CN110556046B - 一种双网络结构三维组织模型及其灌流一体化制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双网络结构三维组织模型及其灌流一体化制备方法，该三维组织模型包括组织基质、沿组织基质水平方向贯通的水平大口径尺度通道阵列网络以及沿组织基质竖直方向贯通的竖直小口径尺度通道阵列网络；水平大口径尺度通道阵列网络和竖直小口径尺度通道阵列网络相互贯穿组合，分别与两套独立的外部灌流培养系统相连，结合对流和渗透两种传质方式分别通过两套网络对组织模型进行过滤式灌流培养；本发明还公开了该三维组织模型简易快速的制造及后续灌流培养整合一体化的方法；该双网络结构三维组织可以为药理、生理探索提供研究模型，包括药物筛选模型、肿瘤组织模型、类器官模型、血管‑基质作用模型等。

Description

一种双网络结构三维组织模型及其灌流一体化制备方法
技术领域
本发明涉及生物制造及组织工程技术领域，具体而言，涉及一种双网络结构三维组织模型及其灌流一体化制备方法。
背景技术
具有各种口径的血管通道动态网络，在维持体内平衡中起着不可或缺的作用。尤其是在肝、脑等细胞密度大、代谢旺盛的器官或组织中，血管网络保障了营养物质的运输和代谢废物的清除，使其得以长时间保持细胞活力和器官功能。除此之外，血管网络还具有作为在组织内局部和系统分布细胞信号分子的管道通路的作用。
利用体外组织工程构建类器官组织模型，经历了从以培养皿培养为代表的二维平面向培养向以水凝胶封装细胞为代表的三维组织发展的过程。三维组织静态或动态灌流培养中，对于不包含丰富血管化通道网络的组织，存在因营养物质或氧气向组织内部传输不充分且细胞代谢产物无法及时排出，从而导致组织心部坏死，无法实现长期培养的问题。目前为止，制造包含多尺度血管化通道网络的三维凝胶组织的方法和效果仍然有限，主要有利用水凝胶的可逆相变反应或预置尼龙或金属丝的脱模法，自顶而上的单元组配法，种植血管碎片或内皮细胞进行自然生长法，以及以材料挤出和立体光刻为主的增材制造法，或以上不同方法的结合。但以目前方法制备的三维组织通道密度有限，且传质通道方向均为单一方向，营养物质传输和代谢产物排泄共用一套网络，传质作用尤其是对代谢废物的排出效果有限，进而对组织细胞保持长期高质量存活生长、分化增殖的有利影响有限。此外，现有制备方法存在技术工艺复杂，制备系统和灌流培养系统分离等问题，在整个流程中三维组织的转移会增加组织破坏、污染的风险。
发明内容
为了实现富含血管化通道网络的三维组织构建，实现更好的体外灌流培养效果，实现更高效的营养传输和代谢排泄，和更优的细胞存活生长和分化增殖，本发明提供一种双网络结构三维组织模型及其灌流一体化制备方法，该双网络结构三维组织可以为药理、生理探索提供研究模型，包括药物筛选模型、肿瘤组织模型、类器官模型、血管-基质作用模型等。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种双网络结构三维组织模型，包括组织基质3、沿组织基质3水平方向贯通的水平大口径尺度通道阵列网络1以及沿组织基质3竖直方向贯通的竖直小口径尺度通道阵列网络2；所述水平大口径尺度通道阵列网络1和竖直小口径尺度通道阵列网络2相互贯穿组合；
