KR101847655B1

KR101847655B1 - 조직 재생 재료의 제작 방법 및 조직 재생 재료

Info

Publication number: KR101847655B1
Application number: KR1020120144074A
Authority: KR
Inventors: 가츠유키 야마나카; 가츠시 야마모토; 유우히로 사카이; 유수케 시게미츠
Original assignee: 가부시키가이샤 지씨
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2018-04-10
Also published as: JP5816073B2; EP2604684B1; CN103157142A; US20130156820A1; JP2013123429A; EP2604684A1; KR20130069429A; CN103157142B

Abstract

본 발명에 따르면, 비교적 큰 구멍, 즉 세포 현탁액을 지지체 내에 체류시켜 두기가 어려운 소구멍을 갖는 다공질의 지지체(다공질체)에 세포 현탁액을 안정적으로 낭비없이 파종하여 배양하는 것이 가능한 조직 재생 재료의 제작 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따르면, 접촉각이 물에 대하여 15 내지 90°인 수지판 또는 유리판인 보유판(1)의 면에, 세포 밀도가 5×10⁶ 내지 1×10⁸cell/㎖인 세포 현탁액(12)으로 채워진, 두께 2 내지 100mm, 공경 180 내지 3500㎛, 평균 공경 350 내지 2000㎛의 연통된 소구멍 구조를 갖고, 기공률이 60 내지 95％, 압축 강도가 0.05 내지 1MPa인 생체 흡수성 고분자 재료를 포함하는 다공질체(11)의 저면을 접촉시키고, 그 후 중력 방향으로부터 보아 보유판이 다공질체의 상측이 되며, 보유판의 무게가 다공질체에 가해지지 않은 상태에서 기체 중에서 정지시켜 다공질체에 세포를 파종한다.

Description

조직 재생 재료의 제작 방법 및 조직 재생 재료 {PRODUCTION METHOD OF TISSUE REGENERATION MATERIAL AND TISSUE REGENERATION MATERIAL}

본 발명은 다공질의 지지체(다공질체)에 세포 현탁액을 도입하여 파종하는 조직 재생 재료의 제작 방법, 및 조직 재생 재료에 관한 것이다.

연통된 다공질 구조를 갖는 지지체인 다공질체에 세포가 파종된 조직 재생 재료가 조직 공학 분야에서 사용되고 있다. 다공질체 내에는 세포를 배양하기 위한 소구멍이 3차원적으로 연통되어 중심부까지 존재하고 있는 것이 중요하다.

실제로는 다공질체의 소구멍 내에 세포, 배양액, 배양액에 세포가 혼합된 액(이후, 「세포 현탁액」이라고 하기도 함)을 완전히 침투시키는 것이 어려워, 단순히 다공질체에 세포 현탁액을 적하하거나, 다공질체를 세포 현탁액 내에 침지하거나 하여도 세포 현탁액은 다공질체의 중심부까지 들어가지 않는다.

이에 대하여, 특허문헌 1에는, 예를 들면 청구항 8에 기재된 바와 같이 다공질체를 세포 현탁액 내에 침지하여 감압 또는 진공하에 둠으로써 다공질체 내에 세포 현탁액을 침투시키는 방법이 제안되어 있다.

특허문헌 2, 3에는 다공질체에 물을 포함시켜 두고, 이 물과 세포 현탁액을 동시에 교체함으로써 세포 현탁액을 다공질체 내에 도입하는 방법이 개시되어 있다.

특허문헌 4에는 다공질체에 형성된 구멍을 비교적 크게 하여 세포 현탁액이 들어가기 쉽게 함과 함께, 이와 같이 비교적 큰 구멍이라도 세포 현탁액을 다공질체 내에 체류시키기 위하여, 세포 현탁액에 콜라겐이나 젤라틴 등 증점 성분을 첨가하는 방법이 개시되어 있다. 이에 따르면, 다공질체 내에 세포 현탁액을 도입하여 체류시켜 둘 수 있다고 되어 있다.

일본 특허 공표 제2006-508717호 공보 일본 특허 공개 제2007-181459호 공보 일본 특허 공개 제2009-195682호 공보 일본 특허 공개 제2003-038635호 공보

그러나, 특허문헌 1에 기재된 기술에서는 부압을 이용하여도 실제로는 다공질체 전체에 세포 현탁액을 침투시키는 것은 어렵기 때문에, 세포 현탁액을 침투시키는 경로를 레이저광 등으로 형성할 필요가 있다. 또한, 부압을 이용하여 압력을 크게 변화시키는 것은 세포에 있어서 반드시 바람직한 상태라고는 할 수 없다.

