CN111727234A - 用于细胞扩增的生物活性3d包封培养系统 - Google Patents

Abstract

提供了用于生长细胞的系统和方法。用于生长和储存细胞的胶囊包括限定内部区室的外壳和位于区室内的用于细胞附着的基质。所述基质包含聚合物和一种或多种粘附分子。用于细胞附着的基质可以是外壳的内表面和/或沉积在内部区室内的水凝胶。所述胶囊可以进一步包括粘附于基质的细胞，如干细胞。

Description

用于细胞扩增的生物活性3D包封培养系统

相关申请

本申请要求2017年11月22日提交的美国临时申请No.62/589,934的权益。将以上申请的全部教导按引用并入本文中。

背景技术

细胞存在于许多工业应用中，其范围从疫苗的生产到用作细胞疗法。细胞在生物反应器系统中的悬浮已经允许细胞培养的自动化和规模化以用于此类工业应用。特别令人关注和具有挑战性的是，锚定依赖性细胞(anchorage-dependent cell)作为二维(2D)组织培养处理表面上的单层培养，例如T-烧瓶、多层细胞设备[3，4]以及滚瓶或基于中空纤维的生物反应器系统[5，6]。最近，已经出现了向悬浮培养中培养锚定依赖性细胞的转变，因为悬浮培养具有以高于传统2D培养的更高空间效率形式提供高产量的能力，而传统2D培养需要逻辑上不切实际的平面生长表面积，特别是对于商业生产规模。

微载体，最通常由聚苯乙烯制成并涂覆有胶原蛋白或层粘连蛋白用于细胞附着，使得能够在搅拌罐生物反应器中悬浮培养锚定依赖性细胞[7-10]。间充质干细胞(MSC)粘附于微载体，并在300mL至1000L范围的搅拌罐生物反应器中进行培养以进行大规模扩增[11]。基于微载体的生物反应器技术提供了显著优势，如大的表面积-体积比、过程控制、闭环采样和均一的培养条件[12-16]。尽管微载体技术具有优势，但仍然需要克服许多挑战，并且需要用于培养锚定依赖性细胞的改良系统和方法。

发明内容

本发明的方法和系统提供了可以用于细胞扩增和/或储存的包封细胞培养系统。

在一个实施方式中，本发明涉及用于生长或储存细胞如粘附细胞的胶囊。所述胶囊包括限定内部区室的外壳和位于内部区室内的用于细胞附着的基质。所述基质包括可以含有一种或多种粘附分子的聚合物。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种储存细胞的方法，其包括将细胞包封在胶囊中，所述胶囊具有限定内部区室的外壳和位于内部区室内的用于细胞附着的基质。细胞粘附于胶囊内部区室内的基质。

在一些实施方式中，用于细胞附着的基质可以是外壳的内表面和/或沉积在内部区室内的水凝胶。水凝胶可以包含交联的聚乙二醇(PEG)、交联的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)或其组合。外壳可以包含聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、海藻酸盐、壳聚糖、与海藻酸盐或壳聚糖共聚的PEG以及与海藻酸盐或壳聚糖共聚的PEGDA，或其组合。其他聚合物可以包括聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚-L-赖氨酸(PLL)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丙烯酰胺聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱]-嵌段-(甘油单甲基丙烯酸酯)(PMPC-PGMA)、χ-乙炔-聚(叔-丁基丙烯酸酯)(PtBA)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(二乙烯基苯-共-缩水甘油基甲基丙烯酸酯)(P(DVB-GMA))、聚(酰胺胺)(PAMAM)、聚(D-葡糖酰胺亚乙基甲基丙烯酸酯)(poly(D-glucosamidoethylenemethacrylate))(PGAMA)、聚(2-乳酸生物酰胺乙基甲基丙烯酸酯)(PLAMA)、烷基硫醚末端功能化的聚(甲基丙烯酸)(PMAA-DDT)、聚(乙二醇)-膦(PEG-膦)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)-辛胺(PAA-辛胺)、聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯-嵌段-聚(乙二醇))(PMAO-PEG)。聚合物的其他实例可以在Ladj R.等，Polymerencapsulation of inorganic nanoparticles for biomedical applications,Intl.J.of Pharm.,2013.458(1):p.230-241中找到，将其完整内容按引用并入本文中。

在进一步的实施方式中，基质的粘附分子可以是影响细胞对材料的附着、细胞活力、细胞增殖、细胞存活、生长和/或细胞分化的粘附分子。例如，粘附分子可以是粘附肽，如RGDS(SEQ ID NO:1)、YIGSR(SEQ ID NO:2)、IKVAV(SEQ ID NO:3)、REDV(SEQ ID NO:4)、GKKQRFRHRNRKG(SEQ ID NO:5)、RNIAEIIKDI(SEQ ID NO:6)、KTRWYSMKKTTMKIIPFNR(SEQ IDNO:7)，或其任意组合。另外或可选地，粘附分子可以是部分或全长蛋白质，如，例如，I型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、变性胶原蛋白(也称为明胶)、IV型胶原蛋白、

(Corning Life Sciences，Bedford，MA)、聚L-赖氨酸(PLL)、聚D-赖氨酸(PDL)或其任意组合。与细胞表面受体(例如，CD3和CD28)结合的抗体和/或小分子(例如非肽小分子，如stemregulin或reversine)，例如激活细胞的分化程序以增强粘附的小分子，也可以是包括在用于细胞附着的基质上的粘附分子。

在进一步的实施方式中，基质进一步包括生长因子，其可以位于内部区室中，如与聚合物缀合、包埋在水凝胶内和/或位于液体(例如，培养基)内。生长因子可以是，例如，FGF、TGF-β1、VEGF、PDGF-BB、PDGF、IGF1、干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(thrombopoeitin)(TPO)、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、促红细胞生成素、DL-1缺口配体、Wnt、基质衍生因子(SDF)-1、白介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、IL-15R、CD40L、G-CSF、GM-CSF、4-1BB和BMP超家族成员，或其任意组合。

在其他进一步的实施方式中，胶囊的外壳是多孔的，具有例如约10nm至约35nm，或约20nm的孔径。外壳可以进一步包括酶敏感性肽，如蛋白酶敏感性肽，或其他可溶解材料和缀合部分。

在其他进一步的实施方式中，胶囊包括含DNA或含RNA的分子。含DNA或含RNA的分子可以位于内部区室中，如与聚合物缀合、包埋在水凝胶内和/或位于外壳内包含的液体(例如，培养基)中。含DNA或RNA的分子可以是例如cDNA、质粒DNA、可转座DNA(例如，使用睡美人转座子)、病毒载体(例如，腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、Sendai病毒)、修饰的RNA、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、基因编辑分子，如CRISPR/gRNA、锌指核酸酶(例如，TALEN)和大范围核酸酶，以及含有这些分子的脂质囊泡，或其任意组合。

在一些实施方式中，胶囊包括粘附于基质的细胞，如干细胞。所述细胞可以是例如间充质干细胞(MSC)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Madin-Darby犬肾上皮(MDCK)细胞、Vero细胞、胰岛、外周血单核细胞、内皮祖细胞、血纤维细胞、骨髓细胞、T细胞、B细胞、树突细胞、CD34+细胞、NK细胞、单核细胞、肝细胞、神经干细胞、胃肠细胞、皮肤细胞、皮肤细胞祖细胞、癌细胞、杂交瘤细胞、原核细胞、HEK293T包装细胞系、酵母细胞、胰腺前体细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞。可以通过将胶囊的多孔外壳暴露于细胞对细胞进行包封，从而细胞通过孔易位至外壳的内部区室中。或者，细胞可以在胶囊的聚合过程中包封。胶囊可以在内部区室中包括培养基，由此产生包封细胞的悬浮培养物。细胞可以在悬浮培养物中生长和/或扩增。悬浮培养物可以是搅拌罐悬浮培养物。在完成细胞培养或储存过程后，胶囊的外壳可以降解并收获细胞。

在另一个实施方式中，本发明涉及包括第一和第二组合物的细胞培养试剂盒。第一组合物包含聚合物前体材料和粘附肽。第二组合物包含用于将聚合物前体材料聚合以形成具有外壳的胶囊的试剂，所述外壳包含由前体材料的聚合产生的聚合物和粘附肽。粘附肽存在于外壳的内表面上。第一组合物可以任选地进一步包括生长因子和/或蛋白酶敏感性肽。第二组合物可以任选地进一步包括用于在外壳的内部区室内形成水凝胶的交联试剂。第一组合物可以是冻干的。

在另一个实施方式中，本发明涉及用于生产包封细胞的系统，其包括第一和第二组合物。所述系统包括泵送设备、管道套件、指定光源和液体处理/收集袋。第一组合物包含聚合物前体材料和一个或多个与聚合物缀合的基质。第二组合物包含用于将聚合物前体材料聚合以形成具有外壳的胶囊的试剂，所述外壳包括由前体材料的聚合产生的聚合物和缀合的基质。基质存在于外壳的内表面上。第一组合物可以任选地包含生长因子、含DNA/RNA结构和/或蛋白酶敏感性肽。第二组合物可以任选地进一步包括用于在外壳的内部区室内形成水凝胶的交联试剂。第一组合物可以是冻干的。