所述水平大口径尺度通道阵列网络1和竖直小口径尺度通道阵列网络2分别与两套独立的外部灌流培养系统相连，结合对流和渗透两种传质方式分别通过两套网络对组织模型进行过滤式灌流培养；具体而言，指利用对流作用通过水平大口径尺度通道阵列网络1对三维组织模型进行培养液、营养物质和氧气的快速输送供给，利用渗透和扩散作用通过竖直小口径尺度通道阵列网络2对三维组织模型进行代谢废物沉积过滤，并加速营养物质和氧气在组织内部分布更均匀。
所述对流作用的灌流速度为10μl/min～100μl/min；渗透和扩散作用的灌流速度为0.05μl/min～1μl/min。
所述水平大口径尺度通道阵列网络1的各通道直径为1000μm～3000μm，相邻通道中心距为2000μm～5000μm；所述竖直小口径尺度通道阵列网络2的各通道直径为10μm～100μm，相邻通道中心距为200μm～1500μm；所述三维组织模型内部中空通道阵列体积占比为20％～70％。
所述的双网络结构三维组织模型内，水平大口径尺度通道阵列网络1和竖直小口径尺度通道阵列网络2通道直径、排布方式、密度在组织基质的X轴、Y轴、Z轴方向可控变化。
所述水平大口径尺度通道阵列网络1和竖直小口径尺度通道阵列网络2内壁以及组织基质3内能够选择性的封装不同类型的细胞，以构建探索不同组织细胞相互影响作用的模型。如：在网络内种植血管内皮细胞，在组织基质内封装肝细胞，以构建血管与肝组织交互作用模型；在网络内种植神经胶质细胞，在组织基质内种植神经元，以构建神经胶质细胞与神经元交互作用模型。
所述组织基质3的材料为用于组织工程的细胞相容性好的水凝胶材料。
所述水凝胶材料为胶原蛋白、明胶、琼脂糖、海藻酸盐、壳聚糖、纤维蛋白、透明质酸、聚乙二醇和嵌段共聚物中的一种或多种组合。
所述的双网络结构三维组织模型可以通过现有组织工程生物制造方法制造，本发明提供了一种优选的简易快速的制造及后续灌流培养整合一体化的方法，包括如下步骤：
(1)预制成形-培养室，其水平壁和竖直壁开有孔阵列，并分别与密闭可变容积的水平腔和密闭可变容积的竖直腔弹性连接，密闭可变容积的水平腔的进出口与外部组织成形系统或外部组织灌流培养系统的进出口相连接并能够相互切换，密闭可变容积的竖直腔与外部组织成形系统相连接；
(2)组织成形阶段：密闭可变容积的水平腔和密闭可变容积的竖直腔与外部组织成形系统相连接，在密闭可变容积的水平腔和密闭可变容积的竖直腔中注入可逆水凝胶，称其为“模具水凝胶”，成形-培养室与密闭可变容积的水平腔和密闭可变容积的竖直腔先后作水平方向和竖直方向的相向挤压运动，，即在成形-培养室中得到水平和竖直方向的水凝胶柱状阵列网络“模具内芯”；
(3)在内含“模具内芯”的成形-培养室中注满封装有基质细胞的水凝胶，称其为“基质水凝胶”，待基质水凝胶成胶；
(4)使“模具水凝胶”发生可逆反应相变为液体，并排出，得到包含双网络结构三维组织模型；
(5)组织培养阶段：将密闭可变容积的水平腔的各进出口切换接入至外部组织灌流培养系统，通入含有特定细胞的培养液，静态培养待细胞贴壁生长，使水平大口径尺度通道阵列网络1通道内皮化；接着进行动态灌流培养，利用双网络结构三维组织模型的水平大口径尺度通道阵列网络1运输营养物质和氧气，利用双网络结构三维组织模型竖直小口径尺度通道阵列网络2沉积和过滤代谢废物。
所述灌流培养系统还具有过滤功能，动态循环功能，监测及闭环反馈调节功能，以及可提取代谢产物进行进一步分析的功能等。
和现有技术相比较，本发明的优点和效果在于：