특허문헌 2, 3에 개시되어 있는 기술에서는 다공질체 전체에 세포를 파종하는 것은 가능하지만, 세포 현탁액의 일부가 흘러 나와 버리기 때문에 도입한 세포의 수가 정확하지 않게 된다고 하는 결점이 있었다.

특히 특허문헌 1 내지 3에 기재된 기술에서는 다공질체의 소구멍이 비교적 작고, 물을 주성분으로 하는 세포 현탁액이 충분히 다공질체의 중심부까지 침투할 수 없는 데에 문제가 있었다. 따라서, 비교적 큰 구멍(공경 180㎛ 내지 3500㎛, 평균 공경 350㎛ 내지 2000㎛)의 소구멍 구조를 갖는 다공질체를 이용하면 세포 현탁액을 중심까지 용이하게 침투시킬 수 있다. 그러나, 이러한 큰 공경에서는 세포 현탁액이 용이하게 다공질체 내를 통과해 버려, 세포 현탁액을 다공질체 내에 체류시키기가 어려워지게 된다.

이에 대하여 특허문헌 4에 기재된 기술에 따르면, 세포 현탁액을 다공질체의 중심까지 용이하게 침투시킬 수 있지만, 증점 성분이 다공질체 내에 남기 때문에 새로운 배양액의 교환이 어려워지는 문제가 있다.

따라서, 본 발명은 비교적 큰 구멍(공경 180㎛ 내지 3500㎛, 평균 공경 350㎛ 내지 2000㎛), 즉 세포 현탁액을 다공질체 내에 체류시켜 두는 것이 어려운 소구멍을 갖는 다공질체에 세포 현탁액을 안정적으로 낭비없이 도입하고, 세포를 파종하는 것이 가능한 조직 재생 재료의 제작 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 조직 재생 재료를 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 설명한다. 여기서는 이해하기 쉽도록 도면에 붙인 참조 부호를 괄호 안에 병기하지만, 본 발명은 이것에 한정되는 것이 아니다.

청구항 1에 기재된 발명은, 접촉각이 물에 대하여 15 내지 90°인 수지판 또는 유리판인 보유판(1)의 면에, 세포 밀도가 5×10⁶ 내지 1×10⁸cell/㎖인 세포 현탁액(12)으로 채워진, 두께 2 내지 100mm, 공경 180 내지 3500㎛, 평균 공경 350 내지 2000㎛의 연통된 소구멍 구조를 갖고, 기공률이 60 내지 95％, 압축 강도가 0.05 내지 1MPa인 생체 흡수성 고분자 재료를 포함하는 다공질체(11)의 저면을 접촉시키고, 그 후 중력 방향으로부터 보아 보유판이 다공질체의 상측이 되며, 보유판의 무게가 다공질체에 가해지지 않은 상태에서 기체 중에서 정지시켜 세포를 파종하는 조직 재생 재료의 제작 방법이다.

청구항 2에 기재된 발명은, 두께 2 내지 100mm, 공경 180 내지 3500㎛, 평균 공경 350 내지 2000㎛의 연통된 소구멍 구조를 갖고, 기공률이 60 내지 95％, 압축 강도가 0.05 내지 1MPa인 생체 흡수성 고분자 재료를 포함하는 다공질체(11)에, 5×10⁶ 내지 1×10⁸cell/㎖의 농도로 세포(13)가 파종되어 있는 조직 재생 재료(10)이다.

청구항 3에 기재된 발명은, 청구항 2에 기재된 조직 재생 재료(10)에 있어서, 다공질체(11)의 기공률이 80 내지 90％이다.

청구항 4에 기재된 발명은, 청구항 2 또는 3에 기재된 조직 재생 재료(10)에 있어서, 다공질체(11)의 평균 공경이 540 내지 1200㎛이다.

청구항 5에 기재된 발명은, 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 조직 재생 재료(10)의 다공질체(11)에 있어서, 보유판(1)에 접촉하여 배치되어야 할 면인 저면의 면적이 0.5 내지 200cm²이다.

본 발명에 따르면, 비교적 큰 구멍, 즉 세포 현탁액을 그 내측에 체류시켜 두기가 어렵다고 되어 있는 소구멍을 갖는 다공질체에 세포 현탁액을 도입할 수 있고, 상기 다공질체에 안정적으로 낭비없이 세포를 파종할 수 있다.

