JP5816073B2 - 組織再生材料の作製方法及び組織再生材料 - Google Patents
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Description
作製方法S10は、載置工程S11、細胞懸濁液導入工程S12、及び反転工程S13を備えている。
ここで保持板1は接触角が水に対して15°〜90°の樹脂板又はガラス板であることが好ましい。このような保持板1は、従来から細胞を静置培養する容器として用いられている、シャーレ、フラスコ、マルチウェル等に使用されているガラス材料や、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート等の樹脂材料を板状に加工して用いることができる。これらの材料は疎水性が高いことがあるので必要に応じて、多孔質体11を接触させる面を、コロナ、γ線、アルゴン線等のプラズマ処理等の化学的な方法で極性基を導入し親水性を高め、接触角が水に対して15°〜90°となるようにしておくことが好ましい。また、接触させる面にセラミックス皮膜を形成させておいてもよい。接触させる面は平滑であることが好ましいが、高さ数百μmの溝や筋状突起等が設けられていてもよい。
また、平均孔径は540μm〜1200μmであることが好ましい。
そのときの多孔質体の底面積(保持板1に接する面の面積)は、厚さに対して十分な大きさの面積を有する形状であることが好ましい。具体的には、多孔質体の体積1cm3〜50000cm3の範囲において、底面積が0.5cm2〜200cm2であることが好ましい。0.5cm2未満又は200cm2を超えると保持板に吊り下げた状態で播種することが難しくなる。なお、多孔質体には、生体吸収性高分子材料内に粉末状のリン酸カルシウム、例えばハイドロキシアパタイトやβ三リン酸カルシウムを分散させてもよい。
ここで仮載置板2は撥水性のある板、保持板1は親水性のある板により構成されているので、細胞懸濁液で満たされた多孔質体の上記したような保持、離脱が適切に行われる。
移植細胞A:ヒト腸骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞
ヒト腸骨骨髄液から採取した細胞を10%FBS、DMEM培地で懸濁した後、有核細胞数1×105cell/10cm直径培養皿へ播種した。37℃にて5%炭酸ガス存在下で培養した。3日目で培地を交換し、非接着細胞(造血系細胞)を除いた。以後3日に1回培地を交換した。bFGFは5日目から3ng/mlで培地に添加した。10日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン(0.05%)+EDTA(0.2mM)で5分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター(Z1シングル、コールター社製)で計測し、5000cell/cm2の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的(コンフルエント)になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
ヒト顎骨骨髄液から採取した細胞を10%FBS、DMEM培地で懸濁した後、有核細胞数1×105cell/10cm直径培養皿へ播種した。37℃にて5%炭酸ガス存在下で培養した。3日目で培地を交換し、非接着細胞(造血系細胞)を除いた。以後3日に1回培地を交換した。bFGFは5日目から3ng/mlで培地に添加した。10日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン(0.05%)+EDTA(0.2mM)で5分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター(Z1シングル、コールター社製)で計測し、5000cell/cm2の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的(コンフルエント)になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
ヒト耳介軟骨をメスで細かく切りわけ、コラゲナーゼで37℃30分間処理した細胞懸抱濁液を10%FBS、DMEM培地で懸濁した後、有核細胞数1×105cell/10cm直径培養皿へ播種した。37℃にて5%炭酸ガス存在下で培養した。3日目で培地を交換し、非接着成分(細胞+組織片)を除いた。以後3日に1回培地を交換した。bFGFは5日目から3ng/mlで培地に添加した。10日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン(0.05%)+EDAT(0.2mM)で5分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター(Z1シングル、コールター社製)で計測し、5000cell/cm2の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的(コンフルエント)になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
多孔質体A:ポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)ブロック
分子量250000のDL−乳酸/グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径500μm前後の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し、粉砕して脱塩することで得られるパウダー状材料を圧縮加熱成型することによって、平均孔径540μm、気孔率90%、圧縮強度0.2MPa、直径9mmで厚さ3mmの生体吸収性合成高分子からなるブロック状の多孔質体を作製した。