附图说明

通过以下对示例实施方式(如附图所示)的更具体描述，前述内容将显而易见，在附图中，贯穿不同的视图，相似的附图标记指代相同的部分。附图不一定按比例绘制，而是将重点放在阐明实施方式上。

图1是现有技术的微载体的图解，以横截面显示。

图2A是本发明的胶囊实例的图解，其中细胞沿着胶囊外壳的内表面粘附。

图2B是本发明另一个胶囊实例的图解，其中外壳包括蛋白酶敏感性肽。

图2C是本发明的胶囊实例的图解，其中细胞包埋在胶囊的水凝胶核心中或粘附于胶囊的水凝胶核心。

图2D是本发明另一个胶囊实例的图解，其中水凝胶核心包括共价结合的生长因子(GF)。

图2E是本发明再另一个胶囊实例的图解，其中水凝胶核心包括可溶性生长因子(GF)。

图2F是本发明另一个胶囊实例的图解，其中胶囊包括粘附肽、蛋白酶敏感性肽、生长因子(GF)和与聚乙二醇(PEG)链结合的细胞。

图3A显示了在静态条件(0rpm)下培养的合成聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)胶囊。

图3B显示了在常规速度(60rpm)搅拌下培养的合成聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)胶囊。

图3C显示了在高速(250rpm)搅拌下培养的合成聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)胶囊。

图4A显示了包封在合成的PEGDA微载体中的间充质干细胞(MSC)。显示了活细胞(绿色，粗箭头)和死细胞(红色，细箭头)，使用200μm标尺。

图4B是针对两个批次的包封细胞，细胞数相对培养时间的图表，每个批次具有不同的输入细胞浓度。

图5是针对评估粘附肽RGDS的缀合效率中未反应游离胺的检测，吸光度相对甘氨酸浓度的图表。

图6显示了动态旋转瓶培养的第3天时取样的若丹明鬼笔环肽(红色)和DAPI(蓝色)染色的包封MSC。

图7是针对静态培养下评估的具有细胞加载的液体核心(LC)或聚合的核心(PC)的胶囊，细胞数相对培养时间的图表。

图8A显示了高搅拌速度(125rpm)下细胞培养第1天取样的细胞加载聚合核心胶囊中的活细胞(绿色)和死细胞(红色)。

图8B显示了第6天取样的图8A的胶囊。

图8C显示了第10天取样的图8A和8B的胶囊。

图8D是针对图8A-8C的胶囊，细胞数相对天数的图表。

图9A显示了低搅拌速度(30rpm)下细胞培养第1天取样的细胞加载的聚合核心胶囊中的活细胞(绿色)和死细胞(红色)。

图9B显示了第3天取样的图9A的胶囊。

图9C显示了第6天取样的图9A和9B的胶囊。

图9D是针对图9A-9C的胶囊，细胞数相对天数的图表。

图10A是聚合核心(PC)胶囊数量相对胶囊直径的图表。

图10B是图10A的PC胶囊的表面积相对胶囊直径的图表。

图10C是图10A-10B的PC胶囊的体积相对胶囊直径的图表。

图11A是液体核心(LC)胶囊的数量相对胶囊直径的图表。

图11B是图11A的LC胶囊的表面积相对胶囊直径的图表。

图11C是图11A-11B的PC胶囊的体积相对胶囊直径的图表。

图12A显示了暴露于胶原蛋白酶之前的可降解胶囊。

图12B显示了暴露于胶原蛋白酶后三小时的图12A的可降解胶囊。

图12C显示了暴露于胶原蛋白酶过夜后图12A和12B的可降解胶囊。

图12D显示了图12A-12C的胶囊的降解。

图13A显示了暴露于胶原蛋白酶之前细胞加载的可降解胶囊。

图13B显示了通过吸移机械搅拌后图13A的胶囊的降解。

图14A显示了第1天取样的具有高粘合剂浓度的若丹明鬼笔环肽和DAPI染色的包封MSC。

图14B显示了第7天取样的具有高粘合剂浓度的若丹明鬼笔环肽和DAPI染色的包封MSC。

图14C显示了第14天取样的具有高粘合剂浓度的若丹明鬼笔环肽和DAPI染色的包封MSC。

图14D显示了第1天取样的具有低粘合剂浓度的若丹明鬼笔环肽和DAPI染色的包封MSC。

图14E显示了第7天取样的具有低粘合剂浓度的若丹明鬼笔环肽和DAPI染色的包封MSC。

图14F显示了第14天取样的具有低粘合剂浓度的若丹明鬼笔环肽和DAPI染色的包封MSC。

图14G显示了第1天取样的无粘合剂的若丹明鬼笔环肽和DAPI染色的包封MSC。

图14H显示了第7天取样的无粘合剂的若丹明鬼笔环肽和DAPI染色的包封MSC。

图14I显示了第14天取样的无粘合剂的若丹明鬼笔环肽和DAPI染色的包封MSC。

图15A显示了在细胞培养第1天取样的具有0mM PEG-RGDS的胶囊中钙黄绿素乙酰氧基甲基和乙锭同型二聚物1染色的MSC。

图15B显示了在细胞培养第1天取样的具有5mM PEG-RGDS的胶囊中钙黄绿素乙酰氧基甲基和乙锭同型二聚物1染色的MSC。

图15C显示了在细胞培养第1天取样的具有10mM PEG-RGDS的胶囊中钙黄绿素乙酰氧基甲基和乙锭同型二聚物1染色的MSC。

图15D显示了在细胞培养第1天取样的具有0mM PEG-RGDS和PEG-FGF的胶囊中钙黄绿素乙酰氧基甲基和乙锭同型二聚物1染色的MSC。

图15E显示了在细胞培养第1天取样的具有5mM PEG-RGDS和PEG-FGF的胶囊中钙黄绿素乙酰氧基甲基和乙锭同型二聚物1染色的MSC。

图15F显示了在细胞培养第1天取样的具有10mM PEG-RGDS和PEG-FGF的胶囊中钙黄绿素乙酰氧基甲基和乙锭同型二聚物1染色的MSC。

图16A显示了从具有0mM PEG-RGDS的胶囊收获后钙黄绿素乙酰氧基甲基和乙锭同型二聚物1染色的细胞。

图16B显示了从具有5mM PEG-RGDS的胶囊收获后钙黄绿素乙酰氧基甲基和乙锭同型二聚物1染色的细胞。

图16C显示了从具有10mM PEG-RGDS的胶囊收获后钙黄绿素乙酰氧基甲基和乙锭同型二聚物1染色的细胞。

图17A显示了在细胞培养基中平衡后一小时的常规微载体。

图17B显示了在静态条件下与MSC孵育后24小时的图17A的微载体。

图17C显示了在70rpm下旋转烧瓶中动态培养后48小时的图17B的微载体和MSC。

图18是高搅拌培养下的细胞活力的图。

图19A显示了在第1天取样的无缀合的RGDS的合成PEGDA胶囊中包封的MSC。

图19B显示了在第1天取样的具有10mM缀合的RGDS的合成PEGDA胶囊中包封的MSC。

图19C显示了在第7天取样的无缀合的RGDS的合成PEGDA胶囊中包封的MSC。

图19D显示了在第7天取样的具有10mM缀合的RGDS的合成PEGDA胶囊中包封的MSC。

图19E显示了在第14天取样的无缀合的RGDS的合成PEGDA胶囊中包封的MSC。

图19F显示了在第14天取样的具有10mM缀合的RGDS的合成PEGDA胶囊中包封的MSC。

图20A显示了在第1天取样的具有10mM RGDS和无生长因子bFGF的PEGDA胶囊中的MSC。

图20B显示了在第1天取样的具有10mM RGDS和0.25μg/L生长因子bFGF的PEGDA胶囊中的MSC。

图20C显示了在第1天取样的具有10mM RGDS和25μg/L生长因子bFGF的PEGDA胶囊中的MSC。

图20D显示了在第7天取样的具有10mM RGDS和无生长因子bFGF的PEGDA胶囊中的MSC。

图20E显示了在第7天取样的具有10mM RGDS和0.25μg/L生长因子bFGF的PEGDA胶囊中的MSC。

图20F显示了在第7天取样的具有10mM RGDS和25μg/L生长因子bFGF的PEGDA胶囊中的MSC。

图20G显示了在第14天取样的具有10mM RGDS和无生长因子bFGF的PEGDA胶囊中的MSC。

图20H显示了在第14天取样的具有10mM RGDS和0.25μg/L生长因子bFGF的PEGDA胶囊中的MSC。

图20I显示了在第14天取样的具有10mM RGDS和25μg/L生长因子bFGF的PEGDA胶囊中的MSC。

图21A显示了在第1天取样的具有10mM RGDS和25μg/L生长因子bFGF的不可降解PEGDA胶囊中的MSC。

图21B显示了在第1天取样的具有10mM RGDS和25μg/L生长因子bFGF的可降解PEGPQ胶囊中的MSC。

图21C显示了在第7天取样的具有10mM RGDS和25μg/L生长因子bFGF的不可降解PEGDA胶囊中的MSC。

图21D显示了在第7天取样的具有10mM RGDS和25μg/L生长因子bFGF的可降解PEGPQ胶囊中的MSC。

图21E显示了在第14天取样的具有10mM RGDS和25μg/L生长因子bFGF的不可降解PEGDA胶囊中的MSC。

图21F显示了在第14天取样的具有10mM RGDS和25μg/L生长因子bFGF的可降解PEGPQ胶囊中的MSC。

图22A显示了在第1天取样的无RGDS的PEGDA胶囊中的AtT-20细胞。

图22B显示了在第1天取样的无RGDS的PEGDA胶囊中的3T3细胞。

图22C显示了在第1天取样的无RGDS的PEGDA胶囊中的JURKAT细胞。

图22D显示了在第7天取样的无RGDS的PEGDA胶囊中的3T3细胞。

图22E显示了在第7天取样的无RGDS的PEGDA胶囊中的JURKAT细胞。

图22F显示了在第14天取样的无RGDS的PEGDA胶囊中的3T3细胞。

图22G显示了在第14天取样的无RGDS的PEGDA胶囊中的JURKAT细胞。

图23A是用10μg/mL:100ng/mL比率的可溶性PHA/IL-2刺激的并在可降解PEG胶囊中包封的PBMC的细胞计数vs.羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)信号的图表。在刺激后第4天从胶囊收获细胞。