도 1은 조직 재생 재료의 제작 방법 S10의 공정을 설명하는 도면이다.
도 2는 조직 재생 재료의 제작 방법 S10의 공정을 설명하는 다른 도면이다.
도 3은 다공질체의 다른 형태예를 도시하는 도면이다.
도 4는 조직 재생 재료의 제작 방법 S20의 공정을 설명하는 도면이다.
도 5는 조직 재생 재료의 제작 방법 S20의 공정을 설명하는 다른 도면이다.

본 발명의 상기한 작용 및 이득은, 다음에 설명하는 발명을 실시하기 위한 형태로부터 명확해진다. 이하, 본 발명을 도면에 도시하는 실시 형태에 기초하여 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시 형태에 한정되는 것이 아니다.

도 1, 도 2는 하나의 실시 형태에 관한 조직 재생 재료의 제작 방법 S10(이하, 「제작 방법 S10」이라고도 함)을 설명하는 도면이다. 도 1, 도 2는 제작 방법 S10의 공정에서의 장면을 도시하는 도면이다. 여기서, 조직 재생 재료(10)는 세포가 파종된 다공질체(11)를 의미한다.

제작 방법 S10은, 적재 공정 S11, 세포 현탁액 도입 공정 S12 및 반전 공정 S13을 구비하고 있다.

적재 공정 S11은, 도 1의 (a)에 도시한 바와 같이 보유판(1) 상에 다공질체(11)를 적재하는 공정이다.

여기서, 보유판(1)은 접촉각이 물에 대하여 15°내지 90°인 수지판 또는 유리판인 것이 바람직하다. 이러한 보유판(1)은, 종래부터 세포를 정치 배양하는 용기로서 이용되고 있는, 페트리 접시, 플라스크, 멀티웰 등에 사용되고 있는 유리 재료나, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등의 수지 재료를 판형으로 가공하여 이용할 수 있다. 이들 재료는 소수성이 높은 경우가 있기 때문에, 필요에 따라 다공질체(11)를 접촉시키는 면을 코로나, γ선, 아르곤선 등의 플라즈마 처리 등의 화학적인 방법으로 극성기를 도입하여 친수성을 높이고, 접촉각이 물에 대하여 15°내지 90°가 되도록 해 두는 것이 바람직하다. 또한, 접촉시키는 면에 세라믹 피막을 형성시켜 둘 수도 있다. 접촉시키는 면은 평활한 것이 바람직하지만, 높이 수백㎛의 홈이나 줄무늬형 돌기 등이 설치되어 있을 수도 있다.

다공질체(11)는 생체 흡수성 고분자 재료로 형성되어 있으며, 두께(보유판(1)에 적재한 자세로 상하 방향의 크기)가 2mm 내지 100mm가 되며, 바람직하게는 2.1mm 내지 70mm이다. 다공질체(11)는 공경 180㎛ 내지 3500㎛, 평균 공경 350㎛ 내지 2000㎛의 연통된 소구멍 구조를 갖고, 기공률이 60％ 내지 95％로 되어 있다. 또한, 다공질체(11)의 압축 강도는 0.05MPa 내지 1MPa이 되도록 구성되어 있다. 또한, 본 발명에서의 다공질체의 구멍의 공경이란, 10㎛를 하회하는 액체만을 통과시키는 미소 기공은 고려하지 않고, 다공질체 전체에 있어서 10㎛ 이상의 기공의 80％ 이상이 공경 180㎛ 내지 3500㎛인 것을 의미하고 있다. 또한, 여기서 「기공률」은, 사용된 생체 흡수성 고분자 재료의 원료 덩어리의 중량에 대한 동일 부피의 다공질체의 중량으로부터 산출된 값이다.

여기서, 기공률이 60％보다도 작으면 세포 배양의 효율이 낮아지고, 95％를 초과하면 다공질체의 강도가 저하된다. 따라서, 기공률은 80％ 내지 90％인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 공경이 180㎛보다 작으면 세포를 자유롭게 통과시키는 것이 곤란하게 되어, 다공질체의 내부까지 충분히 세포를 파종할 수 없다. 한편, 공경이 3500㎛보다도 크면 다공질체의 강도가 저하되어 버린다.

또한, 평균 공경은 540㎛ 내지 1200㎛인 것이 바람직하다.

