CN115089614A - 一种增强骨骼干细胞性能的方法及其在治疗骨关节炎中的应用 - Google Patents

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李志凌
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李晓彤
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Abstract

本发明公开了一种增强骨骼干细胞性能的方法及其在治疗骨关节炎中的应用。实验证明，由骨骼干细胞、干细胞微载体和磷酸盐缓冲液组成的骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂可以改善骨关节炎骨质病变、保护关节软骨结构、促进软骨基质形成和提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量，即由骨骼干细胞、干细胞微载体和磷酸盐缓冲液组成的骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂可以减轻骨关节炎的病理损害，进而治疗或减轻骨关节炎。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种增强骨骼干细胞性能的方法及其在治疗骨关节炎中的 应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种增强骨骼干细胞性能的方法及其在治疗骨关节炎中的应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是由创伤、免疫、代谢和衰老等多种因素诱发的，以疼痛和行动受限为主要特征的退行性疾病。传统的治疗骨关节炎的手段包括药物、康复训练和手术等，但是骨关节炎发生进展到手术之前的治疗方式效果不佳，目前尚无根本有效的治疗策略。因此，寻找新的治疗策略，减轻骨关节炎病理损害、延缓骨关节炎进展，提升患者生活质量，是科学研究和临床应用都关注的重要问题。
干细胞由于具有多向分化和免疫调节等特性，已经被尝试应用于治疗骨关节炎。目前处于科学研究和临床研究阶段治疗骨关节炎的干细胞包括脐带干细胞、脂肪干细胞、牙髓干细胞等。但是，这些干细胞均不是来源于骨关节组织本身，可能附带一些不利的效应，如脂肪来源的干细胞向脂肪组织分化能力强等。值得注意的是，骨骼干细胞是一大类从骨骼系统内新鉴定获得的组织特异性干细胞。以往的研究表明，骨骼干细胞在骨骼系统发育中发挥重要作用，但是，骨骼干细胞的组织特异性能力在疾病治疗中的作用尚未被充分探索。除此之外，单纯干细胞治疗没有增强的效能，所需要注射的细胞数量较多，这大大增加了治疗的成本。目前，关于干细胞治疗增效的方法常用的包括基因修饰和组织工程技术，然而前者病毒转染所带来的风险和潜在的危害不容忽视。
发明内容
本发明的目的为治疗骨关节炎。
本发明首先保护骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂。骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂的制备方法如下：
(1)将骨骼干细胞和干细胞微载体混合，35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、3-7％(如3-5％、5-7％、3％、5％或7％)CO2培养1-3h(如1-2h、2-3h、1h、2h或3h)，得到骨骼干细胞与干细胞微载体复合物；
(2)用磷酸盐缓冲液稀释步骤(1)得到的骨骼干细胞与干细胞微载体复合物，得到骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂；
所述骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂的功能可为治疗或减轻骨关节炎、改善骨关节炎骨质病变和减轻骨关节炎的病理损害中的至少一种。
上述骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂中，骨骼干细胞的浓度可为1.0×106-1.0×107/mL(如1.0×106-5.0×106/mL、5.0×106-1.0×107/mL、1.0×106/mL、5.0×106/mL或1.0×107/mL)。干细胞微载体的浓度可为15-25mg/mL(如15-20mg/mL、20-25mg/mL、15mg/mL、20mg/mL或25mg/mL)。
上述骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂中，所述减轻骨关节炎的病理损害可表现为保护关节软骨结构、促进软骨基质形成和提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量中的至少一种。
上述任一所述骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂具体可为实施例中的骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂(3D-SSC)。
