CN106978384A - 多孔微冰胶细胞三维培养载体及其制备方法和制备系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多孔微冰胶细胞三维培养载体及其制备方法和制备系统，其中，制备方法包括：制备混合有机相；向混合有机相中加入水相溶液并通过搅拌法、超声法或微流道法乳化制备得到均一的油包水型乳液体系；对油包水型乳液体系进行过滤，留下待清洗的载体材料；对载体材料进行清洗，以便获得多孔微冰胶细胞三维培养载体，其中，所述乳化是在不高于零摄氏度的温度下进行的。利用该制备方法可实现多孔微冰胶细胞三维培养载体的均一化批量生产，并且多孔微冰胶细胞三维培养载体的孔隙率较大，能够在较高水平上维持细胞活性，促进细胞功能，同时还具有较强的机械弹性，能够很好的保护所培养的细胞免受生物反应器内较强机械剪切力的损伤，提高其存活率。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体而言，本发明涉及多孔微冰胶细胞三维培养载体及其制备方法和制备系统。
背景技术
随着生命科学技术发展，相关科研机构及生产企业对于细胞培养提出更高的要求。传统二维细胞培养方法存在诸多弊端，主要包括：1、二维平面培养无法模拟生理状态下细胞的三维生长环境，长期培养会导致细胞表型改变，为生物医学研究带来障碍。2、二维培养受限于平面的空间，无法实现大规模的细胞扩增。
基于以上问题，三维多孔细胞培养载体模拟了三维细胞生长环境，有利于保留细胞的生理特性；三维多孔结构为细胞粘附、增殖提供了巨大的空间，而且能够更好地模拟细胞在体内的微环境，有利于在实验室级别的有限培养空间内或生产级别中实现细胞的大规模扩增。而目前发现作为细胞培养的多孔三维微载体的均一性和三维多孔性对于细胞生物学的性能影响至关重要，因此亟待开发一种能够有效制备高均一性三维多孔微载体的技术。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出多孔微冰胶细胞三维培养载体及其制备方法和制备系统，利用该制备方法和制备系统可以实现多孔微冰胶细胞三维培养载体的均一化批量生产，并且多孔微冰胶细胞三维培养载体的孔隙率发达，能够在较高水平上维持细胞活性，促进细胞功能。
根据本发明的一个方面，本发明提出了多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法，根据本发明实施例的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法包括：
制备混合有机相；
向所述混合有机相中加入水相溶液并通过搅拌法、超声法或微流道法乳化制备得到均一的油包水型乳液体系；
对所述油包水型乳液体系进行过滤，留下待清洗的载体材料；
对所述载体材料进行清洗，以便获得多孔微冰胶细胞三维培养载体，
其中，所述乳化是在不高于零摄氏度的温度下进行的。
由此，通过采用该方法通过使乳化过程在不高于零摄氏度的低温下进行，可以有效实现多孔微冰胶细胞三维培养载体的均一化批量生产，且制备出的多孔微冰胶细胞三维培养载体具有发达的孔隙率，有利于保留细胞的生理特性，并为细胞粘附、增值提供巨大的空间，能够在较高水平上维持细胞活性，促进细胞功能。另外，根据本发明上述实施例的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述乳化是在0～-120摄氏度的温度下进行的。由此，可以进一步改善多孔微冰胶细胞三维培养载体的孔径大小、孔隙率以及均一化程度。
在本发明的一些实施例中，所述乳化是在0～-40摄氏度的温度下进行的。由此，可以进一步改善多孔微冰胶细胞三维培养载体的孔径大小、孔隙率以及均一化程度。
在本发明的一些实施例中，所述乳化采用的制冷液为选自乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙二醇、正己烷、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈中的至少一种。由此，可以进一步提高乳化过程中的制冷效果以及温度控制，进而提高多孔微冰胶细胞三维培养载体的颗粒均一化程度。
在本发明的一些实施例中，所述乳化是在300～2000rmp/min的转速下进行的。由此，可以进一步提高乳液体系的均一性和乳化效率。
在本发明的一些实施例中，所述乳化的时间为4-24小时。由此，可以进一步优化多孔微冰胶细胞三维培养载体的机械强度。
在本发明的一些实施例中，所述混合有机相中含有有机溶剂和非离子型表面活性剂，其中，所述有机溶剂为选自四氯化碳、石油醚、液态石蜡、食用油、大豆油、氯仿和二氯甲烷中的至少一种，所述非离子型表面活性剂为选自脂肪酸甘油酯、司班、土温、PO-500和氢氟醚中的至少一种。由此，可以进一步提高多孔微冰胶细胞三维培养载体的均一性。
在本发明的一些实施例中，所述水相溶液包含人工合成的生物材料和/或天然生物材料，其中，所述人工合成的生物材料为选自聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯中的至少一种；
所述天然生物材料为选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白中的至少一种；