图23B是用50ng/mL:50ng/mL比率的可溶性CD3/CD28刺激的并在可降解PEG胶囊中包封的PBMC的细胞计数vs.CFSE信号的图表。在刺激后第4天从胶囊收获细胞。

图23C是用50ng/mL:50ng/mL的PEG化CD3/CD28刺激的并在可降解PEG胶囊中包封的PBMC的细胞计数vs.CFSE信号的图表。在刺激后第4天从胶囊收获细胞。

图24是细胞计数设备和方法的示意图。

图25是说明了生产胶囊的方法的示意图。

图26是说明将慢病毒与PEG缀合用于原位细胞工程的方法的示意图。

图27是说明使PEG可降解的方法的示意图。

图28是说明分子视图(molecular view)中交联和包封方法的示意图。

图29是说明了整体视图(bulk view)中交联和包封方法的示意图。

图30显示了慢病毒(LV)颗粒缀合并包封的HEK293细胞。这个图像中的RFP(红色荧光蛋白)对应于激发时发出红色荧光(如基因在目标细胞中时)的荧光团，证实了HEK239细胞用目标基因的慢病毒转导的存在以及目标基因整合至宿主HEK293细胞基因组中。图像中的GFP(绿色荧光蛋白)对应于活细胞，来自钙黄绿素AM染色的GFP，其是用于测定细胞活力的染料，因为其容易渗透完整的活细胞。

具体实施方式

以下是示例实施方式的描述。

本发明的方法和系统提供了可以用于粘附细胞的扩增和/或储存的包封细胞培养系统。这样的包封细胞培养系统和方法提供了几个优于现有技术微载体的优势。

如图1中所示的，现有技术的微载体用于细胞附着于载体外侧，这将粘附的细胞暴露于悬浮培养中的流体剪切应力。这样的暴露可以导致细胞从微载体脱离和细胞损伤。细胞质量对于许多生物处理应用是重要的，然而其对于涉及用于细胞疗法的细胞的生长和收获的应用特别重要。对于这样的应用，细胞是生物处理完成时待收集的治疗剂/药剂，这与例如其中细胞是用于蛋白质生产的来源并且在生物处理后丢弃的应用相反。

现有技术的微载体尽管对于大规模生物处理应用提供了优于2D细胞培养的若干优势，但其具有几个缺陷，并且对于其使用存在多种挑战，如表1中关于例如间充质干细胞(MSC)所总结的。MSC是粘附细胞类型的实例，其生物处理将得益于本发明的方法和系统。然而，应当理解关于其他细胞类型可以进行相同或相似的比较，并且本发明的方法和系统提供或包括各种不同细胞类型的培养和/或储存，如进一步所描述的。可以输入具有粘附群体的胶囊中的其他细胞类型的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Madin-Darby犬肾上皮(MDCK)细胞、Hela细胞、PC9细胞、Vero细胞、胰岛、外周血单核细胞、内皮祖细胞、血纤维细胞、骨髓、T细胞、B细胞、树突细胞、NK细胞、单核细胞、CD34+细胞、iPSC细胞、EPC细胞、肝细胞、神经干细胞、胃肠细胞、皮肤细胞和祖细胞、癌细胞、杂交瘤细胞、微生物、HEK293T包装细胞系、酵母细胞、胰腺前体细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

表1.目前与微载体整合至MSC制造中相关的挑战。

在悬浮培养中，流体剪切有利地防止载体沉降和细胞聚集，同时确保细胞培养物的同质性；然而，剪切应力影响细胞的活力和形态，并可以对细胞代谢和分化状态具有调节作用[29]。此外，由于微载体与微载体或微载体与叶轮(或探针/插入物)的碰撞，搅拌引起的剪切应力导致细胞损伤。这种损伤随着微载体尺寸、浓度和搅拌强度的提高而增加，导致对扩大规模的限制[30]。较小的微载体可以减少剪切诱导的细胞死亡并提高生长速率；然而，减小微载体的大小同样会减少用于细胞附着和扩增的可用表面积。最小搅拌速率根据Zwietering得出的经验相关性估计[101]，其表明微载体不应在容器底部保留超过1-2秒。考虑到Kolmogorov模型[102]，搅拌罐生物反应器微载体培养中的湍流涡旋在细胞和微载体之间处于中等大小。Kolmogorov涡流的大小随着搅拌速度的增加而减小。由于这些涡流与微载体表面相互作用而导致的高局部能量耗散速率可导致剪切速率大到足以损伤细胞或甚至从微载体表面去除细胞。此外，通气引起的泡沫形成在大规模培养中导致流体动力学应力，这对于微载体表面上的细胞生长是有害的[13，31]。在细胞水平上，暴露于刚性微载体珠和剪切流体流动模式可能会对细胞活力和机械转导产生重大影响，最终影响培养细胞的质量。

开始尝试转向保护细胞免受使用微载体技术扩大的剪切力的影响；已经开发了多孔载体，如

(Sigma Aldrich，UK)，其屏蔽细胞免受剪切诱导的损害，并通过细胞定植在载体的孔中允许更高的细胞生长[32-34]。尽管是可行的解决方案，但Gupta等[35]确认的另一个重要问题是在高于25rpm下搅拌

3微载体培养物(GEHealthcare，Marlborough，MA)导致载体破裂。因此，使用软载体，如

1/3(GEHealthcare，Marlborough，MA)，对于其中需要细胞不含任何残留微载体或亚颗粒的体内应用会产生安全隐患。目前的细胞收获方法涉及使用细胞过滤器以将扩增的细胞与其载体分离；然而，破裂的产品很难去除。这些载体杂质持续令人关注，并且是微载体上培养的细胞治疗剂的临床应用的主要障碍。

本发明的方法和系统提供了目前可用的微载体的替代方案，其可以规避一种或多种上述缺陷，如，例如，通过促进最终细胞产物的活力和纯度的提高。

在一个实施方式中，本发明涉及一种用于生长或储存细胞的胶囊，其包括限定内部区室的外壳和位于内部区室内的用于细胞附着的基质。基质包含聚合物和一个或多个粘附分子。粘附分子，也称为粘性缀合物，可以是例如粘附肽、粘附蛋白或能够将细胞附着于基质和/或激活粘附的分化模式的小分子。例如，粘性缀合物可以是蛋白质(例如，部分或全长蛋白质)，如I型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、IV型胶原蛋白，基质胶或其任何组合。粘性缀合物也可以是与细胞表面受体(如T细胞受体)结合的抗体。例如，抗体可以是结合CD3、CD28和CD40中的至少一种的抗体。粘性缀合物也可以是或包括非肽小分子或非甾体抗炎分子，所述非肽小分子激活细胞中的分化程序以增强粘附，如stemregulin或reversine。

胶囊的实例显示于图2A-2E中。用于细胞附着的基质可以是例如外壳的内表面，如图2A-2B中所示的，使得细胞沿着胶囊的内圆周附着于胶囊上。可选地或另外地，用于细胞附着的基质可以是沉积在胶囊内部区室内的水凝胶，如图2C-2E中所示的。

细胞(如MSC)的包封保护细胞免受机械搅拌和剪切应力的影响，同时胶囊的内部提供了细胞可以粘附于其上的表面区域和细胞可以在其中扩增为细胞簇的空间。在一些实施方式中，外壳包含天然或合成的聚合物。聚合物可以是，例如，聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、海藻酸盐、壳聚糖、与海藻酸盐或壳聚糖共聚的PEG以及与海藻酸盐或壳聚糖共聚的PEGDA，或其组合。其他聚合物包括PLGA、PLL、PDMS、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱]-嵌段-(甘油单甲基丙烯酸酯)(PMPC-PGMA)、χ-乙炔-聚(叔-丁基丙烯酸酯)(PtBA)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(二乙烯基苯-共-缩水甘油基甲基丙烯酸酯)(P(DVB-GMA))、聚(酰胺胺)(PAMAM)、聚(D-葡糖酰胺亚乙基甲基丙烯酸酯)(PGAMA)、聚(2-乳酸生物酰胺基乙基甲基丙烯酸酯)(PLAMA)、烷基硫醚末端功能化的聚(甲基丙烯酸)(PMAA-DDT)、聚(乙二醇)-膦(PEG-膦)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)-辛胺(PAA-辛胺)、聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯-嵌段-聚(乙二醇))(PMAO-PEG)。

