno, que en los bioreactores transparentes pueden accionar la fotosíntesis. Esto podría, por ejemplo, ser empleado en el viaje espacial, para absorber el CO_{2} y concentrar O_{2}.

Además, este tipo de sistemas pueden emplearse en la utilización de bacterias para intoxicar atmósferas impuras con gases.

Claims (23)

1. Dispositivo para el cultivo y/o tratamiento de células con las características siguientes:

1.1

sobre un soporte permeable al agua(1) se dispone una primera cámara (cámara celular 5)

1.2

la primera cámara (cámara celular 5) se ha configurado por medio de una primera lámina(2) permeable al gas, no permeable a los líquidos, que se coloca sobre el soporte(1), y una segunda lámina microporosa(3), que se dispone sobre la primera lámina(2) o bien forma con ésta una sola pieza,

1.3

al menos una de ambas láminas(2,3) es elástica de tal forma que el volumen final de la primera cámara(5) puede absorber un múltiplo de su volumen de partida y

1.4

la primera cámara(5) posee al menos una tubería de entrada y/o de salida (7,9).

2. Dispositivo conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza por, que sobre la segunda lámina(3) se dispone una tercera lámina(4) que está conectada a ésta o forma con ésta una sola pieza, donde la segunda lámina(3) y/o la tercera lámina(4) es o son elásticas de tal forma que entre la segunda lámina(3) y la tercera lámina(4) se fabrica una segunda cámara (6), cuyo volumen final puede ser un múltiplo de su volumen de partida, donde la segunda lámina(3) se ha configurado como una lámina microporosa, que permite el paso de las sustancias seleccionadas de la primera cámara (cámara celular 5) a la segunda cámara (6), donde la segunda cámara(6) está dotada de cómo mínimo un tubo de salida y/o de entrada (9,10).

3. Dispositivo conforme a la reivindicación 1 ó 2, que se caracteriza por, que un múltiplo de las cámaras celulares(5) configuradas a partir de la primera y segunda lámina (2,3) y de las segundas cámaras (6) configuradas a partir de la segunda y tercera láminas (3,4) se colocan unas sobre otras.

4. Dispositivo conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 3, que se caracteriza por, que sobre la tercera lámina (3,4) se coloca un marco o armazón(11).

5. Dispositivo conforme a la reivindicación 4, que se caracteriza por, que el armazón(11) está provisto en su lado inferior de unos elementos sellantes y/o de apriete.

6. Dispositivo conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 4, que se caracteriza por, que las láminas se unen en sus bordes con el soporte(1) y/o entre ellas.

7. Dispositivo conforme a la reivindicación 6, que se caracteriza por, que las láminas (2,3,4) se pegan al soporte (1).

8. Dispositivo conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 7, que se caracteriza por, que los conductos de entrada y salida (7,8,9,10) se configuran como unidades prefabricadas que se fijan a través de la lámina correspondiente (2,3,4), y que se fijan al soporte(1).

9. Dispositivo conforme a la reivindicación 8, que se caracteriza por, que las unidades prefabricadas están unidas al soporte (1) a través de suspensiones.

10. Dispositivo conforme a la reivindicación 8 ó 9, que se caracteriza por, que cada unidad prefabricada tiene una pieza tubular(14) con un segmento de rosca, sobre la cual se atornilla una tuerca(16), donde el soporte(1) está engarzado entre el elemento superior o de cabeza de la pieza tubular(14) y la tuerca (16).

11. Dispositivo conforme a la reivindicación 10, que se caracteriza por, que entre el elemento superior(15) y el soporte(1) y/o una lámina(2 ó 3) se disponen los aros sellantes o el soporte distanciador(19).

12. Dispositivo conforme a una o varias de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por, que las láminas (2,3,4) constan de teflón, silicona, policarbonato o poliéster.

13. Dispositivo conforme a una o varias de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por, que el soporte(1) se ha configurado como una placa de perfil perforado o de rejilla.

14. Dispositivo conforme a una o varias de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por, que los conductos de entrada y salida (7,8,9,10) se integran en la tercera lámina y la segunda lámina como una unidad.

15. Dispositivo conforme a una o varias de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por, que la cámara celular(5) está subdividida en dos compartimientos por una lámina intermedia(21)

16. Procedimiento para el cultivo y/o tratamiento de células en las fases siguientes:

16.1

en un soporte permeable al gas (1) se coloca una primera lámina(2) permeable a gases y no permeable a líquidos,

16.2

sobre la primera lámina(2) se coloca una segunda lámina microporosa(3) , donde al menos una de las dos láminas (2,3) es elástica,

16.3

sobre la segunda lámina(3) se coloca una tercera lámina(4), donde la segunda o la tercera lámina(3 ó 4) es elástica,

16.4

las láminas (2,3 y 4) se sellan en sus bordes,

16.5

entre la primera lámina(2) y la segunda lámina(3) se introducen las células(12) para su cultivo y/o tratamiento,

16.6

entre la segunda y la tercera lámina(3,4) se introduce un segundo medio, y

16.7

los volúmenes en ambas cámaras configuradas de esta forma (5,6) varían conforme a las exigencias establecidas