上述任一所述骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂在制备用于治疗或减轻骨关节炎的产品中的应用。
上述任一所述骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂在制备用于改善骨关节炎骨质病变的产品中的应用。
上述任一所述骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂在制备用于减轻骨关节炎的病理损害的产品中的应用。
上述应用中，所述减轻骨关节炎的病理损害可表现为保护关节软骨结构、促进软骨基质形成和提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量中的至少一种。
干细胞微载体在增强骨骼干细胞治疗骨关节炎效果、改善骨关节炎骨质病变或减轻骨关节炎的病理损害中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述骨关节炎可为创伤性骨关节炎。
上述任一所述磷酸盐缓冲液具体可为武汉赛维尔生物科技有限公司的产品，产品目录号为G4202-500ML。
本发明的发明人通过大量实验，发现了一种不需要借助病毒转染基因，即可增强骨骼干细胞性能的方法，并发现其对于骨关节炎具有更好的疗效。首先通过手术切断大鼠膝关节的前交叉韧带，造成关节不稳定性破坏，进而建立创伤性骨关节炎大鼠模型；之后分离培养大鼠骨骼干细胞，将骨骼干细胞以一定的配比与干细胞微载体复合形成骨骼干细胞与干细胞微载体复合物，再悬浮于磷酸盐缓冲液中，获得骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂；将骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂局部注入创伤性骨关节炎大鼠模型；之后采用microCT检测评价膝关节骨影像学结构，以苏木素伊红染色、甲苯胺蓝染色、番红O-固绿染色、抗II型胶原染色评价骨骼干细胞对于创伤性骨关节炎的保护作用，以染色体标记技术检测骨骼干细胞是否有植入，以转录组测序技术检测骨骼干细胞分泌的免疫调节因子。结果表明，骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂可以显著改善骨关节炎骨质病变、保护关节软骨结构、促进软骨基质形成、提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量、表达多种免疫调节因子。综上所述，本发明的发明人首次采用了一种非基因操作依赖的策略，显著增强了骨骼干细胞的性能，并通过大量实验证明，骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂可以有效治疗或减轻创伤性骨关节炎，减轻骨关节炎的病理损害，即对创伤性骨关节炎具有显著的保护作用。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂改善创伤性骨关节炎大鼠模型的骨影像学结构。
图2为骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂改善创伤性骨关节炎的软骨组织学形态且促进II型胶原蛋白的表达。标尺均代表100μm，*为P＜0.05，**为P＜0.01。
图3为注射入关节腔的骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂在体内的分布和存活情况。标尺代表100μm，*为P＜0.05，***为P＜0.001。
图4为转录组测序分析骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂表达的免疫调节因子。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
SD大鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。
骨骼干细胞培养基：向α-MEM培养基中添加胎牛血清(美国GIBCO公司)，得到骨骼干细胞培养基；骨骼干细胞培养基中，胎牛血清的浓度为10％(v/v)。
下述实施例中的α-MEM培养基为美国GIBCO公司的产品，产品目录号为C12571500BT。
实施例、
一、骨骼干细胞(skeletal stem cell,SSC)的分离培养和骨骼干细胞制剂的制备
1、骨骼干细胞的分离培养
(1)分离1周龄SD大鼠的胫骨和股骨(冲洗掉骨髓)，之后剪碎并置于0.1％II型胶原酶中37℃消化30min，得到碎骨片。
(2)将步骤(1)得到的碎骨片转移至培养瓶(规格为25ml)，加入6ml骨骼干细胞培养基，之后37℃、5％CO2培养，1周左右即可观察到从骨片中爬出的骨骼干细胞；待从骨片中爬出的骨骼干细胞的细胞融合率达到80％左右时，进行细胞传代。培养期间，每隔3天更换新的骨骼干细胞培养基。
细胞传代的步骤如下：弃培养基，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；之后加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；最后1200rpm/min离心5min，弃上清，加入适量骨骼干细胞培养基吹打细胞以混匀，以1：3的传代比将细胞传入新的培养瓶中，继续培养。