상기 압축 강도에 대하여, 압축 강도가 0.05MPa보다도 작으면, 다공질체가 세포 현탁액을 첨가하였을 때의 표면 장력이나, 세포의 배양시에 세포 현탁액으로부터 받는 세포의 신전 응력으로 수축되어 버린다. 한편, 1MPa을 초과하는 다공질체를 제작하는 것은 기술적으로 어렵다. 또한, 여기서 「압축 강도」란, 직경 10mm×높이 2mm의 원주형의 시험체를 크로스 헤드 속도 1mm/분으로 압축시켰을 때의 압축 파괴 강도를 의미한다.

다공질체의 두께에 대해서는, 다공질체의 중심부까지 세포 현탁액을 충분히 침투시키는 것이 목적이기 때문에, 두께가 2mm 미만인 것을 이용할 필요성은 적다. 한편, 100mm를 초과하면, 세포를 도입하거나 장기간 배양하거나 하는 것이 어려워진다.

이러한 다공질체의 형상은, 도 1, 도 2에 도시한 바와 같이 입방체를 기본으로 하고, 그 밖에 반원형이나 돔형이 바람직하지만, 후술하는 바와 같이 반전 공정 S13을 거쳐 중력 방향으로부터 보아 상기한 보유판(1)이 상측이 되며 보유판(1)의 무게가 다공질체에 가해지지 않은 상태에서 기체 중에서 정지시켜 세포를 파종하는 것이 가능하면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 도 3에 도시한 바와 같이 원판형일 수도 있다.

그 때의 다공질체의 저면 면적(보유판(1)에 접하는 면의 면적)은, 두께에 대하여 충분한 크기의 면적을 갖는 형상인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 다공질체의 부피 1cm³ 내지 50000cm³의 범위에 있어서, 저면 면적이 0.5cm² 내지 200cm²인 것이 바람직하다. 0.5cm² 미만 또는 200cm²를 초과하면 보유판에 현수한 상태에서 파종하는 것이 어려워진다. 또한, 다공질체에는 생체 흡수성 고분자 재료 내에 분말형의 인산칼슘, 예를 들면 히드록시아파타이트나 β 3인산칼슘을 분산시킬 수도 있다.

다공질체를 구성하는 재료는 생체 흡수성 고분자 재료이며, 일정 기간 체내에서 그 형태를 유지할 수 있으면 특별히 한정되지 않고 이용할 수 있다. 예를 들면, 종래부터 이용되고 있는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 락트산-글리콜산 공중합체, 폴리-ε-카프로락톤, 락트산-ε-카프로락톤 공중합체, 폴리아미노산, 폴리오르토에스테르 및 이들의 공중합체 중에서 선택되는 적어도 1종을 예시할 수 있다. 그 중에서도 폴리글리콜산, 폴리락트산, 락트산-글리콜산 공중합체가, 미국 식품 의약청(FDA)으로부터 인체에 무해한 고분자로서 승인되어 있는 것 및 그 실적면에서 가장 바람직하다. 생체 흡수성 고분자 재료의 중량 평균 분자량은 5000 내지 2000000인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10000 내지 500000이다.

다공질체의 제작 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 유기 용매에 생체 흡수성 고분자 재료가 용해된 용액에 그 유기 용매에는 용해되지 않으며 생체 흡수성 고분자 재료를 용해하지 않는 액으로 용해되는 입경이 100㎛ 내지 2000㎛인 입자형 물질을 대략 균일하게 혼합하여 동결한다. 그 후에 건조하여 유기 용매를 제거함으로써 입자형 물질을 함유한 공경이 5㎛ 내지 50㎛인 소구멍 구조를 갖는 다공질 생체 흡수성 고분자를 제작한다. 그리고, 이 다공질 생체 흡수성 고분자를 밀 등으로 분쇄하고 나서 입자형 물질을 생체 흡수성 고분자를 용해하지 않는 액으로 용해하여 제거한 후, 체에 걸러 100㎛ 내지 3000㎛의 평균 입경의 생체 흡수성 과립형 다공질 물질로 하고, 이들 생체 흡수성 과립형 다공질 물질을 소정 형상의 용기 내에 넣어 가압하여 가열하는 제작 방법을 들 수 있다.

