CN108047482B - 一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108047482B CN108047482B CN201711320768.7A CN201711320768A CN108047482B CN 108047482 B CN108047482 B CN 108047482B CN 201711320768 A CN201711320768 A CN 201711320768A CN 108047482 B CN108047482 B CN 108047482B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phase
- microcarrier
- chitosan
- content
- porous chitosan
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 title claims abstract description 132
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 74
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 70
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 37
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 36
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 34
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 27
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 24
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 claims description 21
- NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N Sorbitan monooleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N 0.000 claims description 21
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 claims description 16
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 claims description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 16
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims description 15
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 14
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 13
- 238000002145 thermally induced phase separation Methods 0.000 claims description 13
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 12
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 11
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 11
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 10
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 10
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 9
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 claims description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 7
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 7
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 5
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000004088 foaming agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 4
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 claims description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 7
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 7
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000002500 microbody Anatomy 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 2
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012339 Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000011549 displacement method Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J9/00—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof
- C08J9/24—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof by surface fusion and bonding of particles to form voids, e.g. sintering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
- C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
- C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2305/00—Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
- C08J2305/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2531/00—Microcarriers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明公开了一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用。该多孔壳聚糖微载体以壳聚糖为主要成分，多孔壳聚糖微载体的直径为100～300μm，其表面和内部具有相互联通的孔隙，所述孔隙的尺径为10～70μm，且孔隙率为95％以上。本发明的多孔壳聚糖微载体尺寸均一，且表面和内部具有相互联通的孔隙，孔隙率最高可达95％以上；利用本发明的多孔壳聚糖微载体培养细胞，细胞不仅可以粘附于载体表面，还能进入内部孔隙生长，并在三维空间形成有效的细胞‑细胞连接，实现真正的三维培养，有效地模拟体内环境，更好地保持细胞的活力与功能，具有良好的生物相容性。
Description
技术领域
本发明属于天然高分子多孔材料领域，具体涉及一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用。
背景技术
微载体技术是实现大规模细胞培养的有效手段，目前国外已有部分实心或多孔微载体实现商品化，如Cytodex、Cultispher等，同时还有多种微载体处于实验室研究阶段。与传统的平板培养相比，这些微载体能为贴壁性细胞提供充足的粘附位点，实现细胞大规模悬浮培养，但现有的微载体均忽视了让细胞进入其内部孔隙生长并在三维空间形成有效的细胞-细胞连接，从而未能实现真正的细胞三维培养。
壳聚糖是由自然界广泛存在的甲壳素经过脱乙酰基后的产物，具有良好的生物相容性、血液相容性与微生物可降解性等优良性能，在生物医学领域有广阔的应用前景。近年来，基于壳聚糖的细胞微载体已有报道，包括实心微载体(中国发明专利CN201210000553.8)与多孔微载体(中国发明专利 CN200910041768.2，CN200910041767.8)，但没有证据表明这些微载体能让细胞进入内部孔隙生长并在三维空间形成有效的细胞-细胞连接，同时其制备技术往往采用戊二醛、环氧氯丙烷等交联剂或聚乙二醇等致孔剂，增加了微载体的生物毒性及制备成本。
现有技术中多孔微载体(含壳聚糖微载体)的孔隙率都不超过95％(CN201110305547.9,CN201210000554.2,CN200910041767.8)；目前文献报道的多孔微载体的比表面积也仅为1～10m2/g，例如商品化多孔微载体 Cytopore的比表面积为1.0～3.0m2/g(Healthcare,G.E.；Biosciences,A. Microcarrier cell culture:principles andmethods.General Electric Company 2005.)；由此微体内部没有相互联通的空隙，不能让细胞进入内部孔隙生长，并在三维空间形成有效的细胞-细胞连接。尽管，“内部相互联通”的多孔微球现有技术中已有报道，但其孔隙太大或太小在细胞微载体方面都是没有应用意义的。
发明内容
本发明为克服现有技术当中的多孔壳聚糖微载体孔隙率低、表面和内部没有相互联通的空隙而不利于细胞粘附和增长、不能支持大量细胞生长且不能形成细胞-细胞连接，因而不能实现真正的三维培养等缺陷，提供一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用。本发明的多孔壳聚糖微载体尺寸均一，且表面和内部具有相互联通的孔隙，孔隙率高达95％以上；利用本发明的多孔壳聚糖微载体培养细胞，细胞不仅可以粘附于载体表面，还能进入内部空隙生长，并在三维空间形成有效的细胞-细胞连接，实现真正的三维培养；且所述多孔壳聚糖微载体不包含致孔剂和交联剂，因此降低了培养细胞过程中的生物毒性，具有良好的生物相容性。
本发明提供一种多孔壳聚糖微载体，其以壳聚糖为主要成分，所述多孔壳聚糖微载体的直径为100～300μm，其表面和内部具有相互联通的孔隙，所述孔隙的尺径为10～70μm，且孔隙率为95％以上。所述的“主要成分”的含义为本领域常规，于本发明中指的是多孔壳聚糖为载体可以完全由壳聚糖构成，或者可以含有部分杂质，例如在制备过程中难以完全去除的原料。
所述多孔壳聚糖微载体的直径优选165～220μm，更优选180～200μm。
所述孔隙的尺径(又称“孔径”)优选20～60μm，更优选25～50μm，进一步更优选30～40μm；当所述孔隙为不规则形状时，其尺径指的是其平均直径。
较佳地，所述多孔壳聚糖微载体的孔隙率为97～99％，更精确地为 97.2％～98.5％；优选98％。
上述多孔壳聚糖微载体的比表面积可为本领域常规，较佳地其比表面积大于10m2/g；优选28～32m2/g，更精确地为28.8～31.5m2/g；进一步更优选 30.1m2/g或者30.8m2/g。
其中，所述多孔壳聚糖微载体的直径、孔隙率以及比表面积的数值为均值，如本领域技术人员公知，其均有一定的标准差，例如所述微载体直径的标准偏差可为50μm，所述孔隙率的标准偏差为1％左右，所述比表面积的标准偏差为2m2/g左右。