1.相比于已有的单向通道网络，本发明利用对流和渗透两种传质原理的水平和竖直两套阵列网络可以使营养物质和氧气向三维组织内扩散的更均匀更充分，同时有利于细胞代谢废物的沉积和过滤，且更适合长期灌流培养的细胞存活生长和增殖分化；
2.可以简易、快速实现大密度通道网络的制造；
3.双网络结构三维凝胶类生物体组织的制造和后续培养过程可以实现整合一体化，只需要在不同阶段将组织成形-培养室的出入口切换至外部成形或培养系统即可，简化工艺流程的同时避免在组织块的转移过程中可能出现的破坏和污染风险。
附图说明
图1为本发明双网络结构三维组织模型示意图。
具体实施方式
如图1所示，本发明一种双网络结构三维组织模型，包括组织基质3、沿组织基质3水平方向贯通的水平大口径尺度通道阵列网络1以及沿组织基质3竖直方向贯通的竖直小口径尺度通道阵列网络2；所述水平大口径尺度通道阵列网络1和竖直小口径尺度通道阵列网络2相互贯穿组合；所述水平大口径尺度通道阵列网络1和竖直小口径尺度通道阵列网络2分别与两套独立的外部灌流培养系统相连，结合对流和渗透两种传质方式分别通过两套网络对组织模型进行过滤式灌流培养；具体而言，指利用对流作用通过水平大口径尺度通道阵列网络1对三维组织模型进行培养液、营养物质和氧气的快速输送供给，利用渗透和扩散作用通过竖直小口径尺度通道阵列网络2对三维组织模型进行代谢废物沉积过滤，并加速营养物质和氧气在组织内部分布更均匀。
作为本发明的优选实施方式，所述对流作用的灌流速度为10μl/min～100μl/min；渗透和扩散作用的灌流速度为0.05μl/min～1μl/min。
作为本发明的优选实施方式，所述水平大口径尺度通道阵列网络1的各通道直径为1000μm～3000μm，相邻通道中心距为2000μm～5000μm；所述竖直小口径尺度通道阵列网络2的各通道直径为10μm～100μm，相邻通道中心距为200μm～1500μm；所述三维组织模型内部中空通道阵列体积占比为20％～70％。
作为本发明的优选实施方式，所述的双网络结构三维组织模型内，水平大口径尺度通道阵列网络1和竖直小口径尺度通道阵列网络2通道直径、排布方式、密度在组织基质的X轴、Y轴、Z轴方向可控变化。
作为本发明的优选实施方式，所述水平大口径尺度通道阵列网络1和竖直小口径尺度通道阵列网络2内壁以及组织基质3内能够选择性的封装不同类型的细胞，以构建探索不同组织细胞相互影响作用的模型。如：在网络内种植血管内皮细胞，在组织基质内种植肝细胞，以构建血管与肝组织交互作用模型；在网络内种植神经胶质细胞，在组织基质内种植神经元，以构建神经胶质细胞与神经元交互作用模型。
作为本发明的优选实施方式，所述组织基质3的材料为用于组织工程的细胞相容性好的水凝胶材料。更优选的，所述水凝胶材料为胶原蛋白、明胶、海藻酸盐、壳聚糖、纤维蛋白、透明质酸、聚乙二醇和嵌段共聚物中的一种或多种组合。
所述的双网络结构三维组织模型可以通过现有组织工程生物制造方法制造，本发明提供了一种优选的简易快速的制造及后续灌流培养整合一体化的方法，包括如下步骤：
(1)预制成形-培养室，其水平壁和竖直壁开有孔阵列，并分别与密闭可变容积的水平腔和密闭可变容积的竖直腔弹性连接，密闭可变容积的水平腔的进出口与外部组织成形系统或外部组织灌流培养系统的进出口相连接并能够相互切换，密闭可变容积的竖直腔与外部组织成形系统相连接；