계속해서, 제작 방법 S10에 대하여 설명한다. 적재 공정 S11에 의해 보유판(1)의 면에 다공질체(11)가 적재된 자세가 되고, 다음에 세포 현탁액 도입 공정 S12에서, 도 1의 (b)에 도시한 바와 같이 다공질체(11)에 세포 현탁액(12)이, 예를 들면 적하나 주입 등의 방법에 의해 도입된다. 이에 의해, 도 2의 (a)에 도시한 바와 같이, 세포 현탁액(12)이 다공질체(11) 내에 침투함과 함께, 다공질체(11)가 세포 현탁액(12)에 의해 전체가 채워진 상태가 된다. 이 때, 다공질체(11)의 부피에 대하여 세포 현탁액(12)의 양이 지나치게 많으면, 후술하는 반전 공정 S13을 행하기 어려워지거나, 배양의 효율이 저하되기도 하는 경향이 있기 때문에, 다공질체(11) 전체를 침지하며, 다공질체(11)로부터 지나치게 누출되지 않는 양의 세포 현탁액을 도입하는 것이 바람직하다.

도입되는 세포 현탁액은, 세포 밀도가 5×10⁶cell/㎖ 내지 1×10⁸cell/㎖인 것으로 되어 있다. 또한, 배양되는 세포는 여러가지 세포가 자유롭게 사용 가능하다. 예를 들면, 표피 세포, 케라틴 생성 세포, 지방 세포, 간세포(肝細胞), 신경 세포, 신경교세포, 별 모양 교세포, 상피 세포, 유방 표피 세포, 조세포(鳥細胞), 내피 세포, 간엽 세포, 진피 섬유아세포, 간피 세포, 조골 세포, 평활근 세포, 횡문근 세포, 인대 섬유아세포, 힘줄 섬유아세포 및 연골 세포, 골수 세포, 골아세포, 치배 세포, 치근막 세포, 치수 세포, 체성 줄기 세포 또는 ES 세포 등을 이용할 수 있다.

다음에, 반전 공정 S13에 의해, 도 2의 (a)에서 도시한 상태로부터, 보유판(1)이 위, 세포 현탁액(12)이 포함된 다공질체(11)가 아래가 되도록 반전시켜, 도 2의 (b)에 도시한 바와 같은 자세로 한다. 즉, 중력 방향으로부터 보아 보유판(1)이 다공질체(11)의 상측이 되며, 보유판(1)의 무게가 다공질체(11)에 가해지지 않은 상태에서 기체 중에서 정지시킨다. 이 상태에서 정지를 유지하고, 도입된 세포를 다공질체(11)의 구멍 내벽에 접착시켜 파종이 완료되어 조직 재생 재료(10)가 된다. 다공질체에 세포를 접착시키기 위하여 기체 중에서 정지시키는 시간은 다공질체의 재질이나 세포의 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로는 20분 내지 300분이다.

이상과 같은 제작 방법 S10에 따르면, 다공질체(11)가 비교적 큰 구멍을 갖기 때문에, 세포 현탁액을 다공질체(11)의 내부에까지 적절하게 침투시킬 수 있다. 그리고, 최종적으로 세포 현탁액을 상기한 바와 같이 중력 방향으로부터 보아 보유판(1)이 다공질체(11)의 상측이 되며, 보유판(1)의 무게가 다공질체(11)에 가해지지 않은 상태에서 기체 중에 정지시킴으로써, 다공질체(11)로부터 세포 현탁액(12)이 누출되지 않도록 유지할 수 있다. 그리고, 세포 현탁액(12)을 안정적으로 낭비없이 도입하여 세포를 다공질체 내에 파종하는 것이 가능해진다. 이후, 세포가 파종된 다공질체인 조직 재생 재료(10)는, 종래의 방법에 의해 세포 배양을 행할 수 있다.

또한, 이러한 제작 방법을 실현하기 위하여 상기에 나타낸 바와 같은 세포 현탁액이 파종된 다공질체가 이용되는 것이 바람직하다. 이에 의해, 상기 효과를 발휘하는 것이 가능한 조직 재생 재료로 하는 것이 가능해진다.

도 4, 도 5는 다른 실시 형태에 관한 조직 재생 재료의 제작 방법 S20(이하, 「제작 방법 S20」이라고도 함)을 설명하는 도면이다. 도 4, 도 5는 제작 방법 S20의 공정에서의 장면을 도시하는 도면이다. 또한, 본 실시 형태 중, 상기한 하나의 실시 형태에서 설명한 것과 공통되는 부분에 대해서는 동일한 부호를 붙여 설명을 생략한다.

제작 방법 S20은, 임시 적재 공정 S21, 세포 현탁액 도입 공정 S22, 협지 공정 S23 및 보유 공정 S24를 구비하고 있다.

임시 적재 공정 S21은, 발수성이 높은 판형 부재인 임시 적재판(2)에 다공질체(11)를 적재하는 공정이다. 임시 적재판(2)은 접촉각이 물에 대하여 90°보다 큰 수지판 또는 유리판인 것이 바람직하다.