1、骨骼干细胞制剂的制备
(1)纯骨骼干细胞制剂(2D-SSC)的制备
取第2-4代生长状态良好的骨骼干细胞，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；之后加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；之后1200rpm/min离心5min，弃上清，用磷酸盐缓冲液(武汉赛维尔生物科技有限公司的产品，产品目录号为G4202-500ML)稀释骨骼干细胞的浓度至106/mL，得到纯骨骼干细胞制剂。
(2)骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂(3D-SSC)的制备
取第2-4代生长状态良好的骨骼干细胞，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；之后加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；之后1200rpm/min离心5min，弃上清，用磷酸盐缓冲液稀释骨骼干细胞的浓度至106/mL；1200rpm/min离心5min，收集细胞沉淀并用200μL骨骼干细胞培养基重悬，得到重悬液。将200μL重悬液滴在1片干细胞微载体(约20mg；北京华龛生物科技有限公司的产品，产品型号为W01-200)上，37℃、5％CO2培养2h(目的为使骨骼干细胞充分地附着在干细胞微载体中)，得到骨骼干细胞与干细胞微载体复合物；之后用适量磷酸盐缓冲液重悬骨骼干细胞与干细胞微载体复合物，1200rpm/min离心5min，弃上清并用磷酸盐缓冲液稀释骨骼干细胞与干细胞微载体复合物，得到浓度为106/20mg/mL的骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂(即每1ml骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂含有1片干细胞微载体(约20mg)和106个骨骼干细胞)。
二、创伤性骨关节炎大鼠模型的构建
1、采用前交叉韧带离断的方法构建创伤性骨关节炎大鼠模型。具体步骤如下：首先腹腔注射2％戊巴比妥钠(注射剂量为45mg/kg)麻醉SD大鼠；然后将SD大鼠仰卧位置于手术台上，常规备皮消毒双侧后肢膝关节，从髌骨旁内侧切开暴露膝关节；之后髌骨脱位，打开关节腔；随后，切断前交叉韧带，行前抽屉实验确定前交叉韧带是否被切断，随后复位髌骨；最后，彻底止血后缝合切口。术中确保关节面无损伤。术后所有SD大鼠每天肌内注射20万单位青霉素预防感染，持续3天。
2、构建假手术对照组模型
参照创伤性骨关节炎大鼠模型的构建方法，构建构建假手术对照组模型。具体步骤如下：首先腹腔注射2％戊巴比妥钠(注射剂量为45mg/kg)麻醉SD大鼠；然后将SD大鼠仰卧位置于手术台上，常规备皮消毒双侧后肢膝关节，从髌骨旁内侧切开暴露膝关节；之后髌骨脱位，打开关节腔，保持前交叉韧带完整，随后复位髌骨；最后，彻底止血后缝合切口。术中确保关节面无损伤。术后所有SD大鼠每天肌内注射20万单位青霉素预防感染，持续3天。
三、注射骨骼干细胞制剂
待步骤二中的SD大鼠术后1周，随机取18只创伤性骨关节炎大鼠模型，分为OA模型组、2D-SSC组和3D-SSC组共3组，每组6只；随机取6只假手术对照组模型，作为对照组；之后进行如下实验：
OA模型组：每只SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL磷酸盐缓冲液；
2D-SSC组：每只SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL纯骨骼干细胞制剂；
3D-SSC组：每只SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂；
对照组：每只SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL磷酸盐缓冲液。
四、microCT系统检测骨影像学结构
完成步骤三4周后，将各组SD大鼠处死，收集完整的膝关节组织样本；用4％多聚甲醛将收集的膝关节组织样本固定1周，之后用microCT系统(Scanco Medical，Bassersodrf，Zurich，Switzerland)检测骨影像学结构，即对膝关节组织样本进行成像。扫描时间为14min，设置为70kVp和114μA。三维图像的重建使用标准的卷积反投影进行。基于骨质增生形成和关节破坏程度进行半定量分析以评估创伤性骨关节炎的严重程度(用OACT评级表示)(Kim JE，Lee SM，Kim SH，Tatman P，Gee AO，Kim DH，Lee KE，Jung Y，Kim SJ.Effectof self-assembled peptide-mesenchymal stem cell complex on the progression ofosteoarthritis in a rat model.Int J Nanomedicine.2014 May 7；9 Suppl 1：141-57.doi：10.2147/IJN.S54114.eCollection 2014.)。