上多孔壳聚糖微载体的弹性模量可为本领域常规，优选130～160kPa，更优选135～155kPa，进一步更优选140～150kPa，最优选145kPa。
上述任一种多孔壳聚糖微载体的制备方法，其包括如下步骤：
(1)将分散相与连续相混合均匀，乳化后得W/O乳液；所述分散相为壳聚糖的醋酸水溶液，所述连续相为含乳化剂的有机溶剂溶液；
(2)将所述W/O乳液在-50℃～-5℃淬火2～6小时进行热致相分离；
(3)将相转变液倒入淬火后的乳液中进行反相再生，即得多孔壳聚糖微载体；所述相转变液为含碱的乙醇和水混合液。
其中，步骤(1)的操作可根据本领域常规，所述壳聚糖的脱乙酰化程度可为本领域常规，其脱乙酰化程度越高，越利于微体的形成以及所形成的微体的性质；本发明中，所述壳聚糖的脱乙酰化程度取决于目前市售壳聚糖产品的脱乙酰化程度，较佳地大于80％，更佳地为95％；所述壳聚糖的粘均分子量可为本领域常规，较佳地为10～15万，更佳地为10万。
较佳地，所述壳聚糖的含量为1％～3％，优选1％；所述醋酸水溶液的醋酸含量为1％～3％，优选1％；所述乳化剂的含量为3％～7％，优选5％；所述乳化剂优选Span 80与Tween 60的混合物；所述Span 80与所述Tween 60 的质量比为24:(1～5)；优选20:1；所述有机溶剂为石油醚和/或矿物油；和/或，所述分散相与所述连续相的体积比为1:(3～10)，优选1:5；所述百分比为质量体积百分比g/mL。
步骤(1)中所述乳化的温度较佳地为30～50℃，更佳地为40℃。
步骤(1)中所述乳化的时间可为本领域常规，优选2～6小时，更优选4 小时；更佳地，为了获得分散均匀的乳液，所述乳化在搅拌下进行，所述搅拌的速度优选800～1500转/分钟，更优选1000转/分钟。
步骤(1)中所述有机溶剂可为本领域常规，较佳地为石油醚和/或矿物油。
步骤(1)中所述乳化剂可为本领域常规，较佳地为Span 80与Tween 60 的混合物，所述Span 80与所述Tween 60的质量比优选24:(1～5)，更优选 20:1。
步骤(2)中所述淬火的时间优选4小时；
步骤(2)中所述淬火的温度若不在-50℃～-5℃的范围内不利于孔隙的形成或形成的孔隙尺寸不合适，所述淬火的温度优选-40℃～-10℃，更优选-20℃。
步骤(3)的操作可为本领域常规，较佳地，所述相转变液与所述淬火后的乳液的体积比为(1～2):1，优选1.67:1；所述相转变液为碱含量为1％～3％的乙醇和水混合液，所述碱含量优选1％，所述百分比为质量体积百分比g/mL；
步骤(3)中所述乙醇与所述水的体积比为20:(1～5)，优选14:1。
所述碱在制备方法中的作用是的中和分散相中的醋酸，可以使用任何无机碱或有机碱，然而为了便于碱在制备相转变液时的溶解、以及后期多孔壳聚糖微载体的洗涤，较佳地使用无机碱；所述无机碱优选常见金属的碱，例如钾碱、钠碱等，较佳地为氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠中的一种或多种。
上述制备方法利用的是微乳化技术结合热致相分离原理，因此所述制备方法可以不使用交联剂和/或致孔剂。
上述制备方法较佳地还包括步骤(4)：对步骤(3)所得多孔壳聚糖微载体进行洗涤和干燥，所述洗涤进行至洗脱液pH为6.5～7.8。
本发明还提供一种上述多孔壳聚糖微载体在细胞三维培养中的应用；所述细胞优选贴壁性细胞；更优选L-02肝细胞、血管内皮细胞或Hela细胞。
所述的细胞三维培养包括如下步骤：
(1)将所述多孔壳聚糖微载体以3～5mg/ml浸泡于无血清培养液中；所述无血清培养液优选RPMI-1640；所述浸泡的时间优选6小时以上；
(2)将浸泡过的所述多孔壳聚糖微载体转入细胞培养板中，加入等体积细胞，所述细胞的密度优选5×104个细胞/孔；
(3)将所述细胞培养板置于二氧化碳培养箱中。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的多孔壳聚糖微载体尺寸均一，且表面和内部具有相互联通的孔隙，孔隙率最高可达95％以上；利用本发明的多孔壳聚糖微载体培养细胞，细胞不仅可以粘附于载体表面，还能进入内部孔隙生长，并在三维空间形成有效的细胞-细胞连接，实现真正的三维培养，有效地模拟体内环境，更好地保持细胞的活力与功能，同时充分利用内部孔隙还有望提高细胞产量；且所述多孔壳聚糖微载体可不包含致孔剂和交联剂，因此降低了培养细胞过程中的生物毒性，具有良好的生物相容性。
附图说明
图1为多孔壳聚糖微载体的形态及物理性质示意图，其中：A .扫描电镜图；B .局部放大的扫描电镜图；C .切面光镜图；D .孔径分布；E .弹性模量。
图2为L-02细胞在多孔壳聚糖微载体表面及内部粘附的扫描电镜图。
图3为多孔壳聚糖微载体的细胞毒性与血液相容性评价，其中，A .间接接触的细胞毒性分析；B .直接接触的细胞毒性分析；C .溶血率分析。
图4为L-02细胞在多孔壳聚糖微载体表面及内部存活与增殖的激光共聚焦显微镜图。注：绿色荧光为活细胞，红色荧光为死细胞；明场，也称为明视场，一般作为普通观察用。
图5为经多孔壳聚糖微载体培养的L-02细胞的肝功能检测：A .白蛋白分泌；B .尿素合成。
注：图中CSM为本发明多孔壳聚糖微载体。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1多孔壳聚糖微载体的制备
1、配制1％(w/v)壳聚糖脱乙酰化程度95％，粘均分子量10万(供应厂商为
)的醋酸水溶液作为分散相，其中醋酸含量1％(w/v)；配制5％(w/v)乳化剂的石油醚溶液作为连续相，其中乳化剂由Span 80与 Tween 60按20:1(w/w)混合组成；配制1％(w/v)氢氧化钠的乙醇/水溶液作为相转变液，其中乙醇与水的比例为14:1(v/v)。
2、将10mL上述分散相溶液缓慢加入到50mL连续相溶液中，在40℃、 1000r/min搅拌下乳化4小时，得到W/O乳液。
3、将所得W/O乳液在-20℃下淬火4小时进行热致相分离。
4、将100mL上述相转变液倒入上述已淬火的乳液，在温和搅拌下进行反相再生，离心，收集沉淀，分别用水和乙醇清洗沉淀，直至洗脱液pH为 7.0，将沉淀在室温下真空干燥，即得到多孔壳聚糖微载体。