세포 현탁액 도입 공정 S22는, 상기한 세포 현탁액 도입 공정 S12와 마찬가지 다공질체(11)에 세포 현탁액(12)이 도입된다. 이에 의해, 도 4의 (b)에 도시한 바와 같이 세포 현탁액(12)이 침투하여 다공질체(11) 전체에 채워진 상태가 된다.

협지 공정 S23은, 도 5의 (a)에 도시한 바와 같이 세포 현탁액으로 채워진 다공질체(11)를 임시 적재판(2)과의 사이에 끼우도록 보유판(1)의 면에 다공질체(11)를 접촉시키는 공정이다.

보유 공정 S24는, 도 5의 (b)에 도시한 바와 같이 다공질체(11)를 접촉시킨 보유판(1)을 들어올려, 다공질체(11)를 보유판(1)측에 보유시켜 임시 적재판(2)으로부터 이탈시키는 공정이다. 이에 의해, 다공질체(11)는 상기 하나의 실시 형태와 마찬가지로 중력 방향으로부터 보아 보유판(1)이 다공질체(11)의 상측이 되며, 보유판(1)의 무게가 다공질체(11)에 가해지지 않은 상태에서 기체 중에서 정지시킨다. 이 상태에서 정지를 유지하고, 도입된 세포를 다공질체(11)의 내벽에 접착시켜 파종이 완료되어 조직 재생 재료(10)가 된다.

여기서, 임시 적재판(2)은 발수성이 있는 판, 보유판(1)은 친수성이 있는 판에 의해 구성되어 있기 때문에, 세포 현탁액으로 채워진 다공질체의 상기한 바와 같은 보유, 이탈이 적절하게 행해진다.

<실시예>

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 나타내지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니다.

<이식 세포의 준비>

이식 세포 A: 인간 장골(腸骨) 골수액으로부터 채취한 간엽계 줄기 세포

인간 장골 골수액으로부터 채취한 세포를 10％ FBS, DMEM 배지에서 현탁한 후, 유핵 세포수 1×10⁵cell/10cm 직경 배양 접시에 파종하였다. 37℃에서 5％ 탄산 가스 존재하에서 배양하였다. 3일째에 배지를 교환하고, 비접착 세포(조혈계 세포)를 제거하였다. 이후 3일에 1회 배지를 교환하였다. bFGF는 5일째부터 3ng/㎖로 배지에 첨가하였다. 10일 전후에 거의 집밀적으로까지 증식하였다. 이들 배양 접시를 트립신(0.05％)+EDTA(0.2mM)로 5분간 인큐베이션하여 세포를 단리하였다. 세포수를 쿨터 카운터(Z1 싱글, 쿨터사 제조)로 계측하고, 5000cell/cm²의 밀도로 세포를 파종하였다. 이 조작을 반복하여, 거의 집밀적(콘플루언트)으로 된 2대째의 계대 배양 접시로부터 얻은 3대째의 세포를 이용하였다.

이식 세포 B: 인간 악골 골수액으로부터 채취한 간엽계 줄기 세포

인간 악골 골수액으로부터 채취한 세포를 10％ FBS, DMEM 배지에서 현탁한 후, 유핵 세포수 1×10⁵cell/10cm 직경 배양 접시에 파종하였다. 37℃에서 5％ 탄산 가스 존재하에서 배양하였다. 3일째에 배지를 교환하고, 비접착 세포(조혈계 세포)를 제거하였다. 이후 3일에 1회 배지를 교환하였다. bFGF는 5일째부터 3ng/㎖로 배지에 첨가하였다. 10일 전후에 거의 집밀적으로까지 증식하였다. 이들 배양 접시를 트립신(0.05％)+EDTA(0.2mM)로 5분간 인큐베이션하여 세포를 단리하였다. 세포수를 쿨터 카운터(Z1 싱글, 쿨터사 제조)로 계측하고, 5000cell/cm²의 밀도로 세포를 파종하였다. 이 조작을 반복하여, 거의 집밀적(콘플루언트)으로 된 2대째의 계대 배양 접시로부터 얻은 3대째의 세포를 이용하였다.