关于用于细胞包封的材料，已经在啮齿动物模型中研究了几种天然和合成的聚合物；其中海藻酸盐和聚乙二醇(PEG)进行到了临床前和临床试验。海藻酸盐提供了有利的胶凝条件；然而，存在批次与批次之间的变异性、宽的孔径分布、包封的产品尺寸(例如，植入体积)和可扩展性相关的挑战[10，11]。PEG已被用于胰岛上的保形涂层，因为它可以与胰岛表面上的胶原蛋白和膜蛋白中的胺基反应[23-25]，其优点是氧气、营养物和胰岛素的较短扩散距离，并且较小的植入位点。此外，PEG可以用肽和生长因子功能化以刺激胰岛素基因转录、防止β细胞凋亡并促进胰岛血管生成[31-33]。

用于生产包封细胞的方法和先导材料(lead material)的比较显示于表2中。尽管提供了海藻酸盐和PEG作为实例，但能够聚合的其他材料可以潜在地与本文所述的包封方法或其他已知的包封方法结合用于聚合物基质组分。例如，一种以高通量方式产生小的单分散胶囊的方法包括在先导材料挤出过程中射流的脉动或喷嘴的振动，这通常被称为层流射流破碎技术。层流射流破碎技术涉及轴对称扰动以将来自喷嘴的射流破碎成大小相等的液滴。该技术可以实现高达每秒104个颗粒的生产率[22]。振动频率、喷嘴直径、粘度和聚合物-细胞悬浮液的流速控制微胶囊的大小和生产率。在另一个实例中，旋转盘或射流切割方法可用于生产小的单分散胶囊。射流切割可以提供更高的生产率用于以10,000Hz的频率或每秒104个颗粒用包封材料生成颗粒，这意味着60mL/min的500μm微珠通量[22]。

其他方法包括乳化技术，与挤出滴注方法相比，其不受规模限制。使用乳化技术，生产率由其中发生细胞包封的容器大小来控制。与可商购的微载体所需的两步程序相比，乳化技术还提供了在单一步骤中产生细胞加载的微载体的能力。适当的分散装置和操作条件，如混合速率和表面活性剂，可以允许减小胶囊的尺寸。

表2.先导材料候选物与产生包封细胞的高通量方法的整合。

在进一步的实施方式中，除了聚合物外壳，胶囊可以进一步包括水凝胶核心，如例如图2D-2F中所示的。水凝胶核心可以包含例如交联的聚乙二醇(PEG)、交联的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)或其组合。

聚合物外壳和/或水凝胶核心可以用允许细胞附着和/或在胶囊内分散的一种或多种粘附肽来功能化。粘附肽可以是例如RGDS(SEQ ID NO:1)、YIGSR(SEQ ID NO:2)、IKVAV(SEQ ID NO:3)、REDV(SEQ ID NO:4)、GKKQRFRHRNRKG(SEQ ID NO:5)、RNIAEIIKDI(SEQ IDNO:6)、KTRWYSMKKTTMKIIPFNR(SEQ ID NO:7)或其任意组合。粘附肽可以是影响细胞活力、增殖、存活、生长和/或分化的肽。

例如，PEG可以通过在预定摩尔比的碳酸氢钠溶液(例如，50mM，pH 8.5)中使丙烯酸酯-PEG-SVA与粘附肽反应过夜，接着渗析以除去任何未反应的肽来进行化学修饰，从而包括一个或多个粘附肽。修饰的聚合物材料可以任选地冻干并储存。可以通过用茚三酮测定检测任何未反应的游离胺来评估粘附肽缀合效率。可以基于所需的应用来确定可接受的缀合效率。例如，约85％或更高的缀合效率可以认为是可接受的。粘附肽、蛋白质衍生物和所得到的PEG化产物的实例显示于表3中。

表3.用于PEG化的候选粘附肽

缀合的粘附肽(例如，PEG缀合的粘附肽，或丙烯基-PEG-AP)可以与细胞悬浮液(例如，MSC悬浮液)组合，接着经历光聚合过程(例如，通过添加到光可聚合的PEG二丙烯酸酯(PEGDA)并发生自由基聚合)以形成细胞加载的PEG胶囊。可以在前体溶液中改变丙烯基-PEG-AP的浓度和组合以优化细胞附着。例如，可以通过组合10mM HEPES缓冲盐水(pH 7.4)中的0.1g/mL 10kDa PEGDA和10±5mM丙烯基-PEG-AP与光引发剂1.5％v/v三乙醇胺(TEOA)、37mM 1-乙烯基-2-吡咯烷酮(NVP)和10μM曙红Y二钠盐来形成水凝胶。随后可以通过过滤，如通过0.2μm过滤器，对溶液除菌。通过合并前体溶液中的细胞(例如，MSC)，细胞可以在光聚合和胶囊形成过程中包封。在示例程序中，可以在矿物油(3μL/mL)中组合1-乙烯基-2-吡咯烷酮(300mg/mL)中含2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的疏水性光引发剂溶液，向其中加入细胞-预聚物溶液。随后将合并的溶液在环境光下涡旋4秒钟，接着在白光下再涡旋3秒钟。随后可以停止涡旋，并将乳液暴露于白光20秒，具有10秒时的涡旋脉冲。随后可以通过在300g下离心5分钟来分离交联的微球，重悬浮于培养基中，并置于

(Corning，Tewksbury，MA)细胞培养插入物中。

可以使用荧光染料进行包封细胞和聚合物外壳/水凝胶核心的形态学评估。在评估程序的实例中，可以拍摄图像以验证细胞与周围水凝胶基质的相互作用。可以分析包封MSC的肌动蛋白组织化以验证生物活性。包封时，MSC可以沿着PEG胶囊的内膜附着，从而锚定到PEG化的粘附部分上。可以将细胞加载的胶囊(或者称为微胶囊)在4％甲醛溶液中固定，使用1％Triton X-100溶液渗透，然后在4单位/ml鬼笔环肽若丹明溶液中孵育30min，并装载在含有荧光染料(如DAPI)的封固溶液中。可以通过例如光学显微镜和荧光显微镜，如在配备有ApoTome系统(Zeiss，Jena，德国)的Axio Observer Z1(Zeiss，Jena，德国)上，监测细胞粘附和扩散以实现光学切片。粘附肽的选择可以通过对例如100张随机细胞胶囊图片进行半定量分析(每个肽N＝3批次)，以与没有肽的对照相比定量纺锤体形成来进行。可以根据所需应用确定可接受的附着效率。例如，至少约60％的附着效率可以被认为是可接受的。或者，可以基于其他因素选择所需的粘附肽。例如，可能希望包括RGDS，因为对于指导细胞与生物材料的结合，RGDS得到了充分表征[76-78]。

尽管描述了通过光聚合含有细胞的前体溶液来形成包封细胞的实例，但细胞包封的其他方法也是可能的。例如，胶囊可以包括多孔外壳和/或多孔水凝胶核心。随后可以将多孔胶囊暴露于细胞悬浮液，使得细胞易位至外壳的内部区室中并粘附于基质。

在一个实施方式中，胶囊包括具有约10nm至约35nm(例如，0.9nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、35.5nm)或约20nm孔径的多孔外壳。

具有约10nm或更大，或约20nm或更大孔径的胶囊还可以允许营养物质和废产物扩散到胶囊中或胶囊外。可以通过改变用于形成水凝胶网的聚合物前体材料的重量来调节孔径，所述水凝胶网形成胶囊的外壳和/或水凝胶核心。例如，具有5kDA重量的PEG-SVA可以用于形成孔径大于由10kDa PEG-SVA制得的水凝胶网的孔径的水凝胶网。

在另一个实施方式中，胶囊可以包括一种或多种生长因子。包括生长因子可以进一步增强胶囊内的细胞生长和/或增殖。所述一种或多种生长因子可以与聚合物(例如，聚合物外壳、水凝胶核心或两者)缀合。或者，生长因子在胶囊的液体核心或水凝胶核心内是可溶的。合适的生长因子的实例包括FGF、TGF-β1、VEGF、PDGF-BB、PDGF、IGF1和BMP超家族成员，或其任意组合。

生长因子(GF)是一些体外细胞培养所需的并且通常作为可溶性GF添加至培养基中。本发明的胶囊可以有利地提供浓缩的、瞬时的、受控的生物活性GF供应并降低对通常用作培养细胞的生长剂的血清成分的需要。例如，PEG化的GF可以包括在胶囊的外壳和/或核心中。PEG化的GF的实例，包括FGF、TGF-β1[79][80]、IGF1[81]和BMP[82][83]，显示于表4中。