根据图1的扫描电镜(SEM)结果所示，本实施例制备所得多孔壳聚糖微载体为多孔微球形态(图1A )，根据图1B 可以看到其具有内部相互联通的孔隙，根据图1C 可以进一步确认其内部孔隙是相互联通的。该实施例制备的多孔壳聚糖微载体采用扫描电镜测得多孔微球的平均直径为180μm，采用液体置换法测得孔隙率为98.5％，用压汞仪法测得孔隙的孔径为10～60 μm(图1D )，采用氮气吸附-脱吸附等温分析法测得比表面积达30.1m2/g，采用原子力显微镜的扫描力显微镜模式测得弹性模量约为150kPa(图1E )。
实施例2多孔壳聚糖微载体的制备
1、配制1％(w/v)壳聚糖(脱乙酰化程度95％，粘均分子量10万) 的醋酸水溶液作为分散相，其中醋酸含量1％(w/v)；配制7％(w/v)乳化剂的石油醚溶液作为连续相，其中乳化剂由Span 80与Tween 60按24:1(w/w) 混合组成；配制1.5％(w/v)氢氧化钠的乙醇/水溶液作为相转变液，其中乙醇与水的比例为20:1(v/v)。
2、将10mL上述分散相溶液缓慢加入到30mL连续相溶液中，在30℃、 1000r/min搅拌下乳化4小时，得到W/O乳液。
3、将所得W/O乳液在-50℃下淬火2小时进行热致相分离。
4、将80mL上述相转变液倒入上述已淬火的乳液，在温和搅拌下进行反相再生，离心，收集沉淀，分别用水和乙醇清洗沉淀，直至洗脱液pH为 6.5，将沉淀在室温下真空干燥，即得到多孔壳聚糖微载体。
本实施例制备的多孔壳聚糖微载体为平均直径200μm的多孔微球，孔隙率为99.0％，其表面和内部具有相互联通、尺径10～40μm的孔隙，比表面积达31.5m2/g，弹性模量约为135kPa。
实施例3多孔壳聚糖微载体的制备
1、配制3％(w/v)壳聚糖(脱乙酰化程度大于80％，粘均分子量15 万，供应厂商为
)的醋酸水溶液作为分散相，其中醋酸含量3％(w/v)；配制7％(w/v)乳化剂的石油醚溶液作为连续相，其中乳化剂由Span 80与 Tween 60按24:5(w/w)混合组成；配制3％(w/v)氢氧化钠的乙醇/水溶液作为相转变液，其中乙醇与水的比例为20:5(v/v)。
2、将10mL上述分散相溶液缓慢加入到100mL连续相溶液中，在50℃、 1500r/min搅拌下乳化2小时，得到W/O乳液。
3、将所得W/O乳液在-5℃下淬火6小时进行热致相分离。
4、将110mL上述相转变液倒入上述已淬火的乳液，在温和搅拌下进行反相再生，离心，收集沉淀，分别用水和乙醇清洗沉淀，直至洗脱液pH为 7.8，将沉淀在室温下真空干燥，即得到多孔壳聚糖微载体。
本实施例制备的多孔壳聚糖微载体为平均直径220μm的多孔微球，孔隙率为97.2％，其表面和内部具有相互联通、尺径30-70μm的孔隙，比表面积达28.8m2/g，弹性模量约为155kPa。
实施例4多孔壳聚糖微载体的制备
1、配制2％(w/v)壳聚糖(脱乙酰化程度95％，粘均分子量10万，供应厂商为
)的醋酸水溶液作为分散相，其中醋酸含量2％(w/v)；配制3％(w/v)乳化剂的石油醚溶液作为连续相，其中乳化剂由Span 80与 Tween 60按20:1(w/w)混合组成；配制2％(w/v)氢氧化钠的乙醇/水溶液作为相转变液，其中乙醇与水的比例为14:1(v/v)。
2、将10mL上述分散相溶液缓慢加入到50mL连续相溶液中，在40℃、 800r/min搅拌下乳化6小时，得到W/O乳液。
3、将所得W/O乳液在-40℃下淬火4小时进行热致相分离。
4、将100mL上述相转变液倒入上述已淬火的乳液，在温和搅拌下进行反相再生，离心，收集沉淀，分别用水和乙醇清洗沉淀，直至洗脱液pH为 6.5，将沉淀在室温下真空干燥，即得到多孔壳聚糖微载体。
本实施例制备的多孔壳聚糖微载体为平均直径200μm的多孔微球，孔隙率为98.0％，其表面和内部具有相互联通、尺径10～50μm的孔隙，比表面积达30.8m2/g，弹性模量约为145kPa。
实施例5多孔壳聚糖微载体的制备
1、配制1％(w/v)壳聚糖(脱乙酰化程度95％，粘均分子量10万，供应厂商为
)的醋酸水溶液作为分散相，其中醋酸含量1％(w/v)；配制5％(w/v)乳化剂的石油醚溶液作为连续相，其中乳化剂由Span 80与 Tween 60按20:1(w/w)混合组成；配制1％(w/v)氢氧化钠的乙醇/水溶液作为相转变液，其中乙醇与水的比例为14:1(v/v)。
2、将10mL上述分散相溶液缓慢加入到50mL连续相溶液中，在40℃、 1000r/min搅拌下乳化4小时，得到W/O乳液。
3、将所得W/O乳液在-10℃下淬火6小时进行热致相分离。
4、将100mL上述相转变液倒入上述已淬火的乳液，在温和搅拌下进行反相再生，离心，收集沉淀，分别用水和乙醇清洗沉淀，直至洗脱液pH为 7.8，将沉淀在室温下真空干燥，即得到多孔壳聚糖微载体。
本实施例制备的多孔壳聚糖微载体直径165μm的多孔微球，孔隙率为 98.0％，其表面和内部具有相互联通、尺径25～70μm的孔隙，比表面积达 29.1m2/g，弹性模量约为140kPa。
上述制备所得壳聚糖微载体的直径、孔隙率、尺径以及比表面积均在本发明的设定范围内，现选用实施例1A制备得到的壳聚糖微载体进行下述应用实施例以及实施例的实验。
应用实施例1多孔壳聚糖微载体用于肝细胞的三维培养
将实施例1所得多孔壳聚糖微载体以2mg/mL在RPMI-1640培养液中浸泡过夜，转入24-孔板中，再将等体积的L-02细胞(购自武汉仝干医疗科技股份有限公司)悬浮液接种入培养板中，L-02细胞的接种密度为5×104细胞/孔，置于二氧化碳培养箱中(37℃、5％CO2)分别培养12、24、48和 72小时，用PBS溶液清洗3遍除去未粘附的细胞。采用扫描电镜(SEM) 观察细胞在微载体表面及内部的粘附情况，采用激光共聚焦荧光显微镜 (LSCM)观察细胞在微载体表面及内部的存活与增殖情况，并采用蛋白质印迹法(Western blot)和实时荧光定量多聚酶链式反应法(PCR)分别从蛋白质、基因水平评价细胞肝功能的表达情况。
本实施例获得的细胞培养结果如图2所示，实施例1所得多孔壳聚糖微载体不仅能促进L-02细胞粘附于表面，也能使细胞进入内部相互联通的孔隙生长，合成大量细胞外基质，并形成细胞-细胞连接。随着培养时间增加，微载体上的细胞数量逐渐增加，表明L-02细胞能在该微载体上很好地存活、增殖，如图4所示通过死细胞/活细胞双染试剂染色后，钙黄绿素-AM可对活细胞进行绿色荧光标记，碘化丙啶对死细胞进行红色荧光标记，在共聚焦荧光显微镜下观察到微载体上的细胞基本上都是被绿色荧光标记的活细胞；此外，通过白蛋白分泌、尿素合成等评价证明经该微载体培养的L-02细胞具有正常的肝功能，如图5所示，通过酶联免疫吸附实验(Elisa)试剂盒检测L-02细胞的白蛋白分泌和尿素合成，发现在微载体上培养的L-02细胞的白蛋白分泌和尿素合成量显著高于对照组，表明该微载体有利于L-02细胞肝功能的表达。