分子量250000のDL−乳酸/グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径10μmのハイドロキシアパタイト粉を分散させ、粒径500μm前後の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し、粉砕して脱塩することで得られるパウダー状材料を圧縮加熱成型することによって、平均孔径540μm、気孔率90%、圧縮強度0.2MPa、直径13mmで厚さ5mmの生体吸収性合成高分子+リン酸カルシウム材料からなるブロック状の多孔質体を作製した。
多孔質体Aの円盤状の底面をガラス板(大きさ100mm×100mm×2mm、水に対する接触角28°)の上面に接触させ載置した。軟骨分化用培養液(αMEM、グルコース4.5mg/ml、10−7Mデキサメサゾン、50μg/mlのアスコルビン酸−2−リン酸、10ng/mlのTGF−β、6.25μg/mlのインスリン、6.25μg/mlのトランスフェリン、6.25ng/mlのセレン酸、5.33μg/mlのリノレイン酸、1.25mg/mlのウシ血清アルブミン)に2×107cell/mlの密度で懸濁させた0.19mlの移植細胞Aを多孔質体Aに滴下して導入した。ガラス板を反転させ逆さまにした状態で37℃、湿度100%、5%CO2条件下で30分間材料に細胞を接着させることで多孔質体Aに細胞を播種して組織再生材料を得た。
その後、軟骨分化用培養液で満たした50ml遠沈管に入れて37℃にて3日毎に培地を交換しながら4週間培養して軟骨組織再生用細胞移植体を作製することができた。
多孔質体Bの円盤状の底面をプラズマ処理ポリスチレン板(大きさ50mm×50mm×2mm、水に対する接触角71°)の上面に接触させ載置した。骨分化用培養液(αMEM、グルコース4.5mg/ml、10%のFBS、10−7Mデキサメサゾン、50μg/mlのアスコルビン酸−2−リン酸、10mMのβグリセロリン酸)に5×107cell/mlの密度で懸濁させた0.67mlの移植細胞Bを多孔質体Bに滴下して導入した。プラズマ処理ポリスチレン板を反転させ逆さまにした状態で37℃、湿度100%、5%CO2条件下で100分間材料に細胞を接着させることで多孔質体Bに細胞を播種し組織再生材料を得た。
その後、骨分化用培養液で満たした50ml遠沈管に入れて37℃にて3日毎に培地を交換しながら2週間培養して骨組織再生用細胞移植体を作製することができた。
多孔質体Bの円盤状の底面をプラズマ処理アクリル板(大きさ50mm×50mm×2mm、水に対する接触角58°)の上面に接触させ載置した。軟骨分化用培養液(αMEM、グルコース4.5mg/ml、10−7Mデキサメサゾン、50μg/mlのアスコルビン酸−2−リン酸、10ng/mlのTGF−β、6.25μg/mlのインスリン、6.25μg/mlのトランスフェリン、6.25ng/mlのセレン酸、5.33μg/mlのリノレイン酸、1.25mg/mlのウシ血清アルブミン)に2×107cell/mlの密度で懸濁させた0.67mlの移植細胞Cを多孔質体Bに滴下して導入した。プラズマ処理アクリル板を反転させ逆さまにした状態で37℃、湿度100%、5%CO2条件下で30分間材料に細胞を接着させることで多孔質体Bに細胞を播種し組織再生材料を得た。
その後、軟骨分化用培養液で満たした50ml遠沈管に入れて37℃にて3日毎に培地を交換しながら4週間培養して軟骨組織再生用細胞移植体を作製することができた。
多孔質体Aを、撥水処理されたガラス板(大きさ50mm×50mm×2mm、水に対する接触角114°)の上に置いた。骨分化用培養液(αMEM、グルコース4.5mg/ml、10%のFBS、10−7Mデキサメサゾン、50μg/mlのアスコルビン酸−2−リン酸、10mMのβグリセロリン酸)に5×107cell/mlの密度で懸濁させた0.19mlの移植細胞Bを多孔質体Aに滴下し導入した。多孔質体Aが置かれたガラス板の上からプラズマ処理ポリスチレン板(大きさ50mm×50mm×2mm、水に対する接触角71°)を静かに下ろして多孔質体Aを軽く挟むようにしてプラズマ処理ポリスチレン板面に接触させた。接触させたプラズマ処理ポリスチレン板をゆっくりと引き上げ、多孔質体Aをプラズマ処理ポリスチレン板側に保持させガラス板から離脱させた。多孔質体Aは重力方向から見てプラズマ処理ポリスチレン板が上側となり、且つプラズマ処理ポリスチレン板の重さが多孔質体Aに加わらない状態で気体中で静止させ、逆さまにした状態で37℃、湿度100%、5%CO2条件下で100分間材料に細胞を接着させることで多孔質体Aに細胞を播種し組織再生材料を得た。
その後、骨分化用培養液で満たした50ml遠沈管に入れて37℃にて3日毎に培地を交換しながら2週間培養して骨組織再生用細胞移植体を作製することができた。
2 仮載置板
10 組織再生材料
11 多孔質体
12 細胞懸濁液
Claims (1)
- 接触角が水に対して15〜90°の樹脂板又はガラス板である保持板の面に、
細胞密度が5×106〜1×108cell/mlの細胞懸濁液で満たされた、厚さが2〜100mm、孔径180〜3500μm、平均孔径350〜2000μmの連通した小孔構造を有し、気孔率が60〜95%、圧縮強度が0.05〜1MPaの生体吸収性高分子材料から成る多孔質体の底面を接触させ、
その後、重力方向から見て前記保持板が前記多孔質体の上側となり、且つ前記保持板の重さが前記多孔質体に加わらない状態で気体中で静止させて細胞を播種する組織再生材料の作製方法。
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