表4.生长因子PEG化。

在示例程序中，可以通过在50mM碳酸氢钠(pH 8.5)中以1:15(肽:PEG)摩尔比与丙烯酸酯-PEG-SVA反应将重组GF与PEG缀合，并随后在氩气下搅拌过夜，冻干和储存在-80℃下。可以使用Western印迹来分析所得到的丙烯基-PEG-GF。可以在4-15％SDS-PAGE凝胶上分离可溶性和PEG缀合的GF，并转移至硝基纤维素膜。可以将膜在TBS中含有0.1％(vol/vol)Tween 20的缓冲液(TBST)中用5％乳在4℃下孵育过夜。膜可以用兔抗GF在室温下孵育1h。用TBST洗涤两次后，可以加入过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和在室温下孵育1h，并用皮克-化学发光试剂处理用于检测。可以评估PEG-GF缀合物的生物活性以验证生物活性没有受到缀合过程或由于位阻导致的影响。PEG-GF缀合物可以在一定范围的GF浓度(例如，1μg/L，2.5μg/L或5μg/L)下在胶囊中评估。可以在(i)未修饰的或可溶性的GF和(ii)PEG缀合的GF的存在下测量细胞生长，以确定缀合的GF对于应用的适合性。例如，PEG-GF vs PEG的50％生长优势可能是理想的PEG-GF vs PEG的可接受生长优势。可以将MSC以5000细胞/胶囊的估算密度接种于12-孔平板中，并在37℃/5％CO₂环境中孵育7天用于生长促进测定。7天后，可以通过成像和MTS测定定量细胞胶囊以评估细胞生长。在包含PEG-GF的胶囊中可能不需要对细胞培养基另外补充GF。

如上所述，从现有技术的微胶囊纯化细胞可能是具有挑战性的，常常导致产品具有残留的微载体和亚颗粒存在。为了解决这个缺陷，PEG水凝胶可以包括可蛋白水解降解的肽序列以控制水凝胶生物降解。在一个实施方式中，本发明的胶囊包括酶敏感性肽，如蛋白酶敏感性肽(例如，GGGPQG↓IWGQGK(SEQ ID NO:8)，GGL↓GPAGGK，GGG↓LGPAGGK(SEQ ID NO:9)。酶敏感性肽可以包括在胶囊的外壳中和/或水凝胶核心中。完成细胞扩增过程后，可以使得胶囊材料降解，并且随后可以使用标准细胞浓缩方法来纯化细胞材料。所用的酶的一些实例是胰蛋白酶、胶原蛋白酶、DNase、RNase和辣根过氧化物酶。其他敏感性结构可以掺入胶囊中其赋予温度敏感性、光敏感性或小分子敏感性以及基于蛋白质的敏感性。例如，可降解PEG水凝胶构建体中的PEG化GF的共价整体固定可以提供受控的GF瞬时局部释放以刺激MSC生长和扩增，同时还提供了胶囊降解。可降解PEG的实例显示于表5中。

表5.可降解的PEG

例如，可以通过胶原蛋白酶敏感性肽序列(如GGGPQG↓IWGQGK(SEQ ID NO:8)，(PQ))的共价并入使水凝胶成为可降解的，其中↓表示亮氨酸和甘氨酸残基之间的胶原蛋白酶的切割点。可以在丙烯酸酯基团之间并入单一和多位点PQ结构域。用于形成可降解胶囊的示例程序如下。对于单一结构域，可以将PQ肽溶解于50mM NaHCO₃(pH 8.0)中，并以1:2(PQ:PEG-SVA)摩尔比与PEG-SVA(MW＝3400Da)在室温下反应过夜以在肽序列的两端上连接PEG(PEG-PQ-PEG)。所得到的产物，丙烯酸酯-PEG-肽-PEG-丙烯酸酯可以进行渗析、冻干和冷冻储存在-20℃氩气下。对于多结构域PQ缀合，可以将肽与丙烯基-PEG-SVA以等摩尔比反应，随后渗析并冻干以除去不需要的产物。这种丙烯基-PEG-肽可以进一步与SVA-PEG-SVA(MW 3400Da)反应，渗析并冻干。反应步骤可以重复以添加另外的PEG-肽。在最终步骤中，之前的产物可以与丙烯基-PEG-SVA反应，以形成多位点PQ可降解PEGDA大单体(macromer)。最终产物丙烯酸酯-(PEG-肽)₃-PEG-丙烯酸酯可以渗析、冻干并储存在-20℃下。

可以评价胶原蛋白酶敏感性PEG水凝胶内MSC侵入的速率，以确定局部接近GF的可降解基质内微胶囊对MSC扩增的有益性。可以通过例如允许微胶囊在具有1mM CaCl₂的PBS中在37℃下溶胀24hr来测定水凝胶降解动力学。随后可以将微胶囊在具有1mM CaCl₂的PBS中用来自溶组织梭菌(Clostridium hystolyticum)的胶原蛋白酶在37、33或25℃下孵育。可以测量微胶囊的湿重随时间的变化。可以确定就酶浓度、时间、温度和中和而言的降解条件。

本发明的方法和系统中还可以包括非酶促的聚合物降解方法。例如，可以将PEG区段并入酪氨酸衍生的聚碳酸酯中，如Kohn等所描述的[84-86]，和/或硫醇功能化的PEG大单体可以用于提供响应于还原性微环境的可降解性，如在谷胱甘肽的存在下[87]。这种降解可以通过硫醇-二硫化物交换反应发生。这种反应将聚合物片段化成可溶性单元[103]。因此，通过使用4-臂PEG或PEG四丙烯酸酯(PEGTA)来制备微胶囊，其中每条臂用硫醇基团封端[104]以形成PEG-二酯-二硫醇交联剂。二硫键的存在允许在谷胱甘肽存在下的水凝胶降解。或者，还可以通过在三乙醇胺(TEA)中将PEGTA与二硫代苏糖醇(DTT)以1:1的丙烯酸酯与硫醇的摩尔比反应，并允许在37℃下胶凝来制备水溶性PEG微胶囊[105，106]。胶囊的降解由于水分解水解不稳定性酯键随时间发生，其中降解动力学取决于反应[105]。为了连接肽，如细胞粘附配体，4-臂-PEG-乙烯基砜(PEG-VS)溶解于TEA缓冲液中，并且半胱氨酸封端的肽以较大的化学计量不足添加至VS基团以共价连接于VS[106][107]。

除了可溶性因子(如生长因子)和生物化学因素(cue)(包括粘附肽)，细胞还可能受到物理和机械因素的影响，如基质的表面拓扑结构和刚性/硬度。胶囊可以进一步优化以具有在细胞扩增过程中保持多能性的模量。

优化细胞粘附肽的空间组织和基质的机械硬度的理由是这样的特征可以在调节多能性细胞功能中发挥重要作用[88-90]。对于微载体，如硬度和曲率的特性影响细胞活性，同时通过改变对生物反应器中细胞的剪切应力，粘附的细胞在生物反应器中培养[91]。迄今为止，在定义微载体特性和几何形状对控制多能性细胞功能的作用方面所做的努力有限[92，93]。MSC细胞命运的调控取决于基质刚性(其调节MSC的细胞外基质(ECM))、粘附肽(例如，整联蛋白)和细胞骨架相互作用。无法控制这些特性可导致不希望的MSC分化和免疫调节效力的丧失。

本发明胶囊的基质的模量可以是可调节的。例如，可以调节前体溶液中的聚合物分子量和浓度以提供较软/较硬的基质。在一个实例中，可将3400Da PEG-SVA和10％10kDaPEGDA用于微胶囊形成。可以分析细胞附着和扩散，并且如果基质对于细胞附着而言太“软”，则可以降低聚合物重量。可以利用几种分子量的PEGDA(例如，3.4kDa和5kDa)，并且可以改变浓度(例如，10％或15％)以使底物模量适于未来目的的细胞培养和反应器条件。为了确定基质的硬度是否合适，可以追踪使用微胶囊的细胞增殖14天，并通过MTS分析在预定的时间点进行测量。或者，可以基于其他因素来选择聚合物前体材料的所需重量/浓度。例如，可能期望的是包括10％10kDa PEGDA，因为这种组合可在基质刚性、孔隙度和降解动力学之间提供平衡。

在一些实施方式中，本发明的胶囊包括粘附于基质的细胞，如，例如，干细胞。尽管间充质干细胞(MSC)已经用作可以在本发明的胶囊内包封的粘附细胞的实例，但应当理解可以替换地包括其他粘附细胞。除了MSC外，合适的细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Madin-Darby犬肾上皮(MDCK)细胞、Vero细胞、胰岛、胰腺前体细胞、胚胎干细胞和多能干细胞。胶囊中包含的细胞可以维持在存活状态，如通过维持在悬浮培养中。包封的细胞还可以储存用于之后的用途，如通过进行冷冻保存处理。

细胞计数方法&装置

细胞计数方法和装置的实例显示于图24中。可以用移液管吸出一定量的含有悬浮胶囊的溶液并与磷酸盐缓冲盐水(PBS)混合以形成计数溶液。例如，如所示的，可以使用200μL移液管吸出10μL样品并与10μL PBS混合。吸出的样品可以置于带有硅盖的血细胞计数器中。例如，可以吸出5-6μL样品并置于血细胞计数器中，使得溶液占据血细胞计数器的中间方块。四个外方块可以用于计数，或可以使用中间方块。图中显示为使用中间方块以将胶囊限定在已知尺寸的区域中。

随后可以将样品置于显微镜下，并且计数中间方块内的胶囊。胶囊/mL的总数等于计数的胶囊数乘以稀释因子和乘以10,000胶囊/mL。使用盖玻片可能导致胶囊破裂。可以使用硅酮来代替盖玻片的使用以将溶液保持在适当位置。