(2)组织成形阶段：密闭可变容积的水平腔和密闭可变容积的竖直腔与外部组织成形系统相连接，在密闭可变容积的水平腔和密闭可变容积的竖直腔中注入可逆水凝胶，称其为“模具水凝胶”，成形-培养室与密闭可变容积的水平腔和密闭可变容积的竖直腔先后作水平方向和竖直方向的相向挤压运动，即在成形-培养室中得到水平和竖直方向的水凝胶柱状阵列网络“模具内芯”；
(3)在内含“模具内芯”的成形-培养室中注满封装有基质细胞的水凝胶，称其为“基质水凝胶”，待基质水凝胶成胶；
(4)使“模具水凝胶”发生可逆反应相变为液体，并排出，得到包含双网络结构三维组织模型；
(5)组织培养阶段：将密闭可变容积的水平腔的各进出口切换接入至外部组织灌流培养系统，通入含有特定细胞的培养液，静态培养待细胞贴壁生长，使水平大口径尺度通道阵列网络1通道内皮化；接着进行动态灌流培养，利用双网络结构三维组织模型的水平大口径尺度通道阵列网络1运输营养物质和氧气，利用双网络结构三维组织模型竖直小口径尺度通道阵列网络2沉积和过滤代谢废物。
实施例：双网络胶原基质水凝胶胶质瘤药物筛选模型
(1)制造水凝胶柱阵列“模具内芯”：预先制备成形-培养室，成形-培养室的水平壁开有直径为1mm，相邻孔间距为1mm的孔径阵列，竖直壁开有直径为50μm，相邻孔间间距为200μm的孔径阵列。成形-培养室内在密闭状态下注满浓度为200mmol/L氯化钙溶液，该室依次向注满质量浓度为2％的海藻酸钠溶液的密闭可变容积水平腔和密闭可变容积竖直腔作挤压运动，速率为500μm/min,成形-培养室内成胶为海藻酸钙柱状阵列“模具内芯”；
(2)成形封装胶质瘤细胞的基质水凝胶：制备质量浓度为6mg/mL的鼠尾I型胶原蛋白溶液，冰浴下调节pH至7.0，将胶质瘤细胞与鼠尾I型胶原蛋白溶液混合，得到细胞浓度为1x106/ml的胶原水凝胶前体溶液，将该胶原水凝胶前体溶液注入成形-培养室内，37℃下静置45分钟，待其成胶。
(3)溶解“模具内芯”：通过密闭可变容积水平腔和密闭可变容积竖直腔向成形-培养室内“模具内芯”的“水平内芯”和“竖直内芯”注入浓度为60mmol/L的柠檬酸钠溶液，灌流2小时，溶解“模具内芯”并排出，得到包含双网络结构三维组织模型。
(4)接入组织灌流培养体系：将与成形-培养室相连接的密闭可变容积水平腔和密闭可变容积竖直腔的各出入口转换接入外部组织灌流培养系统。
(5)双网络通道内皮化：通过密闭可变容积水平腔和密闭可变容积竖直腔向成形-培养室内的双网络通道内注入5x106/ml的血管内皮细胞，静态培养2天至细胞贴壁，形成血管化通道阵列网络。
(6)双网络动态循环培养：水平大口径尺度通道阵列网络1水平网络培养液传输速率为70μl/min，竖直小口径尺度通道阵列网络2竖直网络培养液传输速率为0.5μl/min。
(7)定期滴入待选药物，提取代谢废物进行分析，进一步对三维组织模型进行切片和免疫组化染色分析其药物作用效果。

Claims (8)

1.一种双网络结构三维组织模型，其特征在于：包括组织基质(3)、沿组织基质(3)水平方向贯通的水平大口径尺度通道阵列网络(1)以及沿组织基质(3)竖直方向贯通的竖直小口径尺度通道阵列网络(2)；所述水平大口径尺度通道阵列网络(1)和竖直小口径尺度通道阵列网络(2)相互贯穿组合；
所述水平大口径尺度通道阵列网络(1)和竖直小口径尺度通道阵列网络(2)分别与两套独立的外部灌流培养系统相连，结合对流和渗透两种传质方式分别通过两套网络对组织模型进行过滤式灌流培养；利用对流作用通过水平大口径尺度通道阵列网络(1)对三维组织模型进行培养液、营养物质和氧气的快速输送供给，利用渗透和扩散作用通过竖直小口径尺度通道阵列网络(2)对三维组织模型进行代谢废物沉积过滤，并加速营养物质和氧气在组织内部分布更均匀。