所述水相溶液中还包含固化剂，所述固化剂为选自二乙烯基苯和二异氰酸酯，N,N-亚甲基双丙烯酰胺，戊二醛，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，钙离子，四甲基乙二胺，硫酸铵，京尼平，转谷酰胺酶等。
根据本发明的第二方面，本发明提出了多孔微冰胶细胞三维培养载体，所述多孔微冰胶细胞三维培养载体由前面实施例所述多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法制备得到。由此，该多孔微冰胶细胞三维培养载体的颗粒均一化程度高，且具有发达的孔隙率，有利于保留细胞的生理特性，并为细胞粘附、增值提供巨大的空间，能够在较高水平上维持细胞活性，促进细胞功能。在本发明的一些实施例中，所述多孔微冰胶细胞三维培养载体的粒径为80-150微米、150-250微米、250-400微米或者400微米-1000微米；所述多孔微冰胶细胞三维培养载体上微孔的孔径为30-100微米，孔隙率为90-95％。由此，可以根据不同的需求制备出不同粒径范围的多孔微冰胶细胞三维培养载体，并满足多孔微冰胶细胞三维培养载体维持细胞活性，促进细胞功能的需求。
根据本发明的第三方面，本发明提出了多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统，根据本发明实施例的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统包括：
低温循环装置，所述低温循环装置包括温控器、循环泵和冷凝槽，所述冷凝槽内适于盛装制冷液，所述温控器与所述冷凝槽相连，所述循环泵设置在所述温控器内，且适于使制冷液在所述冷凝槽和所述温控器之间循环，所述温控器适于调控所述制冷液的温度不高于零摄氏度；
反应釜，所述反应釜适于设置在所述冷凝槽内，所述反应釜具有混合有机相入口和水相溶液入口；
搅拌装置，所述搅拌装置包括控制器和搅拌桨，所述搅拌桨与所述控制器相连并延伸至所述反应釜内，所述搅拌桨适于对所述反应釜内的由所述混合有机相入口和所述水相溶液入口依次加入的混合有机相和水相溶液进行搅拌，并得到乳化液；
过滤装置，所述过滤装置与所述反应釜相连且适于对所述乳化液进行过滤，以便滤除反应后的有机相溶液并得到载体材料；
清洗装置，所述清洗装置与所述过滤装置相连且适用于对所述载体材料进行清洗，以便去除有机相并获得多孔微冰胶细胞三维培养载体。
由此，通过采用上述多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统，利用低温循环装置可以对反应釜内的温度控制在不高于零摄氏度，由此可以使得反应釜的乳化在不高于零摄氏度的低温下进行。由此可以有效实现多孔微冰胶细胞三维培养载体的均一化批量生产，得到具有发达孔隙率的多孔微冰胶细胞三维培养载体，为细胞粘附、增值提供巨大的空间。
在本发明的一些实施例中，所述反应釜适于设置在所述冷凝槽内以满足所述反应釜外的制冷液液面高于所述反应釜内的乳化液液面。由此，可以更为有效地控制乳化过程的温度以及维持反应釜内油包水型乳液体系的温度均匀性。
在本发明的一些实施例中，所述反应釜为玻璃反应釜或者金属反应釜。由此，可以进一步提高反应釜的导热效率，以便更好的控制乳化过程的温度。
在本发明的一些实施例中，所述反应釜的规格为100ml-100L。由此，该系统可以适于不同需求进行不同批量化生产，进而提高该系统的灵活性。
在本发明的一些实施例中，所述温控器分别通过制冷液输出管道和制冷液输入管道与所述冷凝槽相连。由此，可以更为有效地控制乳化体系的温度。在本发明的一些实施例中，所述过滤装置具有第一过滤网和第二过滤网，所述第一过滤网的孔径为150微米，所述第二过滤网的孔径为80微米；
或者，所述第一过滤网的孔径为250微米，所述第二过滤网的孔径为150微米；
或者，所述第一过滤网的孔径为400微米，所述第二过滤网的孔径为250微米；
或者，所述第一过滤网的孔径为1000微米，所述第二过滤网的孔径为400微米。
由此，可以进一步提高制备得到的多孔微冰胶细胞三维培养载体的粒径均一性。
在本发明的一些实施例中，所述制冷液为凝固点在0～-120℃的液态溶液，所述液态溶液为选自乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙二醇、正己烷、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃和乙腈中的至少一种，优选乙酸乙酯和/或乙醇。由此，可以进一步提高制冷效果。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明一个实施例的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法的流程图。
图2是根据本发明一个实施例的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统的结构示意图。
图3是根据本发明一个实施例的多孔微冰胶细胞三维培养载体的显微镜图像。