使用基于光的聚合的连续流胶囊生产

连续的胶囊生产系统的实例显示于图25中。含有亲水性光引发剂的聚合物溶液与矿物油中的疏水性光引发剂混合。术语亲水性和疏水性用于指定其中存在光引发剂的溶液。矿物油溶液(例如，如所示的，5μL苯乙酮/NVP溶液和1mL矿物油)是疏水性的。PEGDA溶液(例如，如所示的，0.1g PEGDA，15uL TEOA，10uL曙红Y二钠盐，3.75μL NVP，493.025uL HBS溶液和10uL Pluronic酸)是亲水性的。

聚合物溶液可以含有聚合物(例如，PEG)、细胞(例如，NK细胞、MSC、CHO)、粘附肽(例如，RGDS)和任选地其他因子，如生长因子(例如，FGF)、病毒颗粒和降解肽(例如，PQ肽)。

在图25中所示的系统中，PEGDA泵将PEGDA溶液泵送到反射性白光盒(reflecivewhite light box)，同时矿物油泵将具有疏水性光引发剂的矿物油泵送到白光盒。泵和反射性白光盒可以通过管道连接。白光盒连接至照明器。

管道经过白光盒通至用于储存加工的胶囊的容器。例如，随着系统在连续基础的连续系统上加工胶囊，胶囊可以收集在75cm² T烧瓶中。

溶液存在于白光盒中的时间量可以取决于与反射盒一起使用的光源数量、光源类型和反射盒的设置。泵速度可以相应地调节以确保溶液暴露于光适当的时间量。例如，使用图25中所示的系统(具有一个光源)，溶液可以存在于白光盒中大约三分钟。其他配置是可能的，其实例如下：

·矿物油144mL/min和PEDGA 1.3mL/min，3分钟光暴露。

·矿物油144mL/min和PEDGA 1.3mL/min，没有使用光盒，且对于每英寸管道将混合溶液近距离平射(point blank)暴露15秒。

·矿物油96mL/min和PEDGA 1.3mL/min，没有使用光盒，且对于每英寸管道将混合溶液近距离平射暴露15秒。

泵速度也可以影响胶囊尺寸。将两种溶液混合时，矿物油溶液的泵速的提高可以降低PEDGA溶液的大小。这使得可以产生较小的胶囊尺寸。

用于原位细胞工程的慢病毒与PEG的缀合

用于形成包含缀合的慢病毒的胶囊的方法的实例显示于图26-29中。如图26中所示，该方法的第一部分包括慢病毒颗粒与PEG的缀合。例如，可以使用胺交联剂(NHS)反应化学来完成缀合，丙烯酸酯-PEG-SVA(分子量(MW)：3,400)与赖氨酸残基(慢病毒颗粒的病毒衣壳糖蛋白亚基的部分)上的表面暴露的伯胺通过该反应化学反应，由此形成丙烯基-PEG-VP。

例如，所述方法可以包括使用超离心(例如，25,000rpm，4℃下，2小时)将病毒颗粒浓缩，并将颗粒重悬浮于PBS(例如，25mL)中。随后可以将悬浮液与聚合物(例如，溶解于25mL PBS中的10mg PEG-SVA)组合，提供组合溶液(例如，50mL体积的组合溶液)。随后可以将混合物在合适的温度下振摇一段时间(例如，4℃下过夜)。

如图27中进一步所示的，可以使得丙烯基-SVA是可降解的。例如，可以制得单独的聚合物混合物以通过共价并入胶原蛋白酶敏感性肽序列GGGPQG↓IWGQGK(SEQ ID NO:8)，(PQ)使得PEG水凝胶是可降解的。PQ肽与丙烯基-PEG-SVA反应以形成丙烯基-PEG-PQ-PEG-丙烯基。

如图28中进一步所示的，可以使用基于双重光引发剂乳液的技术，例如，如以上相对于图25显示和描述的，来完成聚合物的交联和细胞的包封。暴露于白光和光引发剂可以破坏丙烯基基团双键以形成VP-PEG-丙烯基-PEG-PQ-PEG-丙烯基聚合链。当作为引发剂发挥作用的自由基破坏丙烯酸单体中的两个碳原子之间的双键时，乳化聚合物开始形成，从而开始可以导致单体单元(例如，多达10,000个单体单元)在一起结合以形成聚合物链的反应。

图28中所示过程的整体视图显示于图29中。如所示的，细胞培养物(例如，NK细胞)可以与PEG-PQ、PEG-VP和聚合组分(例如，曙红T、三乙醇胺和1-乙烯基-2吡咯烷酮)混合并暴露于白光。

示例

实施例1.聚乙二醇(PEG)胶囊的机械性质

当前的微载体通常在机械上不耐久，并且已知在生物反应器搅拌过程中会遭受破坏，从而导致例如片段化碎片。聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)胶囊在初步研究中在快速搅拌条件下进行了测试，并评估了视觉完整性。图3A-3C说明了PEGDA胶囊的机械耐久性。PEGDA胶囊通过水-油乳化方法合成，并在静态(图3A)、常规速度(图3B)和高速度(图3C)搅拌条件下培养。图3A-3C的光显微照片显示了即使在超过了培养中使用的传统速度(～75rpm)的高每分钟转数(rpm)下，胶囊也保持其完整性。图3A-3C还显示了不存在胶囊片段碎片。

实施例2.PEG胶囊支持细胞生长

在静态条件下进行了使用非装饰的PEGDA胶囊的初步研究以验证生物材料性质。聚乙二醇(PEG)是具有可调的生物化学和机械性质的多用途聚合物，并且其安全性特征也得到了充分确认。PEG给予了空白状态，其自身排斥蛋白质吸附和随后的细胞-表面相互作用，而且还提供了生物活性配体的增加。因此，PEG提供了形成促进细胞相互作用和粘附的表面而同时抑制非特异性蛋白质吸附和细胞粘附的可能。

MSC通过白光聚合包封在PEGDA中。细胞以两个不同的输入细胞浓度包封到细胞-材料整体混合物。在12天培养过程结束时作为MSC球状体观察通过钙黄绿素乙酰氧基甲基(AM)染色检测的活细胞(图4A)。具体地，使用LIVE/DEAD^TM活力/细胞毒性试剂盒来用钙黄绿素AM检测活细胞(绿色)，并且用溴乙非啶Homodomer1检测死细胞(红色)。

通过Cell Titer

AQueous One Solution细胞增殖测定在12天培养过程中定量包封效率和细胞增殖。结果显示了在不包含生长因子或粘附肽的情况下，在12天时间中胶囊中大约3倍的扩增。如预期的，包封的效率与每个给定的进料材料原液的细胞密度相关。在胶囊材料没有添加任何生长因子或粘附肽的情况下，包封细胞显示出大约2-3天的倍增时间(对于工业化MSC培养，在可接受的范围内)。

实施例3A.RGDS-缀合的PEG胶囊促进细胞附着和扩散

通过将肽与丙烯酸酯-PEG-SVA反应，肽RGDS与PEG成功缀合。通过茚三酮测定检测任何未反应的游离胺来评估粘附肽缀合效率。甘氨酸用作游离胺标准。测定RGDS缀合的PEG(PEG-RGDS)来检测任何未反应的游离胺。获得87％的缀合效率(图5)。在先导研究中MSC包封在具有聚合的中心核心的粘附肽(RGDS)功能化的PEGDA胶囊内，并在动态条件(125rpm)下培养。应当注意，外壳和核心的材料可以相同，并且聚合技术可以形成聚合的外壳或者聚合的外壳和核心(其称为聚合的中心核心)。差异在于交联的程度。在液体核心胶囊中，胶囊的中心核心保持未交联，只有外壳是聚合的。在水凝胶或聚合核心胶囊中，中心核心也是交联的。用若丹明鬼笔环肽和DAPI对第3天取样的细胞加载的胶囊染色以观察包封细胞的肌动蛋白组织化(图6)。具体地，若丹明鬼笔环肽(红色)和DAPI(蓝色)染色的包封MSC的共焦图像在第3天从动态旋转烧瓶培养物取样。图6的图像证明了细胞附着和扩散的初步证据。

实施例3B.使用粘性胶囊的有效细胞附着

进行了更多测试来评估粘合剂的生物活性，其结果显示于图14A-14I中。

MSC包封在粘附肽(RGDS)功能化的PEG胶囊内，并在动态条件(125rpm)下培养。使用5mM(低)和10mM(高)浓度的PEG-RGDS，并通过若丹明鬼笔环肽染色的细胞的共焦显微成像评估细胞扩散和附着。无PEG-RGDS胶囊用作对照。在培养过程结束时的第14天，用10mM(高)粘合剂证明了高细胞扩散。

实施例4A.细胞增殖中生长因子的作用

在静态培养下评估细胞加载的液体核心(LC)和聚合核心(PC)胶囊以研究生长因子(GF)对细胞增殖的作用，其结果显示于图7中。特别地，胶囊用PEG化RGDS形成，并包含PEG化FGF、可溶性GF或无GF的一种。MSC包封在LC或PC胶囊中。在第1、4和6天取样以评估细胞增殖。结果表明包括PEG-FGF的胶囊具有最大的细胞增殖，无论是PEG-FGF位于水凝胶核心中(即，PC胶囊)或在胶囊外壳中(即，LC胶囊)，而PC胶囊中的可溶性FGF将细胞数量维持在包封的接种密度。