检测结果见图1(OA为OA模型组，2D-SSC为2D-SSC组，3D-SSC为3D-SSC组，对照为对照组)：对照组关节面平整，无明显的骨质破坏和增生；OA模型组关节有明显的骨质破坏和增生的情况，OA CT评级严重；在纯骨骼干细胞制剂治疗的情况下，关节的骨质破坏程度有所减轻，在一定程度上能够改善OA骨质病变，然而这种改善在骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂治疗时更加显著，能够更好地改善创伤性骨关节炎骨质病变情况。由此可见，骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂能够更好地改善创伤性骨关节炎大鼠模型的骨影像学结构。
五、采用组织病理技术检测软骨组织学形态和II型胶原蛋白的表达量
(1)完成步骤四后，将各组的膝关节组织样本置于10％EDTA脱钙液(溶剂为中性磷酸盐缓冲液)中脱钙30天，嵌入石蜡中，切成厚度为6μm的切片。
(2)完成步骤(1)后，通过苏木素伊红染色观察组织结构。
检测结果见图2中A：OA模型组相对于对照组关节软骨层明显变薄，细胞排列紊乱，关节面不平整；在纯骨骼干细胞制剂治疗的情况下，关节软骨层明显增厚，但是关节面仍不平整；在骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂治疗的情况下，关节软骨层明显增厚，关节面平整，更大程度上保护关节软骨结构。由此可见，骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂能够更好地改善创伤性骨关节炎大鼠模型的软骨组织学结构。
(3)完成步骤(1)后，通过甲苯胺蓝和番红O-固绿染色评估软骨基质的分布，并以此进行Mankin评分。
检测结果见图2中A和B：OA模型组相对于对照组关节软骨层染色程度明显变浅，软骨基质减少，Mankin评分增加，OA骨质病变严重；在纯骨骼干细胞制剂治疗的情况下，关节软骨层染色程度加深，软骨基质增多，Mankin评分下降，OA骨质病变减轻，并且这些OA骨质病变改善的变化在骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂治疗时更加显著，更大程度上促进软骨基质形成。由此可见，骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂能够更好地进创伤性骨关节炎大鼠模型的软骨基质形成。
(4)完成步骤(1)后，采用II型胶原抗体(Abcam，1：200)通过免疫组化分析膝关节组织样本中II型胶原蛋白的表达量。
检测结果见图2中A和C：OA模型组相对于对照组关节软骨层II型胶原蛋白染色程度明显减少；在纯骨骼干细胞制剂治疗的情况下，关节软骨层II型胶原蛋白染色程度加深不明显；然而在骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂治疗时，关节软骨层II型胶原蛋白染色程度明显加深，更大程度上促进关节软骨II型胶原蛋白形成。由此可见，骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂能够更好地促进创伤性骨关节炎大鼠模型软骨II型胶原蛋白的表达。
上述结果表明，骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂能够更好地改善创伤性骨关节炎的软骨组织学形态(具体为保护关节软骨结构和促进软骨基质形成)，且提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量。
六、观察注射入关节腔的骨骼干细胞与干细胞微载体复合物在体内的分布和存活情况
1、观察骨骼干细胞与干细胞微载体复合物是否能够植入大鼠膝关节组织
(1)随机取12只术后1周的创伤性骨关节炎大鼠模型(雌性)，分为第1天组、第4天组、第7天组和第10天组共4组，每组3只，之后进行如下实验：
第1天组：每只雌性SD大鼠，术后左侧关节腔注射0.1mL骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂，同时右侧关节腔注射0.1mL雄性SD大鼠乳鼠来源的纯骨骼干细胞制剂，并分别在注射后第1天处死大鼠并收集完整的膝关节组织样本。
第4天组：每只雌性SD大鼠，术后左侧关节腔注射0.1mL骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂，同时右侧关节腔注射0.1mL雄性SD大鼠乳鼠来源的纯骨骼干细胞制剂，并分别在注射后第4天处死大鼠并收集完整的膝关节组织样本。
第7天组：每只雌性SD大鼠，术后左侧关节腔注射0.1mL骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂，同时右侧关节腔注射0.1mL雄性SD大鼠乳鼠来源的纯骨骼干细胞制剂，并分别在注射后第7天处死大鼠并收集完整的膝关节组织样本。