이식 세포 C: 인간 귓바퀴 연골로부터 채취한 연골 세포

인간 귓바퀴 연골을 메스로 미세하게 잘라, 콜라게나아제로 37℃에서 30분간 처리한 세포 현탁액을 10％ FBS, DMEM 배지에서 현탁한 후, 유핵 세포수 1×10⁵cell/10cm 직경 배양 접시에 파종하였다. 37℃에서 5％ 탄산 가스 존재하에서 배양하였다. 3일째에 배지를 교환하고, 비접착 성분(세포+조직편)을 제거하였다. 이후 3일에 1회 배지를 교환하였다. bFGF는 5일째부터 3ng/㎖로 배지에 첨가하였다. 10일 전후에 거의 집밀적으로까지 증식하였다. 이들 배양 접시를 트립신(0.05％)+EDAT(0.2mM)로 5분간 인큐베이션하여 세포를 단리하였다. 세포수를 쿨터 카운터(Z1 싱글, 쿨터사 제조)로 계측하고, 5000cell/cm²의 밀도로 세포를 파종하였다. 이 조작을 반복하여, 거의 집밀적(콘플루언트)으로 된 2대째의 계대 배양 접시로부터 얻은 3대째의 세포를 이용하였다.

<다공질체의 준비>

다공질체 A: 폴리락트산 글리콜산 공중합체(PLGA) 블록

분자량 250000의 DL-락트산/글리콜산 공중합체를 디옥산에 용해시킨 후, 입경 500㎛ 전후의 염화나트륨과 혼합하여 동결 건조하고, 분쇄하여 탈염함으로써 얻어지는 파우더형 재료를 압축 가열 성형함으로써, 평균 공경 540㎛, 기공률 90％, 압축 강도 0.2MPa, 직경 9mm, 두께 3mm의 생체 흡수성 합성 고분자를 포함하는 블록형의 다공질체를 제작하였다.

다공질체 B: 폴리락트산 글리콜산 공중합체(PLGA) 블록

분자량 250000의 DL-락트산/글리콜산 공중합체를 디옥산에 용해시킨 후, 입경 10㎛의 히드록시아파타이트분을 분산시키고, 입경 500㎛ 전후의 염화나트륨과 혼합하여 동결 건조하고, 분쇄하여 탈염함으로써 얻어지는 파우더형 재료를 압축 가열 성형함으로써, 평균 공경 540㎛, 기공률 90％, 압축 강도 0.2MPa, 직경 13mm, 두께 5mm의 생체 흡수성 합성 고분자+인산칼슘 재료를 포함하는 블록형의 다공질체를 제작하였다.

<실시예 1>

다공질체 A의 원반형의 저면을 유리판(크기 100mm×100mm×2mm, 물에 대한 접촉각 28°)의 상면에 접촉시켜 적재하였다. 연골 분화용 배양액(αMEM, 글루코오스 4.5mg/㎖, 10^-7M 덱사메타손, 50㎍/㎖의 아스코르브산-2-인산, 10ng/㎖의 TGF-β, 6.25㎍/㎖의 인슐린, 6.25㎍/㎖의 트랜스페린, 6.25ng/㎖의 셀레늄산, 5.33㎍/㎖의 리놀레산, 1.25mg/㎖의 소 혈청 알부민)에 2×10⁷cell/㎖의 밀도로 현탁시킨 0.19㎖의 이식 세포 A를 다공질체 A에 적하하여 도입하였다. 유리판을 반전시켜 거꾸로 한 상태에서 37℃, 습도 100％, 5％ CO₂조건하에서 30분간 재료에 세포를 접착시킴으로써 다공질체 A에 세포를 파종하여 조직 재생 재료를 얻었다.

그 후, 연골 분화용 배양액으로 채운 50㎖ 원심관에 넣어 37℃에서 3일마다 배지를 교환하면서 4주간 배양하여 연골 조직 재생용 세포 이식체를 제작할 수 있었다.

<실시예 2>

다공질체 B의 원반형의 저면을 플라즈마 처리 폴리스티렌판(크기 50mm×50mm×2mm, 물에 대한 접촉각 71°)의 상면에 접촉시켜 적재하였다. 골 분화용 배양액(αMEM, 글루코오스 4.5mg/㎖, 10％의 FBS, 10^-7M 덱사메타손, 50㎍/㎖의 아스코르브산-2-인산, 10mM의 β 글리세로인산)에 5×10⁷cell/㎖의 밀도로 현탁시킨 0.67㎖의 이식 세포 B를 다공질체 B에 적하하여 도입하였다. 플라즈마 처리 폴리스티렌판을 반전시켜 거꾸로 한 상태에서 37℃, 습도 100％, 5％ CO₂조건하에서 100분간 재료에 세포를 접착시킴으로써 다공질체 B에 세포를 파종하여 조직 재생 재료를 얻었다.