图4是根据本发明一个实施例的多孔微冰胶细胞三维培养载体扫描电镜图像。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的一个方面，本发明提出了多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法，根据本发明实施例的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法包括：制备混合有机相；向混合有机相中加入水相溶液并通过搅拌法、超声法或微流道法乳化制备得到均一的油包水型乳液体系；对油包水型乳液体系进行过滤，留下待清洗的载体材料；对载体材料进行清洗，以便获得多孔微冰胶细胞三维培养载体，其中，乳化是在不高于零摄氏度的温度下进行的。
由此，通过采用该方法可以实现多孔微冰胶细胞三维培养载体的均一化批量生产，且制备得到的多孔微冰胶细胞三维培养载体具有发达的孔隙率，有利于保留细胞的生理特性，并为细胞粘附、增值提供巨大的空间，能够在较高水平上维持细胞活性，促进细胞功能。同时制备得到的多孔微冰胶细胞三维培养载体还具有较强的机械弹性，能够很好的保护所培养的细胞免受生物反应器内较强机械剪切力的损伤，提高其存活率。
下面参考图1对本发明上述实施例的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法进行详细描述。
S100：制备混合有机相
根据本发明的实施例，首先制备混合有机相。
根据本发明的具体实施例，混合有机相中可以含有有机溶剂和非离子型表面活性剂，具体地，选择有机相后加入浓度比例适合的非离子型表面活性剂，并混合均匀。其中，有机溶剂为选自四氯化碳、石油醚、液态石蜡、食用油、大豆油、氯仿和二氯甲烷中的至少一种，非离子型表面活性剂为选自脂肪酸甘油酯、司班、土温、PO-500和氢氟醚中的至少一种。由此，可以显著提高有机相在水相溶液中的分散性，进而提高制备得到的多孔微冰胶细胞三维培养载体的均一性。
S200：低温乳化
根据本发明的实施例，向混合有机相中加入水相溶液并通过搅拌法、超声法或微流道法乳化制备得到均一的油包水型乳液体系。其中，乳化是在不高于零摄氏度的温度下进行的。
根据本发明的具体实施例，水相溶液可以为包含人工合成的生物材料和/或天然生物材料，其中，人工合成的生物材料为选自聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯中的至少一种；天然生物材料可以为选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白中的至少一种。由此，可以进一步提高乳化效率。
根据本发明的具体实施例，水相溶液中还可以包含固化剂，固化剂可以为选自二乙烯基苯和二异氰酸酯，N,N-亚甲基双丙烯酰胺，戊二醛，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，钙离子，四甲基乙二胺，硫酸铵，京尼平和转谷酰胺酶中的至少一种。具体地，在混合有机相与水相溶液混合之前，向水相中加入一定量的固化剂，由此，可以进一步提高乳液体系的稳定性，进而达到提高乳化效率的目的。
本发明的完成是基于发明人意外地发现，在低温条件下进行乳化，乳化过程中可以利用冰晶占位的作用使得乳化颗粒上形成大量的连通孔。并且发明人通过进一步实验发现，通过改变体系的温度可以进一步控制孔径的大小、孔隙率等特征。同时还发现在低温的乳化体系下以不同的搅拌速率进行搅拌，可以获得不同粒径分布的均一颗粒，进而制备得到孔隙发达且粒径均一的多孔微冰胶细胞三维培养载体。
根据本发明的具体实施例，乳化具体可以在0～-120摄氏度的温度下进行。更优选地，乳化可以在0～-40摄氏度的温度下进行。可以进一步提高乳化颗粒的孔隙率，使制备得到的多孔微冰胶细胞三维培养载体孔隙发达。
根据本发明的具体实施例，乳化采用的制冷液可以为选自乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙二醇、正己烷、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈中的至少一种。发明人发现，以上所述的制冷液凝固点均比较低，在零摄氏度以下仍具有较好的流动性，由此，可以更好地控制低乳化过程中的制冷效果，进而提高乳化颗粒的均一性。
根据本发明的具体实施例，发明人发现在低温的乳化体系下以不同的搅拌速率进行搅拌，可以获得不同粒径分布的均一颗粒。为此，可以通过设置控制器的转速控制范围300～2000rmp/min，使得乳化在300～2000rmp/min的搅拌速度下进行。由此，可以进一步提高乳化颗粒的均一性，并且制备得到不同粒径的多孔微冰胶细胞三维培养载体。
根据本发明的具体示例，可以通过控制转速制备得到不同粒径范围的多孔微冰胶细胞三维培养载体，例如当控制300rmp/min的转速可以制备得到400-1000微米粒度范围的载体颗粒，而2000rmp/min的转速适合制备80-150微米粒度范围的载体颗粒，进而满足不同粒径需求。