第10天组：每只雌性SD大鼠，术后左侧关节腔注射0.1mL骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂，同时右侧关节腔注射0.1mL雄性SD大鼠乳鼠来源的纯骨骼干细胞制剂，并分别在注射后第10天处死大鼠并收集完整的膝关节组织样本。
雄性SD大鼠乳鼠来源的纯骨骼干细胞制剂的制备方法如下：从1周龄雄性SD大鼠的胫骨和股骨分离培养得到骨骼干细胞；取P2-P4代生长良好的骨骼干细胞，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；再加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；之后1200rpm/min离心5min，弃上清，用磷酸盐缓冲液稀释感染荧光素酶的骨骼干细胞的浓度至106/mL，得到雄性SD大鼠乳鼠来源的纯骨骼干细胞制剂。
(2)用4％多聚甲醛将步骤(1)收集的膝关节组织样本固定1周，之后置于10％EDTA溶液(溶剂为中性磷酸盐缓冲液)中脱钙30天，嵌入石蜡中，切成厚度为6μm的切片。
(3)完成步骤(2)后，采用Sry抗体(Santa Cruz，1:200)进行免疫荧光染色，之后在荧光显微镜(Olympus CKX53)下观察软骨和滑膜位置的染色情况。
检测结果见图3中A：在各个时间点的关节软骨和滑膜处均未看见Sry阳性染色。结果表明，注射入关节腔的雄性SD大鼠乳鼠来源的纯骨骼干细胞制剂和骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂均不能够植入关节软骨和滑膜。
2、观察注射入关节腔的骨骼干细胞与干细胞微载体复合物在体内的分布和存活情况
(1)取步骤一中生长状态良好的骨骼干细胞，按照5×104/ml的密度将骨骼干细胞种植于6孔板，37℃、5％CO2培养24h。
(2)完成步骤(1)后，去除液相，加入1mL骨骼干细胞培养基、携带嘌呤霉素抗性和荧光素酶的慢病毒(MOI＝50)和浓度为5μg/mL的polybrene溶液(溶剂为骨骼干细胞培养基)，37℃、5％CO2培养24h。
携带嘌呤霉素抗性和荧光素酶的慢病毒阴性对照购于上海吉凯基因，载体为GV260,载体元件顺序Ubi-MCS-firefly_Luciferase-IRES-Puromycin。加入该慢病毒阴性对照的目的为用慢病毒使骨骼干细胞感染荧光素酶，并且使转染成功的骨骼干细胞带有嘌呤霉素抗性，便于筛选。
(3)完成步骤(2)后，去除液相，加入2mL含3μg/mL嘌呤霉素的骨骼干细胞培养基，37℃、5％CO2培养48h。
(4)完成步骤(3)后，去除液相，加入2mL骨骼干细胞培养基，37℃、5％CO2培养至细胞融合率达到90％左右，细胞传代2-3次，得到感染荧光素酶的骨骼干细胞。培养期间，每隔3天更换新的骨骼干细胞培养基。
细胞传代的步骤如下：弃培养基，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；之后加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；最后1200rpm/min离心5min，弃上清，加入适量骨骼干细胞培养基吹打细胞以混匀，以1：3的传代比将细胞传入新的培养瓶中，继续培养。
(5)随机取12只术后1周的创伤性骨关节炎大鼠模型，分为4组，每组3只，之后进行如下实验：
每只SD大鼠术后左侧关节腔注射0.1mL感染荧光素酶的骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂(3D-SSC组)，术后右侧关节腔注射0.1mL感染荧光素酶的骨骼干细胞制剂(2D-SSC组)。
感染荧光素酶的骨骼干细胞制剂的制备方法如下：取生长状态良好的感染荧光素酶的骨骼干细胞，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；再加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；之后1200rpm/min离心5min，弃上清，用磷酸盐缓冲液稀释感染荧光素酶的骨骼干细胞的浓度至106/mL，得到感染荧光素酶的骨骼干细胞制剂。
感染荧光素酶与干细胞微载体复合制剂的制备方法如下：取生长状态良好的感染荧光素酶的骨骼干细胞，先加入PBS缓冲液(pH7.4)洗3遍；再加入适量体积的0.25％胰蛋白酶，37℃、5％CO2培养箱中消化3-5min；再加入2倍胰蛋白酶体积的骨骼干细胞培养基以终止消化；之后1200rpm/min离心5min，弃上清，用磷酸盐缓冲液稀释并调整感染荧光素酶的骨骼干细胞的浓度至106/mL，1200rpm/min离心5min，收集细胞沉淀并用200μL骨骼干细胞培养基重悬，得到重悬液。将200μL重悬液滴在1片干细胞微载体上，37℃、5％CO2培养2h，得到感染荧光素酶的骨骼干细胞与干细胞微载体复合物；之后用适量磷酸盐缓冲液重悬，1200rpm/min离心5min，弃上清并用磷酸盐缓冲液稀释感染荧光素酶的骨骼干细胞与干细胞微载体复合物，得到感染荧光素酶的骨骼干细胞与干细胞微载体复合物，浓度为106/20mg/mL。