그 후, 골 분화용 배양액으로 채운 50㎖ 원심관에 넣어 37℃에서 3일마다 배지를 교환하면서 2주간 배양하여 골조직 재생용 세포 이식체를 제작할 수 있었다.

<실시예 3>

다공질체 B의 원반형의 저면을 플라즈마 처리 아크릴판(크기 50mm×50mm×2mm, 물에 대한 접촉각 58°)의 상면에 접촉시켜 적재하였다. 연골 분화용 배양액(αMEM, 글루코오스 4.5mg/㎖, 10^-7M 덱사메타손, 50㎍/㎖의 아스코르브산-2-인산, 10ng/㎖의 TGF-β, 6.25㎍/㎖의 인슐린, 6.25㎍/㎖의 트랜스페린, 6.25ng/㎖의 셀레늄산, 5.33㎍/㎖의 리놀레산, 1.25mg/㎖의 소 혈청 알부민)에 2×10⁷cell/㎖의 밀도로 현탁시킨 0.67㎖의 이식 세포 C를 다공질체 B에 적하하여 도입하였다. 플라즈마 처리 아크릴판을 반전시켜 거꾸로 한 상태에서 37℃, 습도 100％, 5％ CO₂조건하에서 30분간 재료에 세포를 접착시킴으로써 다공질체 B에 세포를 파종하여 조직 재생 재료를 얻었다.

<실시예 4>

다공질체 A를 발수 처리된 유리판(크기 50mm×50mm×2mm, 물에 대한 접촉각 114°)의 위에 놓았다. 골분화용 배양액(αMEM, 글루코오스 4.5mg/㎖, 10％의 FBS, 10^-7M 덱사메타손, 50㎍/㎖의 아스코르브산-2-인산, 10mM의 β 글리세로인산)에 5×10⁷cell/㎖의 밀도로 현탁시킨 0.19㎖의 이식 세포 B를 다공질체 A에 적하하여 도입하였다. 다공질체 A가 놓여진 유리판 위에서 플라즈마 처리 폴리스티렌판(크기 50mm×50mm×2mm, 물에 대한 접촉각 71°)을 조용히 내려 다공질체 A를 가볍게 사이에 끼우도록 하여 플라즈마 처리 폴리스티렌판면에 접촉시켰다. 접촉시킨 플라즈마 처리 폴리스티렌판을 천천히 들어올려, 다공질체 A를 플라즈마 처리 폴리스티렌판측에 보유시켜 유리판으로부터 이탈시켰다. 다공질체 A는 중력 방향으로부터 보아 플라즈마 처리 폴리스티렌판이 상측이 되며, 플라즈마 처리 폴리스티렌판의 무게가 다공질체 A에 가해지지 않은 상태에서 기체 중에서 정지시켜, 거꾸로 한 상태에서 37℃, 습도 100％, 5％ CO₂조건하에서 100분간 재료에 세포를 접착시킴으로써 다공질체 A에 세포를 파종하여 조직 재생 재료를 얻었다.

그 후, 골분화용 배양액으로 채운 50㎖ 원심관에 넣어 37℃에서 3일마다 배지를 교환하면서 2주간 배양하여 골조직 재생용 세포 이식체를 제작할 수 있었다.

1: 보유판
2: 임시 적재판
10: 조직 재생 재료
11: 다공질체
12: 세포 현탁액

Claims

조직 재생 재료의 제작 방법으로서,
(a) 보유판의 면에 다공질체의 저면을 접촉시키는 단계,
(b) 중력 방향으로부터 보아 상기 보유판이 상기 다공질체의 상측에 위치하도록 반전시키는 단계, 및
(c) 상기 보유판의 무게가 상기 다공질체에 가해지지 않는 상태에서, 상기 다공질체를 상기 보유판의 하부에 접촉시킨 채로 위치를 고정하여 세포를 파종하는 단계를 포함하고,
상기 보유판은 접촉각이 물에 대하여 15 내지 90°인 수지판 또는 유리판이고,
상기 다공질체는 세포 밀도가 5×10⁶ 내지 1×10⁸cell/㎖인 세포 현탁액으로 채워진, 두께 2 내지 100mm, 공경 180 내지 3500㎛, 평균 공경 350 내지 2000㎛의 연통된 소구멍 구조를 갖고, 기공률이 60 내지 95％, 압축 강도가 0.05 내지 1MPa인 생체 흡수성 고분자 재료를 포함하는, 조직 재생 재료의 제작 방법.
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