根据本发明的具体实施例，乳化的时间可以为4-24小时。由此，可以进一步提高乳液体系的均一性和稳定性。发明人发现，通过控制上述乳化时间，可以进一步优化多孔三维微载体本身的机械强度。若乳化时间过短，机械强度低，载体本身相对较软；乳化时间过长，机械强度越大，载体本身相对较硬。由此可根据不同细胞，不同应用领域适当调节乳化时间为4-24小时，进而得到本身机械强度适合的多孔微冰胶细胞三维培养载体，进而能够很好的保护所培养的细胞免受生物反应器内较强机械剪切力的损伤，提高其存活率。
根据本发明的具体实施例，通过控制上述乳化条件，制备得到粒径可以为80-150微米、150-250微米、250-400微米或者400-1000微米的多孔微冰胶细胞三维培养载体，进而满足对不同的粒径需求。并且在上述乳化条件下制备得到的多孔微冰胶细胞三维培养载体上微孔的孔径为30-100微米，孔隙率可以达到90-95％。因此该多孔微冰胶细胞三维培养载体具有更大的比表面积，进而显著提高的细胞培养空间，更好地模拟细胞在体内的微环境，有利于在有限的培养空间内实现细胞的大规模扩增。
S300：过滤
根据本法明的实施例，对油包水型乳液体系进行过滤，留下待清洗的载体材料。
根据本发明的具体实施例，可以选用具有一定孔径的滤网将有机相滤除，并根据不同的用途筛选出所需粒径范围内粒径的多孔微冰胶细胞三维培养载体。由此，可以进一步提高所需的多孔微冰胶细胞三维培养载体的均一性。
S400：清洗
根据本法明的实施例，对载体材料进行清洗，以便获得多孔微冰胶细胞三维培养载体。
根据本发明的具体实施例，可以先采用丙酮进行预清洗，再用去离子水进行清洗。由此可以有效除去载体材料表面的有机相。
根据本发明的具体实施例，进一步地将经过清洗后的多孔微冰胶细胞三维培养载体润湿在少量水中，并转移至-20℃冰箱内冷冻，冷冻后转移至冻干机内冷冻干燥24小时。得到的多孔微冰胶细胞三维培养载体上微孔的孔径为30-100微米，孔隙率可以达到90-95％。经过后续灭菌步骤可以进行细胞的种植、培养和扩增。
根据本发明的第二方面，本发明提出了多孔微冰胶细胞三维培养载体，该多孔微冰胶细胞三维培养载体由前面实施例多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法制备得到。由此，该多孔微冰胶细胞三维培养载体的颗粒均一化程度高，且具有发达的孔隙率，有利于保留细胞的生理特性，并为细胞粘附、增值提供巨大的空间，能够在较高水平上维持细胞活性，促进细胞功能。
根据本发明的具体实施例，多孔微冰胶细胞三维培养载体的粒径为80-150微米、150-250微米、250-400微米或者400-1000微米。由此，可以根据不同的需求制备出不同粒径范围的多孔微冰胶细胞三维培养载体，以满足多孔微冰胶细胞三维培养载体维持细胞活性，促进细胞功能的需求。
根据本发明的具体实施例，多孔微冰胶细胞三维培养载体上微孔的孔径为30-100微米，孔隙率为90-95％。由此该多孔微冰胶细胞三维培养载体具有更大的比表面积，进而显著提高的细胞培养空间，更好地模拟细胞在体内的微环境，有利于在有限的培养空间内实现细胞的大规模扩增。
根据本发明的第三方面，本发明提出了多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统，如图2所示，多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统包括：低温循环装置10、反应釜20、搅拌装置30、过滤装置40和清洗装置50。
下面参考图2对本发明上述实施例的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统进行详细描述。
低温循环装置10
根据本发明的实施例，低温循环装置10包括温控器11、循环泵12和冷凝槽13，冷凝槽13内适于盛装制冷液，温控器11与冷凝槽13相连，循环泵12设置在温控器11内，且适于使制冷液在冷凝槽13和温控器11之间循环，温控器11适于调控制冷液的温度不高于零摄氏度。由此，可以有效的控制反应釜内的温度，使乳化在不高于零摄氏度的低温条件下进行。
根据本发明的具体实施例，制冷液为凝固点在0～-120℃的液态溶液，液态溶液为选自乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙二醇、正己烷、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃和乙腈中的至少一种，优选乙酸乙酯和/或乙醇。由此，可以进一步提高乳化过程中的制冷效果，进而提高混合有机相和水相溶液的乳化效率。
根据本发明的具体实施例，温控器11分别通过制冷液输出管道14和制冷液输入管道15与冷凝槽13相连。由此，可以有效地使得制冷液在温控器11与冷凝槽13之间进行循环，进而保持制冷液的温度，实现对设置在冷凝槽13内的反应釜的温度进行有效控制，以便最终控制乳化过程的温度不高于零摄氏度。
反应釜20
根据本发明的实施例，反应釜20适于设置在冷凝槽13内，反应釜20具有混合有机相入口21和水相溶液入口22。反应釜20适于对混合有机相和水相溶液进行乳化。
根据本发明的具体实施例，反应釜20适于设置在冷凝槽13内以满足反应釜20外的制冷液液面高于反应釜20内的乳化液液面。由此，可以进一步控制反应釜20内的温度，使乳化过程中的温度维持在预定范围内。