实施例4B.在材料中添加生长因子提高了包封后活力

进行了进一步测试来评估具有和没有FGF的胶囊中的MSC活力。测试了不同浓度的PEG化粘附肽RGDS和PEG化的FGF肽，其结果显示于图15A-15F中。

MSC包封在粘附肽(RGDS)和FGF功能化的PEG胶囊内并在动态条件(125rpm)下培养。对于每个0mM、5mM和10mM PEG-RGDS样品，以2.5μg/L添加PEG化的FGF。与无FGF对照的比较证明了在PEG化FGF存在下较高的包封后活力。

含有FGF肽的胶囊显示出比缺少FGF的胶囊更高的第1天包封后活力。

实施例5A.搅拌对细胞活力、增殖和载体完整性的影响

将具有PEG化RGDS和FGF的细胞加载的聚合核心胶囊在旋转烧瓶中暴露于高(125rpm)和低(30rpm)搅拌速度。结果显示于图8A-8D(高搅拌培养物)和9A-9D(低搅拌培养物)中。在第1、3、6和10天取样。在培养阶段结束时，高搅拌培养物导致了包封细胞数量增加大约～18倍，而低搅拌培养物只导致了细胞数量增加3倍。这可能归因于低搅拌下营养物质和废物的低交换效率，而且还突出了高搅拌/剪切对PEG胶囊内包封的细胞是无害的。

实施例5B.高速搅拌培养后的MSC活力

进行了进一步测试来评估在可降解的PEG胶囊中存在生物活性因子PEG-RGDS和PEG-FGF的情况下在旋转烧瓶中高速搅拌培养(125rpm)后的MSC活力。

结果显示于图18中。两种生物活性组分PEG-RGDS和PEG-FGF的存在提供了提高的细胞活力和显著提高的优于可溶性FGF的活力。

实施例6.聚合核心(PC)胶囊的性质

在Coulter Counter上分析PC胶囊以研究载体尺寸分布、表面积和体积。通过作为光聚合的聚合核心而不含粘附肽或GF产生了空的PEGDA胶囊。在70um-250um的可接受且预期的直径限度内产生了不均匀尺寸分布的胶囊。如此产生的胶囊的平均体积和表面积对于PC分别为3×10⁷um³和1.5×10⁶um²，和对于LC分别为7.2×10⁶um³和3.4×10⁵um²。结果显示于图10A-10C中。

实施例7.液体核心(LC)胶囊的性质

在Coulter Counter上分析LC胶囊以研究载体尺寸分布、表面积和体积。通过光聚合形成具有液体核心的LC胶囊而不含粘附肽或GF。在70um-250um的可接受且预期的直径限度内产生了不均匀尺寸分布的胶囊。如此产生的胶囊的平均体积和表面积对于PC分别为3×10⁷um³和1.5×10⁶um²，和对于LC分别为7.2×10⁶um³和3.4×10⁵um²。结果显示于图11A-11C中。

实施例8.胶囊降解

将胶原蛋白酶可降解肽(GGGPQG↓IWGQGK)(SEQ ID NO:8)与PEG缀合来形成可降解胶囊。胶原蛋白酶可降解肽以1:2(肽:PEG)摩尔比缀合。缀合的PEG随后通过白光聚合用于形成非细胞加载(图12A-12D)和细胞加载(图13A-13B)的PC胶囊。未使用粘附肽或GF。随后将可降解胶囊暴露于胶原蛋白酶，并且在静态条件下(图12A-12D)以及在机械搅拌条件下(图13A-13B)在不同时间点分析胶囊完整性。结果显示于图12A-12D和13A-13B中。如图12中所示的，具有蛋白酶敏感性肽并且未用胶原蛋白酶孵育的胶囊未降解。如图12B-D中所示的，掺入蛋白酶敏感性肽的胶囊在暴露于胶原蛋白酶时显示出随着时间降解的迹象。没有机械搅拌的情况下的降解是可以进行数小时的过程，在这个实例中，>24小时。

如图13A-13B中所示的，细胞加载的PC胶囊的降解在机械搅拌后几乎立即发生，在这个实例中，机械搅拌通过重复的溶液挤出来进行。如图12D和13B中所示的，没有发现超过约1μm左右大小的亚颗粒保留。在细胞加载的胶囊的实例中，图13B的箭头指向在胶囊降解后保留的收获细胞。

实施例9.细胞纯化后保持的MSC形态

进行了进一步测试来评估从包括不同浓度的粘附肽的胶囊收获后的MSC形态，其结果显示于图16A-16C中。进行这些测试来证实胶囊材料(PEG、PQ或RGDS)对收获后MSC的TCP附着、扩散和增殖没有任何有害影响。在样品之间没有观察到细胞形态的差异。10mM的PEG-RGDS显示了较高的细胞产量。

实施例10.与工业标准载体的比较

将微载体在细胞培养基中平衡，并且MSC细胞允许在静态条件下粘附于微载体表面(图17A-B)。使用Cytodex 3(Corning)微载体。在标准细胞培养基条件下在70rpm下培养了微载体粘附的MSC。

在动态培养中四十八小时后，MSC从微载体表面脱离并且聚集的细胞碎片在旋转烧瓶中是可见的，如图17C中所示的。

实施例11.具有0mM或10mM RGDS的PEGDA中MSC的比较活力

进行测试以评估具有和没有10mM缀合RGDS的PEGDA中MSC的活力。在第1、7和14天取样，其结果显示于图19A-19F中。这个实验的目的是确定粘附肽是否影响包封MSC的活力和增殖。将包封的MSC在高搅拌(125rpm)的旋转烧瓶中培养并维持在37℃/5％CO₂的培养箱中。在生物活性组分的存在下，PEG-RGDS在第1天提供了提高的细胞活力，优于0mM PEG-RGDS群组。

实施例12.具有10mM RGDS和不同浓度的bFGF的PEGDA中MSC的比较活力

进行了测试来评估具有不同浓度的bFGF(0μg/L、0.25μg/L和25μg/L)的PEGDA中MSC的活力。在第1、7和14天取样，其结果显示于图20A-20I中。将包封的MSC在高搅拌(125rpm)的旋转烧瓶中培养并维持在37℃/5％CO₂的培养箱中。MSC增殖受到bFGF的浓度的正向影响。使用较高浓度的与微胶囊缀合的bFGF，我们发现了沿着微胶囊壁的更密集的增殖MSC的袋。如图20A-20I中可见的，两种生物活性组分PEG-RGDS和PEG-FGF的存在提供了提高的细胞活力和优于可溶性FGF的显著提高的活力。

实施例13.不可降解和可降解胶囊中MSC的比较活力

进行了测试来评估不可降解和可降解胶囊中MSC的活力。使用PEGDA(不可降解)和PEGPQ(可降解)形成包括10mM RGDS和25μg/L FGF的胶囊。在第1、7和14天取样，其结果显示于图21A-21F中。

包封的MSC在高搅拌(125rpm)的旋转烧瓶中培养并维持在37℃/5％CO₂的培养箱中。补充bFGF(25μg/L)的PEDGA(不可降解)胶囊中的MSC显示出沿着微胶囊壁的密集存活袋，表明了MSC增殖。PEGPQ(可降解)胶囊中的MSC产生密集的存活袋，然而与PEGDA中包封的MSC相比，数量较低。PQ肽可以在胶囊内产生酸性微环境，其可能负面地影响MSC活力。

实施例14.PEGDA中多种细胞类型的比较活力

使用多个细胞谱系，包括AtT-20、3T3和JURKAT细胞，进行了测试。细胞包封在具有0mM的合成PEGDA胶囊中并在第1、7和14天取样，其结果显示于图22A-22G中。

包封的MSC在高搅拌(125rpm)的旋转烧瓶中培养并维持在37℃/5％CO₂的培养箱中。这个实验的目的是确定是否PEGDA胶囊不仅与MSC相容，而且与细胞治疗产品的研发相关的其他细胞系也相容。我们发现PEGDA胶囊与包括AtT-20和3T3的粘附细胞系确实相容，与悬浮生长的Jurkat细胞系相反。没有提供针对第7和14天的AtT-20的照片，因为这些研究正在进行中。

实施例15.PBMC刺激

进行了测试来比较用可溶性CD3/CD28 vs PEG化CD3/CD28的PBMC刺激的效率，其结果显示于图23A-23C中。将CFSE染色的细胞包封在含有可溶性PHA/IL2或可溶性CD3/CD28或PEG化CD3/CD28的PEGPQ胶囊中。在刺激后第4天收获细胞，并使用流式细胞术分析评估CFSE信号。在可溶性和PEG化CD3/CD28之间没有观察到刺激效率的差异。在胶囊中用PHA/IL2也实现了PBMS激活，表明与悬浮细胞相比在包封过程中或在胶囊中刺激效率没有损失。