(6)完成步骤(5)的第1天、第4天、第7天和第12天，用生物发光成像法跟踪细胞的分布和存活情况，具体步骤如下：用2％异氟烷麻醉SD大鼠，之后腹腔注射D-luciferase(注射剂量为150μg/只)，10min后，放入活体成像仪成像暗箱平台，进行成像监测；生物信号获得后应用活体成像软件(Living Image Software4.0)进行分析。
检测结果见图3中B和C。结果表明，注射入关节腔的纯骨骼干细胞以及骨骼干细胞与干细胞微载体复合物不会迁移到其他部位。除此之外，纯骨骼干细胞存活时间较短，在第七天的时候荧光强度微弱，存活的细胞数少；而骨骼干细胞与干细胞微载体复合物在第七天时，荧光强度仍然很强，存活的细胞数更多。由此可见，干细胞微载体对骨骼干细胞具有保护作用，促进骨骼干细胞在关节腔中存活。
七、采用转录组测序分析骨骼干细胞表达的免疫调节因子
为了进一步研究干细胞微载体介导的骨骼干细胞特性的改善及其内在机制，首先将纯骨骼干细胞制剂(2D-SSC)或骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂(3D-SSC)接种至6孔培养板，37℃、5％CO2培养3天；然后收集细胞进行高通量RNA测序分析。下一代测序文库的制备和Illumina MiSeq测序在GENEWIZ，Inc(中国苏州)进行。DNA文库由Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，Palo Alto，California，U.S.)进行质控，并用Qubit2.0 Fluorometer进行定量。根据制造商的说明，DNA文库被复用并加载到Illumina MiSeq仪器(Illumina，San Diego，California，U.S.)。测序采用2×300配对末端(PE)配置；图像分析和碱基调用由MiSeq控制软件(MCS)进行。所有显著的差异表达基因(log2FoldChange≥2)被用于基因本体论(GO)分析和蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)分析。
检测结果见图4。结果表明，骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂培养的骨骼干细胞表达更多的免疫调节因子，如Il10、Bmp2和Ptgs2等；骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂培养的骨骼干细胞高表达的差异基因参与免疫抑制和抗凋亡的作用，增强了骨骼干细胞免疫调控和存活能力；并且通过PPI分析可以推断出这种增强的免疫抑制能力可能作用于巨噬细胞。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂，其制备方法如下：
(1)将骨骼干细胞和干细胞微载体混合，35-39℃、3-7％CO2培养1-3h，得到骨骼干细胞与干细胞微载体复合物；
(2)用磷酸盐缓冲液稀释步骤(1)得到的骨骼干细胞与干细胞微载体复合物，得到骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂；
所述骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂的功能为治疗或减轻骨关节炎、改善骨关节炎骨质病变和减轻骨关节炎的病理损害中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂，其特征在于：所述骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂中，骨骼干细胞的浓度为1.0×106-1.0×107/mL，干细胞微载体的浓度为15-25mg/mL。
3.根据权利要求1所述的骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂，其特征在于：所述减轻骨关节炎的病理损害表现为保护关节软骨结构、促进软骨基质形成和提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂，其特征在于：所述骨关节炎为创伤性骨关节炎。
5.权利要求1至4任一所述骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂在制备用于治疗或减轻骨关节炎的产品中的应用。
6.权利要求1至4任一所述骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂在制备用于改善骨关节炎骨质病变的产品中的应用。
7.权利要求1至4任一所述骨骼干细胞与干细胞微载体复合制剂在制备用于减轻骨关节炎的病理损害的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述减轻骨关节炎的病理损害表现为保护关节软骨结构、促进软骨基质形成和提高膝关节软骨组织中II型胶原蛋白的表达量中的至少一种。
9.根据权利要求5至8任一所述的应用，其特征在于：所述骨关节炎为创伤性骨关节炎。
10.干细胞微载体在增强骨骼干细胞治疗骨关节炎效果、改善骨关节炎骨质病变或减轻骨关节炎的病理损害中的应用。
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