根据本发明的具体实施例，反应釜20可以为玻璃反应釜或者金属反应釜。本发明中通过采用导热效果较好的玻璃或金属作为反应釜20制备材料，可以进一步提高反应釜的导热效率，以便更好的控制乳化过程的温度。
根据本发明的具体实施例，反应釜20的规格可以为100ml-100L。由此，该系统可以适于不同需求进行不同批量化生产，进而提高该系统的灵活性。
根据本发明的具体实施例，乳化过程在反应釜20内进行，具体地，首先制备混合有机相并将其置于反应釜20中，再向混合有机相中加入水相溶液并通过搅拌法、超声法或微流道法乳化制备得到均一的油包水型乳液体系。其中，乳化是在不高于零摄氏度的温度下进行的。
根据本发明的实施例，混合有机相中可以含有有机溶剂和非离子型表面活性剂；水相溶液可以为包含人工合成的生物材料和/或天然生物材料，进一步地，水相溶液中还可以包含固化剂。
根据本发明的具体实施例，乳化具体可以在0～-120摄氏度的温度下进行。更优选地，乳化可以在0～-40摄氏度的温度下进行。可以进一步提高乳化颗粒的孔隙率，使制备得到的多孔微冰胶细胞三维培养载体孔隙发达。
根据本发明的具体实施例，乳化的时间可以为4-24小时。由此，可以进一步提高乳液体系的均一性和稳定性。发明人发现，通过控制上述乳化时间，可以进一步优化多孔三维微载体本身的机械强度。若乳化时间过短，机械强度低，载体本身相对较软；乳化时间过长，机械强度越大，载体本身相对较硬。由此可根据不同细胞，不同应用领域适当调节乳化时间为4-24小时，进而得到本身机械强度适合的载体。
搅拌装置30
根据本发明的实施例，搅拌装置30包括控制器31和搅拌桨32，搅拌桨32与控制器31相连并延伸至反应釜20内，搅拌桨32适于对反应釜20内的由混合有机相入口21和水相溶液入口22依次加入的混合有机相和水相溶液进行搅拌，并得到乳化液。
根据本发明的具体实施例，发明人发现在低温的乳化体系下以不同的搅拌速率进行搅拌，可以获得不同粒径分布的均一颗粒。为此，可以通过控制乳化过程中搅拌桨32的转速可以为300～2000rmp/min。由此，可以进一步提高乳化颗粒的均一性，并且制备得到不同粒径的多孔微冰胶细胞三维培养载体。
根据本发明的具体示例，可以通过控制转速制备得到不同粒径范围的多孔微冰胶细胞三维培养载体，例如当控制300rmp/min的转速可以制备得到400-1000微米粒度范围的载体颗粒，而2000rmp/min的转速适合制备80-150微米粒度范围的载体颗粒，进而满足不同粒径需求。
过滤装置40
根据本发明的实施例，过滤装置40与反应釜20相连且适于对乳化液进行过滤，以便滤除反应后的有机相溶液并得到载体材料。
根据本发明的具体实施例，可以选用具有一定孔径的滤网将有机相滤除，并根据不同的用途筛选出所需粒径范围内的多孔微冰胶细胞三维培养载体。由此，可以进一步提高所需的多孔微冰胶细胞三维培养载体的均一性。
根据本发明的具体实施例，过滤装置40可以具有第一过滤网和第二过滤网，第一过滤网的孔径为150微米，第二过滤网的孔径为80微米，由此得到粒径范围在80-150微米的多孔微冰胶细胞三维培养载体；或者第一过滤网的孔径为250微米，第二过滤网的孔径为150微米，由此得到粒径范围在150-250微米的多孔微冰胶细胞三维培养载体；或者第一过滤网的孔径为400微米，第二过滤网的孔径为250微米，由此得到粒径范围在250-400微米的多孔微冰胶细胞三维培养载体；或者第一过滤网的孔径为1000微米，第二过滤网的孔径为400微米，由此得到粒径范围在400-1000微米的多孔微冰胶细胞三维培养载体。由此通过过滤装置40可以得到满足粒径需求和均一性高的多孔微冰胶细胞三维培养载体。
清洗装置50
根据本发明的实施例，清洗装置50与过滤装置40相连且适用于对载体材料进行清洗，以便去除有机相并获得多孔微冰胶细胞三维培养载体。
根据本发明的实施示例，可以先采用丙酮进行预清洗，再用去离子水进行清洗。由此可以有效除去载体材料表面的有机相。
实施例1
制备混合有机相并将其置于反应釜中，在搅拌桨的搅拌作用下向有机相内加入水相溶液，通过搅拌发生乳化形成均匀分散的乳液液滴，经过过滤、清洗得到多孔微冰胶细胞三维培养载体。其中，在乳化过程中，利用低温循环装置提供循环流动的低温乙醇，控制整个反应釜内的温度维持在-20摄氏度；并控制搅拌桨的转速为1500rmp/min。
由该方法制备得到的多孔微冰胶细胞三维培养载体经过最后的冷冻干燥后重新浸泡在水溶液中的显微镜图像如图3(A)所示，显示可规模化制备出粒径范围为80～150μm的均一化球形微冰胶载体；冷冻干燥后SEM图像如图4(A)所示，可以观察到该载体粒径分布均匀，表面具有高度联通的微孔结构，孔径大小约为30～40μm，孔隙率约为90％。有利于细胞的粘附以及物质交换。
实施例2
制备混合有机相并将其置于反应釜中，在搅拌桨的搅拌作用下向有机相内加入水相溶液，通过搅拌发生乳化形成均匀分散的乳液液滴，经过过滤、清洗得到多孔微冰胶细胞三维培养载体。其中，在乳化过程中，利用低温循环装置提供循环流动的低温乙醇，控制整个反应釜内的温度维持在-30摄氏度；并控制搅拌桨的转速为1000rmp/min。
由该方法制备得到的微冰胶细胞培养载体经过最后的冷冻干燥后重新浸泡在水溶液中的显微镜图像如图3(B)所示，显示可规模化制备出粒径范围为150～250μm的均一化球形微冰胶载体；冷冻干燥后SEM图像如图4(B)所示，可以观察到该载体粒径分布均匀，表面具有高度联通的微孔结构，孔径可达40～50μm，孔隙率约为90％～95％。有利于细胞的粘附以及物质交换。