应用实施例2多孔壳聚糖微载体用于肝细胞的三维培养
将实施例2～5所得多孔壳聚糖微载体以2mg/mL在RPMI-1640培养液中浸泡过夜，转入500mL转瓶中，再将等体积的L-02细胞悬浮液接种入培养板中，置于振荡二氧化碳培养箱中(37℃、5％CO2)在转速100r/min条件下培养12、24、48和72小时，用PBS溶液清洗3遍除去未粘附的细胞。采用应用实施例1所述方法对细胞培养情况、细胞功能进行评价。本实施例获得的细胞培养结果与应用实施例1基本一致，L-02细胞不仅能粘附于微载体表面，也能进入微载体内部孔隙生长，形成细胞-细胞连接，细胞数量随着培养时间增加而逐渐增加，此外，通过相关蛋白、基因表达分析证明细胞具有正常的肝功能。
应用实施例3多孔壳聚糖微载体用于其他细胞的三维培养
以应用实施例1为基础，不同点为：将L-02细胞分别换成血管内皮细胞和Hela细胞，细胞培养液、接种密度也做相应的调整，其他与应用实施例1相同。本实施例获得的血管内皮细胞和Hela细胞均具有良好的形态，细胞在微载体表面和内部孔隙均有分布，且能观察到大量细胞外基质以及细胞-细胞连接，细胞数量随着培养时间增加而逐渐增加，通过相关蛋白和基因表达分析表明细胞均具有正常的功能。
应用实施例4多孔壳聚糖微载体的细胞毒性与血液相容性评价
根据ISO 10993-5，将实施例1所得多孔壳聚糖微载体于37℃分别以0.5， 1，2mg/mL在RPMI-1640培养液中浸泡72小时，10000转/分钟离心5分钟除去固体成分，将收集的上清液经0.22μm滤膜过滤，所得清液作为多孔壳聚糖微载体浸提液备用。将L-02细胞以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板，置于二氧化碳培养箱中(37℃、5％CO2)培养过夜，随后去掉培养液，并加入等体积的多孔壳聚糖微载体浸提液，分别培养12、24、48与72小时后，往每个孔中加入10μL CCK-8溶液(CCK-8全称为Cell Counting Kit-8，即：细胞计数试剂盒-8，购自日本同仁Dojindo)，振荡均匀，置于二氧化碳培养箱中(37℃、5％CO2)培养30分钟，采用酶标仪在450nm波长处测量吸光值。通过以下公式(1)计算出细胞存活率。
其中ODS、ODB与ODN分别表示样品组、空白对照组、阴性对照组的吸光值。对于直接接触的细胞毒性分析，将实施例1所得多孔壳聚糖微载体分别以0.5，1，2mg/mL直接加入到接种有相同数量L-02细胞的培养液中，置于二氧化碳培养箱中(37℃、5％CO2)分别培养12、24、48与72小时后，采用上述同样方法检测细胞毒性。
对实施例1所得多孔壳聚糖微载体进行溶血试验，步骤如下：取健康兔子的新鲜血液，迅速加入少量肝素防止凝固，并用生理盐水稀释1.25倍备用。用生理盐水分别配制0.5mg/mL,1mg/mL与2mg/mL多孔壳聚糖微载体分散液，并浸泡过夜。将50μL稀释的血液分别加入到1.5mL上述多孔壳聚糖微载体分散液中，于37℃静置30分钟。以蒸馏水和生理盐水分别作为阳性对照和阴性对照。将上述试验样品于1000转/分钟离心5分钟，收集上清液，采用酶标仪在545nm处检测吸光值，并通过以下公式(2)计算溶血率。
溶血率＝[(ODS-ODN)/(ODP-ODN)]×100％(2)
其中ODS、ODP与ODN分别表示样品组、阳性对照组、阴性对照组的吸光值。
细胞毒性分析结果如图3A(间接接触)与3B(直接接触)所示，所有测试组的细胞存活率都在100％以上，由此可知，不管是间接接触还是直接接触，在所测试的浓度范围内，实施例1所得多孔壳聚糖微载体均没有表现出细胞毒性，反而在一定程度上促进了细胞的增殖，具有良好的细胞相容性。血液相容性测试结果如图3C所示，0.5mg/mL,1mg/mL与2mg/mL多孔壳聚糖微载体的生理盐水分散液所对应的溶血率值分别为0.14％，0.70％与 1.07％。根据标准ASTM-F/756-08(2000)，溶血率值低于2％时可认为非溶血，因此，在所测试的浓度范围内，实施例1所得多孔壳聚糖微载体均不导致溶血，具有良好的血液相容性。
Claims (7)
1.一种多孔壳聚糖微载体在细胞三维培养中的应用，其特征在于，所述细胞为L-02肝细胞、血管内皮细胞或Hela细胞；
所述多孔壳聚糖微载体以壳聚糖为主要成分，所述多孔壳聚糖微载体的直径为165～220μm，其表面和内部具有相互联通的孔隙，所述孔隙的尺径为10～70μm，且孔隙率为97～99％；所述多孔壳聚糖微载体的比表面积为28～32m2/g，所述多孔壳聚糖微载体的弹性模量为135～155kPa；
所述多孔壳聚糖微载体通过如下步骤制得：
(1)将分散相与连续相混合均匀，乳化后得W/O乳液；所述分散相为壳聚糖的醋酸水溶液，所述连续相为含乳化剂的有机溶剂溶液；
(2)将所述W/O乳液在-50℃～-5℃淬火2～6小时进行热致相分离；
(3)将相转变液倒入淬火后的乳液中进行反相再生，即得多孔壳聚糖微载体；所述相转变液为含碱的乙醇和水混合液；
(4)对步骤(3)所得多孔壳聚糖微载体进行洗涤和干燥；所述洗涤用水和乙醇进行，至洗脱液pH为6.5～7.8；所述干燥为在室温下真空干燥，即得；其中，
步骤(1)中，所述壳聚糖的脱乙酰化程度大于80％，粘均分子量为10～15万；所述壳聚糖的含量为1％～3％；所述醋酸水溶液的醋酸含量为1％～3％；所述乳化剂的含量为3％～7％；所述乳化剂为Span 80与Tween 60的混合物；所述Span 80与所述Tween 60的质量比为24:(1～5)；所述有机溶剂为石油醚；所述分散相与所述连续相的体积比为1:(3～10)；所述乳化的温度为30～50℃；所述乳化的时间为2～6小时；所述乳化在搅拌下进行，所述搅拌的速度为800～1500转/分钟；
步骤(3)中，所述相转变液与所述淬火后的乳液的体积比为(1～2):1；所述相转变液为碱含量为1％～3％的乙醇和水混合液；所述碱选自氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠中的一种或多种；所述乙醇与所述水的体积比为20:(1～5)；