2.根据权利要求1所述的一种双网络结构三维组织模型，其特征在于：所述对流作用的灌流速度为10μl/min～100μl/min；渗透和扩散作用的灌流速度为0.05μl/min～1μl/min。
3.根据权利要求1所述的一种双网络结构三维组织模型，其特征在于：所述水平大口径尺度通道阵列网络(1)的各通道直径为1000μm～3000μm，相邻通道中心距为2000μm～5000μm；所述竖直小口径尺度通道阵列网络(2)的各通道直径为10μm～100μm，相邻通道中心距为200μm～1500μm；所述三维组织模型内部中空通道阵列体积占比为20％～70％。
4.根据权利要求1所述的一种双网络结构三维组织模型，其特征在于：所述的双网络结构三维组织模型内，水平大口径尺度通道阵列网络(1)和竖直小口径尺度通道阵列网络(2)通道直径和间距、排布方式以及密度在组织基质的X轴、Y轴、Z轴方向可控变化。
5.根据权利要求1所述的一种双网络结构三维组织模型，其特征在于：所述水平大口径尺度通道阵列网络(1)和竖直小口径尺度通道阵列网络(2)内壁以及组织基质(3)内能够选择性的封装不同类型的细胞，以构建探索不同组织细胞相互影响作用的模型。
6.根据权利要求1所述的一种双网络结构三维组织模型，其特征在于：所述组织基质(3)的材料为用于组织工程的细胞相容性好的水凝胶材料。
7.根据权利要求6所述的一种双网络结构三维组织模型，其特征在于：所述水凝胶材料为胶原蛋白、明胶、琼脂糖、海藻酸盐、壳聚糖、纤维蛋白、透明质酸、聚乙二醇和嵌段共聚物中的一种或多种组合。
8.权利要求1至7任一项所述的双网络结构三维组织模型灌流一体化制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)预制成形-培养室，其水平壁和竖直壁开有孔阵列，并分别与密闭可变容积的水平腔和密闭可变容积的竖直腔弹性连接，密闭可变容积的水平腔的进出口与外部组织成形系统或外部组织灌流培养系统的进出口相连接并能够相互切换，密闭可变容积的竖直腔与外部组织成形系统相连接；
(2)组织成形阶段：密闭可变容积的水平腔和密闭可变容积的竖直腔与外部组织成形系统相连接，在密闭可变容积的水平腔和密闭可变容积的竖直腔中注入可逆水凝胶，称其为“模具水凝胶”，成形-培养室与密闭可变容积的水平腔和密闭可变容积的竖直腔先后作水平方向和竖直方向的相向挤压运动，即在成形-培养室中得到水平和竖直方向的水凝胶柱状阵列网络“模具内芯”；
(3)在内含“模具内芯”的成形-培养室中注满封装有基质细胞的水凝胶，称其为“基质水凝胶”，待基质水凝胶成胶；
(4)使“模具水凝胶”发生可逆反应相变为液体，并排出，得到包含双网络结构三维组织模型；
(5)组织培养阶段：将密闭可变容积的水平腔各进出口切换接入至外部组织灌流培养系统，通入含有特定细胞的培养液，静态培养待细胞贴壁生长，使水平大口径尺度通道阵列网络(1)通道内皮化；接着进行动态灌流培养，利用双网络结构三维组织模型的水平大口径尺度通道阵列网络(1)运输营养物质和氧气，利用双网络结构三维组织模型竖直小口径尺度通道阵列网络(2)沉积和过滤代谢废物。
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