实施例3
制备混合有机相并将其置于反应釜中，在搅拌桨的搅拌作用下向有机相内加入水相溶液，通过搅拌发生乳化形成均匀分散的乳液液滴，经过过滤、清洗得到多孔微冰胶细胞三维培养载体。其中，在乳化过程中，利用低温循环装置提供循环流动的低温乙醇，控制整个反应釜内的温度维持在-40摄氏度；并控制搅拌桨的转速为300rmp/min。
由该方法制备得到的微冰胶细胞培养载体经过最后的冷冻干燥后重新浸泡在水溶液中的显微镜图像如图3(C)所示，显示可规模化制备出粒径范围为250～400μm的均一化球形微冰胶载体；冷冻干燥后SEM图像如图4(C)和图4(D)所示，可以观察到该载体粒径分布均匀，表面具有高度联通的微孔结构，孔径可达50～60μm，孔隙率约为95％。有利于细胞的粘附以及物质交换。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (15)
1.一种多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法，其特征在于，包括：
制备混合有机相；
向所述混合有机相中加入水相溶液并通过搅拌法、超声法或微流道法乳化制备得到均一的油包水型乳液体系；
对所述油包水型乳液体系进行过滤，留下待清洗的载体材料；
对所述载体材料进行清洗，以便获得多孔微冰胶细胞三维培养载体，
其中，所述乳化是在不高于零摄氏度的温度下进行的。
2.根据权利要求1所述的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法，其特征在于，所述乳化是在0～-120摄氏度的温度下进行的，
优选地，所述乳化是在0～-40摄氏度的温度下进行的，
所述乳化采用的制冷液为选自乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙二醇、正己烷、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法，其特征在于，所述乳化是在300～2000rmp/min的转速下进行的。
4.根据权利要求1所述的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法，其特征在于，所述乳化的时间为4-24小时。
5.根据权利要求1的制备多孔微冰胶细胞三维培养载体的所述方法，其特征在于，所述混合有机相中含有有机溶剂和非离子型表面活性剂，其中，所述有机溶剂为选自四氯化碳、石油醚、液态石蜡、食用油、大豆油、氯仿和二氯甲烷中的至少一种，所述非离子型表面活性剂为选自脂肪酸甘油酯、司班、土温、PO-500和氢氟醚中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法，其特征在于，所述水相溶液包含人工合成的生物材料和/或天然生物材料，其中，所述人工合成的生物材料为选自聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯中的至少一种；
所述天然生物材料为选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白中的至少一种；
所述水相溶液中还包含固化剂，所述固化剂为选自二乙烯基苯和二异氰酸酯，N,N-亚甲基双丙烯酰胺，戊二醛，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，钙离子，四甲基乙二胺，硫酸铵，京尼平和转谷酰胺酶中的至少一种。
7.一种多孔微冰胶细胞三维培养载体，其特征在于，所述多孔微冰胶细胞三维培养载体由权利要求1-6任一项所述多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备方法制备得到。
8.根据权利要求7所述的多孔微冰胶细胞三维培养载体，其特征在于，所述多孔微冰胶细胞三维培养载体的粒径为80-150微米、150-250微米、250-400微米或者400-1000微米；
所述多孔微冰胶细胞三维培养载体上微孔的孔径为30-100微米，孔隙率为90-95％。
9.一种多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统，其特征在于，包括：
低温循环装置，所述低温循环装置包括温控器、循环泵和冷凝槽，所述冷凝槽内适于盛装制冷液，所述温控器与所述冷凝槽相连，所述循环泵设置在所述温控器内，且适于使制冷液在所述冷凝槽和所述温控器之间循环，所述温控器适于调控所述制冷液的温度不高于零摄氏度；
反应釜，所述反应釜适于设置在所述冷凝槽内，所述反应釜具有混合有机相入口和水相溶液入口；
搅拌装置，所述搅拌装置包括控制器和搅拌桨，所述搅拌桨与所述控制器相连并延伸至所述反应釜内，所述搅拌桨适于对所述反应釜内的由所述混合有机相入口和所述水相溶液入口依次加入的混合有机相和水相溶液进行搅拌，并得到乳化液；
过滤装置，所述过滤装置与所述反应釜相连且适于对所述乳化液进行过滤，以便滤除反应后的有机相溶液并得到载体材料；