所述制备方法不使用交联剂和/或致孔剂；
所述％为质量体积百分比g/mL。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多孔壳聚糖微载体的直径为180μm；所述孔隙的尺径为10～60μm；所述孔隙率为98.5％；所述比表面积为30.1m2/g；所述弹性模量为150kPa；
步骤(1)中所述壳聚糖的含量为1％；所述醋酸水溶液的醋酸含量为1％；所述乳化剂的含量为5％；所述乳化剂为Span 80与Tween 60的混合物，所述Span 80与所述Tween 60的质量比为20:1；所述有机溶剂溶液为石油醚；所述分散相与所述连续相的体积比为1:5；所述壳聚糖的脱乙酰化程度95％，粘均分子量为10万；所述乳化的温度为40℃，乳化的时间为4小时；所述乳化在搅拌下进行，所述搅拌的速度为1000转/分钟；
步骤(2)中所述W/O乳液在-20℃下淬火4小时进行热致相分离；
步骤(3)中所述相转变液与所述淬火后的乳液的体积比为5:3；所述相转变液为氢氧化钠含量为1％的乙醇和水混合液；所述乙醇和水的体积比为14:1；
步骤(4)中洗涤至洗脱液pH为7.0。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多孔壳聚糖微载体的直径为200μm；所述孔隙的尺径为10～40μm；所述孔隙率为99％；所述比表面积为31.5m2/g；所述弹性模量为135kPa；
步骤(1)中所述壳聚糖的含量为1％；所述醋酸水溶液的醋酸含量为1％；所述乳化剂的含量为7％；所述乳化剂为Span 80与Tween 60的混合物，所述Span 80与所述Tween 60的质量比为24:1；所述有机溶剂溶液为石油醚；所述分散相与所述连续相的体积比为1:3；所述％为质量体积百分比g/100mL；所述壳聚糖的脱乙酰化程度95％，粘均分子量为10万；
步骤(1)中所述乳化的温度为30℃，乳化的时间为4小时；所述乳化在搅拌下进行，所述搅拌的速度为1000转/分钟；步骤(2)中所述W/O乳液在-50℃下淬火2小时进行热致相分离；
步骤(3)中所述相转变液与所述淬火后的乳液的体积比为2:1；所述相转变液为氢氧化钠含量为1.5％的乙醇和水混合液，所述％为质量体积百分比g/100mL；所述乙醇和水的体积比为20:1；
步骤(4)中洗涤至洗脱液pH为6.5。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多孔壳聚糖微载体的直径为220μm；所述孔隙的尺径为30～70μm；所述孔隙率为97.2％；所述比表面积为28.8m2/g；所述弹性模量为155kPa；
步骤(1)中所述壳聚糖的含量为3％；所述醋酸水溶液的醋酸含量为3％；所述乳化剂的含量为7％；所述乳化剂为Span 80与Tween 60的混合物，所述Span 80与所述Tween 60的质量比为24:5；所述有机溶剂溶液为石油醚；所述分散相与所述连续相的体积比为1:10；所述％为质量体积百分比g/100mL；所述壳聚糖的脱乙酰化程度大于80％，粘均分子量为15万；所述乳化的温度为50℃，乳化的时间为2小时；所述乳化在搅拌下进行，所述搅拌的速度为1500转/分钟；
步骤(2)中所述W/O乳液在-5℃下淬火6小时进行热致相分离；
步骤(3)中所述相转变液与所述淬火后的乳液的体积比为1:1；所述相转变液为氢氧化钠含量为3％的乙醇和水混合液，所述％为质量体积百分比g/100mL；所述乙醇和水的体积比为20:5；
步骤(4)中洗涤至洗脱液pH为7.8。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多孔壳聚糖微载体的直径为200μm；所述孔隙的尺径为10～50μm；所述孔隙率为98％；所述比表面积为30.8m2/g；所述弹性模量为145kPa；
步骤(1)中所述壳聚糖的含量为2％；所述醋酸水溶液的醋酸含量为2％；所述乳化剂的含量为3％；所述乳化剂为Span 80与Tween 60的混合物，所述Span 80与所述Tween 60的质量比为20:1；所述有机溶剂溶液为石油醚；所述分散相与所述连续相的体积比为1:5；所述％为质量体积百分比g/100mL；所述壳聚糖的脱乙酰化程度95％，粘均分子量为10万；所述乳化的温度为40℃，乳化的时间为6小时；所述乳化在搅拌下进行，所述搅拌的速度为800转/分钟；
步骤(2)中所述W/O乳液在-40℃下淬火4小时进行热致相分离；
步骤(3)中所述相转变液与所述淬火后的乳液的体积比为5:3；所述相转变液为氢氧化钠含量为2％的乙醇和水混合液，所述％为质量体积百分比g/100mL；所述乙醇和水的体积比为14:1；
步骤(4)中洗涤至洗脱液pH为6.5。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多孔壳聚糖微载体的直径为165μm；所述孔隙的尺径为25～70μm；所述孔隙率为98％；所述比表面积为29.1m2/g；所述弹性模量为140kPa；
步骤(1)中所述壳聚糖的含量为1％；所述醋酸水溶液的醋酸含量为1％；所述乳化剂的含量为5％；所述乳化剂为Span 80与Tween 60的混合物，所述Span 80与所述Tween 60的质量比为20:1；所述有机溶剂溶液为石油醚；所述分散相与所述连续相的体积比为1:5；所述％为质量体积百分比g/100mL；所述壳聚糖的脱乙酰化程度95％，粘均分子量为10万；所述乳化的温度为40℃，乳化的时间为4小时；所述乳化在搅拌下进行，所述搅拌的速度为1000转/分钟；
步骤(2)中所述W/O乳液在-10℃下淬火6小时进行热致相分离；
步骤(3)中所述相转变液与所述淬火后的乳液的体积比为5:3；所述相转变液为氢氧化钠含量为1％的乙醇和水混合液，所述％为质量体积百分比g/100mL；所述乙醇和水的体积比为14:1；
步骤(4)中洗涤至洗脱液pH为7.8。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的细胞三维培养包括如下步骤：
(1)将所述多孔壳聚糖微载体以3～5mg/mL浸泡于无血清培养液中；所述无血清培养液为RPMI-1640；所述浸泡的时间为6小时以上；
(2)将浸泡过的所述多孔壳聚糖微载体转入细胞培养板中，加入等体积细胞，所述细胞的密度为5×104个细胞/孔；