实施例16.病毒颗粒

进行了其中通过以上关于图25-29描述的方法慢病毒(LV)颗粒用HEK293T细胞缀合和包封的测试。结果显示于图30中。RFP(红色荧光蛋白)是慢病毒颗粒携带的基因构建体(例如，表达标志物以基于RFP基因至宿主细胞HEK293T基因组中的整合来评估转导效率)。这个图像中的RFP对应于激发时(如基因在目标细胞中时)发出红色荧光的荧光团，其可以证实HEK293T细胞用目标基因的慢病毒转导的发生。图像中的GFP(绿色荧光蛋白)对应于活细胞。(来自钙黄绿素AM染色的GFP)是用于确定细胞活力的染料，因为其容易渗透完整的活细胞。特别地，将2μL钙黄绿素加入1mL培养基中并在使用ZEISS显微镜(在其上收集图30的图像)成像之前包封细胞。在这个特定的实验中，我们测试了缀合的慢病毒颗粒可以用目标基因(RFP)转导靶细胞并且在一段时间后胶囊仍含有活细胞(GFP染色)的概念证明。通过使用RFP标志物显示包封的HEK293T细胞用慢病毒成功转导，我们推断出在PRG胶囊内部成功地包封细胞和缀合慢病毒颗粒而同时维持颗粒的传染性的能力。

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本文引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导以其整体按引用并入本文。

尽管已经特别显示和描述了示例性实施方式，但本领域技术人员将理解在其中可以进行各种形式和细节的改变，而没有脱离所附权利要求包括的实施方式的范围。

Claims (45)

1.一种用于生长或储存细胞的胶囊，其包括：

限定内部区室的外壳；和

位于所述内部区室内的用于细胞附着的基质，

其中所述基质包含聚合物和一种或多种粘附分子。

2.根据权利要求1所述的胶囊，其中所述用于细胞附着的基质是所述外壳的内表面。

3.根据权利要求1所述的胶囊，其中所述用于细胞附着的基质是沉积在所述内部区室内的水凝胶。

4.根据权利要求3所述的胶囊，其中所述水凝胶包含交联的聚乙二醇(PEG)、交联的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)或其组合。

5.根据权利要求1-4任一项所述的胶囊，其中所述外壳包含选自以下的聚合物：聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、海藻酸盐、壳聚糖、与海藻酸盐或壳聚糖共聚的PEG、与海藻酸盐或壳聚糖共聚的PEGDA、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚-L-赖氨酸(PLL)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱]-嵌段-(甘油单甲基丙烯酸酯)(PMPC-PGMA)、χ-乙炔-聚(叔-丁基丙烯酸酯)(PtBA)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(二乙烯基苯-共-缩水甘油基甲基丙烯酸酯)(P(DVB-GMA))、聚(酰胺胺)(PAMAM)、聚(D-葡糖酰胺亚乙基甲基丙烯酸酯)(PGAMA)、聚(2-乳糖生物酰胺基乙基甲基丙烯酸酯)(PLAMA)、烷基硫醚末端功能化的聚(甲基丙烯酸)(PMAA-DDT)、聚(乙二醇)-膦(PEG-膦)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)-辛胺(PAA-辛胺)和聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯-嵌段-聚(乙二醇))(PMAO-PEG)，或其组合。

6.根据权利要求1-5任一项所述的胶囊，其中所述一种或多种粘附分子包括粘附肽。

7.根据权利要求6所述的胶囊，其中粘附肽选自RGDS、YIGSR、IKVAV、REDV、GKKQRFRHRNRKG、RNIAEIIKDI和KTRWYSMKKTTMKIIPFNR，或其任意组合。

8.根据权利要求1-5任一项所述的胶囊，其中所述一种或多种粘附分子包括粘附蛋白。

9.根据权利要求8所述的胶囊，其中所述粘附蛋白选自I型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、变性胶原蛋白、IV型胶原蛋白和

或其任意组合。

10.根据权利要求1-5任一项所述的胶囊，其中所述一种或多种粘附分子包括抗体。

11.根据权利要求10所述的胶囊，其中所述抗体是结合细胞表面受体的抗体。

12.根据权利要求10所述的胶囊，其中所述抗体是结合CD3、CD28和CD40中的至少一种的抗体。

13.根据权利要求1-5任一项所述的胶囊，其中所述一种或多种粘附分子包括非肽小分子。

14.根据权利要求13所述的胶囊，其中所述非肽小分子是非甾体抗炎分子。

15.根据权利要求13所述的胶囊，其中所述小分子是stemregulin、reversine或其组合。

16.根据权利要求1-5任一项所述的胶囊，其中所述一种或多种粘附分子是影响活力、增殖、存活、生长、分化或其任意组合的分子。

17.根据权利要求1-16任一项所述的胶囊，其中所述基质进一步包含生长因子。

18.根据权利要求17所述的胶囊，其中所述生长因子与所述聚合物缀合。

19.根据权利要求1或2所述的胶囊，其中所述内部区室包括包含生长因子的液体。

20.根据权利要求16-19任一项所述的胶囊，其中所述生长因子选自FGF、TGF-β1、VEGF、PDGF-BB、PDGF、IGF1、干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、促红细胞生成素、DL-1缺口配体、Wnt、基质衍生因子(SDF)-1、白介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、IL-15R、CD40L、G-CSF、GM-CSF、4-1BB和BMP超家族成员，或其任意组合。

21.根据权利要求1-20任一项所述的胶囊，其中所述外壳是多孔的。

22.根据权利要求21所述的胶囊，其中所述多孔的外壳具有约10nm至约35nm的孔径。

23.根据权利要求22所述的胶囊，其中所述孔径为约20nm。

24.根据权利要求1-23任一项所述的胶囊，其中所述外壳进一步包含酶敏感性肽。

25.根据权利要求24所述的胶囊，其中所述酶敏感性肽是蛋白酶敏感性肽。

26.根据权利要求24所述的胶囊，其中所述肽对选自胰蛋白酶、胶原蛋白酶、DNase、RNase和辣根过氧化物酶，或其任意组合的酶是敏感的。

27.根据权利要求1-26任一项所述的胶囊，进一步包含粘附于所述基质的细胞。

28.根据权利要求27所述的胶囊，其中粘附的细胞选自干细胞、胰岛、外周血单核细胞、内皮祖细胞、血纤维细胞、骨髓细胞、T细胞、B细胞、树突细胞、NK细胞、单核细胞、CD34+细胞、肝细胞、胃肠细胞、皮肤细胞、皮肤祖细胞、癌细胞、杂交瘤细胞、原核细胞、HEK293T包装细胞、酵母细胞和胰腺前体细胞。

29.根据权利要求27所述的胶囊，其中所述细胞选自间充质干细胞(MSC)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Madin-Darby犬肾上皮(MDCK)细胞、Vero细胞、神经干细胞、胚胎干细胞和多能干细胞。

30.根据权利要求1-29任一项所述的胶囊，进一步包括含DNA分子或含RNA分子。

31.根据权利要求30所述的胶囊，其中所述含DNA分子或含RNA分子由粘附于所述基质的病毒颗粒携带。

32.根据权利要求30所述的胶囊，其中所述含DNA分子或含RNA分子包含cDNA、质粒DNA、可转座DNA、病毒载体、修饰的RNA、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、基因编辑分子、锌指核酸酶和大范围核酸酶中的至少一种。

33.根据权利要求32所述的胶囊，其中所述含DNA分子或含RNA分子包含在脂质囊泡内。

34.一种储存细胞的方法，包括：

将细胞包封在权利要求1的胶囊中，其中所述细胞粘附于所述胶囊的内部区室内的所述基质；和

将所述胶囊内的细胞保持在有活力的状态。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述胶囊包括多孔的外壳，并且进一步其中包封所述细胞包括将所述胶囊的多孔外壳暴露于所述细胞，从而所述细胞易位至所述外壳的内部区室中。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述胶囊包括所述内部区室中的培养基，由此产生包封细胞的悬浮培养物，并且所述方法进一步包括使所述细胞在所述悬浮培养物中生长或扩增。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述悬浮培养物是搅拌罐悬浮培养物。

38.根据权利要求34-37任一项所述的方法，进一步包括使所述胶囊的外壳降解并收获所述细胞。

39.一种细胞培养试剂盒，其包含：

第一组合物，其包含聚合物前体材料和粘附分子；和

第二组合物，其包含用于将所述聚合物前体材料聚合以形成具有外壳的胶囊的试剂，所述外壳包含通过所述前体材料的聚合产生的聚合物和所述粘附分子，其中所述粘附分子存在于所述外壳的内表面上。

40.根据权利要求39所述的细胞培养试剂盒，其中所述第一组合物进一步包含生长因子。

41.根据权利要求39或权利要求40所述的细胞培养试剂盒，其中所述第一组合物进一步包含酶敏感性肽。

42.根据权利要求39-41任一项所述的细胞培养试剂盒，其中所述第二组合物进一步包含用于在所述外壳的内部区室内形成水凝胶的交联试剂。

43.根据权利要求39-42任一项所述的细胞培养试剂盒，其中所述第一组合物是冻干的。

44.一种用于生产胶囊的系统：

第一溶液，其包含聚合物和亲水性光引发剂；

第二溶液，其包含包括疏水性光引发剂的乳液，

至少一个泵，其配置成混合所述第一溶液和所述第二溶液，并且配置成将混合的第一溶液和第二溶液泵送通过光反射设备；和

光发射装置，其配置成照射所述光反射设备。

45.根据权利要求42所述的系统，进一步包括收集容器，其中所述混合的第一和第二溶液连续地泵送通过所述光反射设备至所述收集容器。

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