清洗装置，所述清洗装置与所述过滤装置相连且适用于对所述载体材料进行清洗，以便去除有机相并获得多孔微冰胶细胞三维培养载体。
10.根据权利要求9所述的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统，其特征在于，所述反应釜适于设置在所述冷凝槽内以满足所述反应釜外的制冷液液面高于所述反应釜内的乳化液液面。
11.根据权利要求9所述的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统，其特征在于，所述反应釜为玻璃反应釜或者金属反应釜。
12.根据权利要求9所述的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统，其特征在于，所述反应釜的规格为100ml-100L。
13.根据权利要求9所述的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统，其特征在于，所述温控器分别通过制冷液输出管道和制冷液输入管道与所述冷凝槽相连。
14.根据权利要求9所述的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统，其特征在于，所述过滤装置具有第一过滤网和第二过滤网，所述第一过滤网的孔径为150微米，所述第二过滤网的孔径为80微米；
或者，所述第一过滤网的孔径为250微米，所述第二过滤网的孔径为150微米；
或者，所述第一过滤网的孔径为400微米，所述第二过滤网的孔径为250微米；
或者，所述第一过滤网的孔径为1000微米，所述第二过滤网的孔径为400微米。
15.根据权利要求9所述的多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统，其特征在于，所述制冷液为凝固点在0～-120℃的液态溶液，所述液态溶液为选自乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙二醇、正己烷、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃和乙腈中的至少一种，
优选乙酸乙酯和/或乙醇。
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108047482A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-05-18 | 华中科技大学鄂州工业技术研究院 | 一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用 |
| CN109593704A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-04-09 | 北京华龛生物科技有限公司 | 一种三维微载体细胞吸附培养的方法 |
| CN111534489A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-08-14 | 清华大学 | 一种基于3d打印的t淋巴细胞扩增方法 |
| CN111921012A (zh) * | 2020-08-03 | 2020-11-13 | 北京华龛生物科技有限公司 | 一种三维多孔微载体支架及其采用离子型添加剂制备的方法 |
| CN115094029A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-09-23 | 中国海洋大学 | 复合明胶冷冻凝胶细胞3d培养微载体及其大体积制备方法 |
| CN115404195A (zh) * | 2021-05-27 | 2022-11-29 | 台湾创新材料股份有限公司 | 具有连续外壁及支架结构可用于培养细胞的微载体 |
| CN115612159A (zh) * | 2022-10-25 | 2023-01-17 | 中国海洋大学 | 一种用于细胞3d培养的可食用介质及其交联方法 |
| CN116077741A (zh) * | 2022-08-24 | 2023-05-09 | 深圳先进技术研究院 | 一种可固定细胞并在体内实现细胞增殖和释放的微米级3d细胞生物支架及其应用 |
| WO2023104096A1 (zh) * | 2021-12-07 | 2023-06-15 | 中科睿极(深圳)医学科技有限公司 | 多孔微载体及其制备方法 |
| WO2023138389A1 (zh) * | 2022-01-18 | 2023-07-27 | 中国科学院动物研究所 | 一种微载体及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103877613A (zh) * | 2012-12-19 | 2014-06-25 | 清华大学 | 基于微冰胶构建注射型三维细胞微环境的系统和方法 |
| WO2015122771A1 (en) * | 2014-02-13 | 2015-08-20 | Academisch Ziekenhuis Groningen | Multipotent stromal cell loaded microcarriers |