(3)将所述细胞培养板置于二氧化碳培养箱中。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711320768.7A CN108047482B (zh) | 2017-12-12 | 2017-12-12 | 一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711320768.7A CN108047482B (zh) | 2017-12-12 | 2017-12-12 | 一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108047482A CN108047482A (zh) | 2018-05-18 |
| CN108047482B true CN108047482B (zh) | 2021-10-29 |
Family
ID=62124421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711320768.7A Active CN108047482B (zh) | 2017-12-12 | 2017-12-12 | 一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108047482B (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109593704B (zh) * | 2019-01-31 | 2022-02-11 | 北京华龛生物科技有限公司 | 一种三维微载体细胞吸附培养的方法 |
| CN110251681B (zh) * | 2019-06-28 | 2022-10-21 | 华中科技大学鄂州工业技术研究院 | 一种用于软骨损伤修复的功能化壳聚糖多孔微球及其制备方法 |
| CN110327310B (zh) * | 2019-07-24 | 2021-10-22 | 华中科技大学鄂州工业技术研究院 | 一种多核共壳复合载药微球及其制备方法和应用 |
| CN110556046B (zh) * | 2019-08-09 | 2021-05-28 | 西安交通大学 | 一种双网络结构三维组织模型及其灌流一体化制备方法 |
| CN111175112A (zh) * | 2020-01-13 | 2020-05-19 | 浙江卫未生物医药科技有限公司 | 一种改良的微载体活细胞荧光染色方法 |
| CN112266487A (zh) * | 2020-10-22 | 2021-01-26 | 苏州新丝原生物科技有限公司 | 一种固体微球及其制备方法和应用 |
| CN112959740A (zh) * | 2021-03-13 | 2021-06-15 | 杭州顺风实业有限公司 | 一种抗菌纸杯及其制备方法 |
| CN116478441B (zh) * | 2023-02-23 | 2024-03-15 | 四川大学 | 一种可拼装可溶解的三维细胞培养载体及其制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102517211A (zh) * | 2011-12-08 | 2012-06-27 | 西安交通大学 | 一种可快速解离型三维细胞培养载体及制备方法 |
| CN102558601A (zh) * | 2012-01-04 | 2012-07-11 | 上海理工大学 | 一种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法 |
| CN104722251A (zh) * | 2015-04-23 | 2015-06-24 | 福建师范大学 | 一种壳聚糖基多孔微球的制备方法 |
| CN106978384A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-07-25 | 清华大学 | 多孔微冰胶细胞三维培养载体及其制备方法和制备系统 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102329728B (zh) * | 2011-10-11 | 2013-12-25 | 上海理工大学 | 一种壳聚糖/rgd三维多孔微载体及其制备方法和应用 |
| CN106350478A (zh) * | 2016-10-25 | 2017-01-25 | 浙江译美生物科技有限公司 | 一种干细胞培养体系 |
-
2017
- 2017-12-12 CN CN201711320768.7A patent/CN108047482B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102517211A (zh) * | 2011-12-08 | 2012-06-27 | 西安交通大学 | 一种可快速解离型三维细胞培养载体及制备方法 |
| CN102558601A (zh) * | 2012-01-04 | 2012-07-11 | 上海理工大学 | 一种高强度多孔壳聚糖微载体的制备方法 |
| CN104722251A (zh) * | 2015-04-23 | 2015-06-24 | 福建师范大学 | 一种壳聚糖基多孔微球的制备方法 |
| CN106978384A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-07-25 | 清华大学 | 多孔微冰胶细胞三维培养载体及其制备方法和制备系统 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108047482A (zh) | 2018-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108047482B (zh) | 一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用 | |
| Huang et al. | Porous chitosan microspheres as microcarriers for 3D cell culture | |