| CN207405148U (zh) * | 2017-03-24 | 2018-05-25 | 清华大学 | 多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统 |
-
2017
- 2017-03-24 CN CN201710184720.1A patent/CN106978384B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103877613A (zh) * | 2012-12-19 | 2014-06-25 | 清华大学 | 基于微冰胶构建注射型三维细胞微环境的系统和方法 |
| WO2015122771A1 (en) * | 2014-02-13 | 2015-08-20 | Academisch Ziekenhuis Groningen | Multipotent stromal cell loaded microcarriers |
| CN207405148U (zh) * | 2017-03-24 | 2018-05-25 | 清华大学 | 多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备系统 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHOI SW等: "Uniform beads with controllable pore sizes for biomedical applications", 《SMALL》 * |
| 过杰等: "基于二维激光观测的溢油及其乳化过程散射模式研究进展", 《海洋科学》 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108047482B (zh) * | 2017-12-12 | 2021-10-29 | 华中科技大学鄂州工业技术研究院 | 一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用 |
| CN108047482A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-05-18 | 华中科技大学鄂州工业技术研究院 | 一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用 |
| CN109593704A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-04-09 | 北京华龛生物科技有限公司 | 一种三维微载体细胞吸附培养的方法 |
| CN109593704B (zh) * | 2019-01-31 | 2022-02-11 | 北京华龛生物科技有限公司 | 一种三维微载体细胞吸附培养的方法 |
| CN111534489A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-08-14 | 清华大学 | 一种基于3d打印的t淋巴细胞扩增方法 |
| CN111921012A (zh) * | 2020-08-03 | 2020-11-13 | 北京华龛生物科技有限公司 | 一种三维多孔微载体支架及其采用离子型添加剂制备的方法 |
| CN115404195A (zh) * | 2021-05-27 | 2022-11-29 | 台湾创新材料股份有限公司 | 具有连续外壁及支架结构可用于培养细胞的微载体 |
| CN115404195B (zh) * | 2021-05-27 | 2024-08-06 | 台湾创新材料股份有限公司 | 具有连续外壁及支架结构可用于培养细胞的微载体 |
| WO2023104096A1 (zh) * | 2021-12-07 | 2023-06-15 | 中科睿极(深圳)医学科技有限公司 | 多孔微载体及其制备方法 |
| WO2023138389A1 (zh) * | 2022-01-18 | 2023-07-27 | 中国科学院动物研究所 | 一种微载体及其应用 |
| CN115094029A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-09-23 | 中国海洋大学 | 复合明胶冷冻凝胶细胞3d培养微载体及其大体积制备方法 |
| CN116077741A (zh) * | 2022-08-24 | 2023-05-09 | 深圳先进技术研究院 | 一种可固定细胞并在体内实现细胞增殖和释放的微米级3d细胞生物支架及其应用 |
| CN115612159A (zh) * | 2022-10-25 | 2023-01-17 | 中国海洋大学 | 一种用于细胞3d培养的可食用介质及其交联方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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