| Haddad et al. | Fabrication and surface modification of poly lactic acid (PLA) scaffolds with epidermal growth factor for neural tissue engineering | |
| Ikeda et al. | Fabrication and characteristics of chitosan sponge as a tissue engineering scaffold | |
| Liu et al. | The improvement of hemostatic and wound healing property of chitosan by halloysite nanotubes | |
| JP5219030B2 (ja) | 刺激応答性分解ゲル | |
| Kuo et al. | Material-driven differentiation of induced pluripotent stem cells in neuron growth factor-grafted poly (ε-caprolactone)-poly (β-hydroxybutyrate) scaffolds | |
| Thein‐Han et al. | Chitosan scaffolds for in vitro buffalo embryonic stem‐like cell culture: An approach to tissue engineering | |
| Agrawal et al. | Enhanced chondrogenesis of mesenchymal stem cells over silk fibroin/chitosan‐chondroitin sulfate three dimensional scaffold in dynamic culture condition | |
| WO2011059112A1 (ja) | 粒子含有細胞集合体 | |
| Pan et al. | Application of avidin-biotin technology to improve cell adhesion on nanofibrous matrices | |
| Lin et al. | Fibrous hydrogel scaffolds with cells embedded in the fibers as a potential tissue scaffold for skin repair | |
| CN111727234A (zh) | 用于细胞扩增的生物活性3d包封培养系统 | |
| Huang et al. | The substrate-dependent regeneration capacity of mesenchymal stem cell spheroids derived on various biomaterial surfaces | |
| Soleimanifar et al. | Conjunctiva derived mesenchymal stem cell (CJMSCs) as a potential platform for differentiation into corneal epithelial cells on bioengineered electrospun scaffolds | |
| CN104001208A (zh) | 一种生物高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料及其制备方法 | |
| Li et al. | Use of nitrocellulose membranes as a scaffold in cell culture | |
| Kong et al. | Nerve decellularized matrix composite scaffold with high antibacterial activity for nerve regeneration | |
| Rahimi et al. | Perspectives of chitosan nanofiber/film scaffolds with bone marrow stromal cells in tissue engineering and wound dressing | |
| Lv et al. | Comparative study of different seeding methods based on a multilayer SIS scaffold: Which is the optimal procedure for urethral tissue engineering? | |
| CN107837425B (zh) | 新型多孔生物陶瓷骨材料及其制备方法 | |
| Higuchi et al. | Temperature‐induced cell detachment on immobilized pluronic surface | |
| US20140219962A1 (en) | Porous chitosan scaffolds and related methods | |
| Zhu et al. | Shish-kebab structure fiber with nano and micro diameter regulate macrophage polarization for anti-inflammatory and bone differentiation | |
| Sung et al. | Enrichment of cancer-initiating cells from colon cancer cells through porous polymeric membranes by a membrane filtration method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |