CN116904520A - 制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了遗传工程领域中制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用。本发明所要解决的技术问题是如何提供一种能够治疗骨关节炎的细胞制品。为了解决该技术问题，本发明提供了制备重组软骨祖细胞的方法，所述方法包括如下步骤：1）分离软骨祖细胞：酶解消化离体的关节透明软骨得到酶解物，利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物得到软骨祖细胞；2）向所述软骨祖细胞中导入TNFAIP3蛋白质的编码基因，得到所述重组软骨祖细胞。本发明可用于治疗和/或预防和/或缓解和/或改善骨关节炎。
Description
技术领域
本发明涉及遗传工程领域中制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用。
背景技术
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨破坏和持续性疼痛为特征的慢性退行性疾病，伴有结构和功能损伤，其发病率高，病程长，且患病率呈上升趋势。目前，治疗骨关节炎的药物主要以缓解症状为主，到中晚期的患者需进行关节置换手术才能缓解疼痛。以往研究表明，骨关节炎的发生和发展与创伤、代谢、炎症等多种因素有关，这些因素相互作用，导致大多数治疗方法的疗效较差。因此，迫切需要研发新的治疗策略来延缓骨关节炎的进展。
近年来，干细胞在治疗骨关节炎中得到了研究。但因干细胞具有组织异质性及其作用机制尚不明确，其治疗骨关节炎的疗效还有待提高。软骨祖细胞被认为是骨骼中具有软骨生成潜能和高复制能力的组织特异性干细胞，近年来研究表明，软骨祖细胞在软骨再生修复应用中有很大的优势，有助于骨的发育、稳态、衰老和再生。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够治疗骨关节炎的细胞制品。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种制备重组软骨祖细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
1）分离软骨祖细胞：酶解消化离体的关节透明软骨得到酶解物，利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物得到软骨祖细胞；
2）向所述软骨祖细胞中导入肿瘤坏死因子α诱导蛋白3的编码基因，得到所述重组软骨祖细胞。
进一步地，上述方法中所述重组软骨祖细胞表达TNFAIP3蛋白质。
所述肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNF alpha induced protein 3，TNFAIP3)为下述任一种蛋白质，
A1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2）将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1）所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3）在A1）或A2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
所述TNFAIP3蛋白质的编码基因是编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。
进一步地，上述方法中所述方法不包括软骨细胞的去分化。
进一步地，上述方法中利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物包括利用培养贴壁细胞的培养基进行培养的步骤。
上文中所述培养贴壁细胞的培养基可含有体积百分数为10%的FBS（胎牛血清）。
上文中所述培养贴壁细胞的培养基可为向α-MEM培养基中添加FBS、青霉素和链霉素得到的液体培养基（完全培养基），所述培养贴壁细胞的培养基中FBS的体积百分数为10%，青霉素的含量可为100单位/ml，链霉素的含量可为100ng/ml。
进一步地，上述方法中所述关节透明软骨来源于人，具体来源于人的膝关节。
进一步地，上述方法中所述酶解消化用胶原酶进行。
上文中所述胶原酶可为Ⅱ型胶原酶。
上文中所述酶解消化可在Ⅱ型胶原酶的含量可为125 CDU/mL的酶解反应体系中，37℃消化2小时。
进一步地，上述方法中所述软骨祖细胞具有通过分泌作用抑制破骨细胞的形成和/或骨吸收的能力。
本发明还提供了一种重组软骨祖细胞，所述重组软骨祖细胞由前述方法制备。该重组软骨祖细胞表达氨基酸是SEQ ID No.1的蛋白质。
本发明还提供了一种治疗和/或预防和/或缓解和/或改善骨关节炎的药物，所述药物由药用辅料和前述的重组软骨祖细胞组成。
进一步地，上述药物的剂型为注射剂。
本发明通过实验证明，TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞可以有效减轻骨关节炎的病理损害，同时可抑制软骨下成骨细胞发生坏死性凋亡，对创伤性骨关节炎具有保护作用。
附图说明
图1为TNFAIP3基因修饰的人软骨祖细胞的荧光图及TNFAIP3的Western blotting结果。A图中上图为经TNFAIP3过表达载体LV5基因修饰的软骨祖细胞的荧光图，A图中下图为经TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞的荧光图；B图为经过载体LV5及TNFAIP3基因修饰过的软骨祖细胞的WB结果，左边第一泳道为载体LV5，第二泳道为TNFAP3过表达，第一行为TNFAP3抗体的WB结果，第二行为GAPDH抗体的WB结果。
图2为本发明实施例1提供的P0-P5代软骨祖细胞生长曲线图及P1-P5代群体倍增时间图。
图3为本发明实施例1提供的软骨祖细胞形态图。
图4为本发明实施例1提供的软骨祖细胞流式表型图。
图5为本发明实施例1提供的软骨祖细胞三系分化能力鉴定图。从左至右依次为结晶紫染色结果、ALP染色结果、甲苯胺蓝（Toluidine Blue）染色结果和油红O（Oil Red O）染色结果。
图6为本发明实施例1提供的软骨祖细胞核型分析图。
图7为本发明实施例1提供的软骨祖细胞体内成瘤马松染色图。
图8为TNFAIP3基因修饰的人软骨祖细胞改善创伤性骨关节炎动物模型的骨影像学结构。从左往右的第一列的上图为对照组大鼠关节的Micro-CT图，第一列的中图为对照组大鼠关节对应的软骨下骨图像，第一列的下图为对照组大鼠关节胫骨平台的三维图像；第二列的上图为OA组大鼠关节的Micro-CT图，第二列的中图为OA组大鼠关节对应的软骨下骨图像，第二列的下图为OA组大鼠关节胫骨平台的三维图像；第三列的上图为关节腔注射稳转空载质粒的人软骨祖细胞组的大鼠关节的Micro-CT图，第三列的中图为关节腔注射稳转空载质粒的人软骨祖细胞组的大鼠关节对应的软骨下骨图像，第三列的下图为关节腔注射稳转空载质粒的人软骨祖细胞细胞组的大鼠关节胫骨平台的三维图像；第四列的上图为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞组的大鼠关节的Micro-CT图，第四列的中图为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞组的大鼠关节对应的软骨下骨图像，第四列的下图为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞组的大鼠关节胫骨平台的三维图像。
图9为TNFAIP3基因修饰的人软骨祖细胞改善创伤性骨关节炎的关节组织学形态。从左往右的第一列的第一图为对照组大鼠关节部位的苏木精-伊红染色，第一列的第二图为对照组大鼠关节部位的番红O固绿染色，第一列的第三图为对照组大鼠关节部位的甲苯胺蓝染色，第一列的第四图为对照组大鼠关节部位的I型胶原免疫组化；第二列的第一图为OA组大鼠关节部位的苏木精-伊红染色，第二列的第二图为OA组大鼠关节部位的番红O固绿染色，第二列的第三图为OA组大鼠关节部位的甲苯胺蓝染色，第二列的第四图为OA组大鼠关节部位的I型胶原免疫组化；第三列的第一图为关节腔注射稳转空载质粒的人软骨祖细胞组大鼠关节部位的苏木精-伊红染色染色，第三列的第二图为关节腔注射稳转空载质粒的人软骨祖细胞组大鼠关节部位的番红O固绿染色，第三列的第三图为关节腔注射稳转空载质粒的人软骨祖细胞组大鼠关节部位的甲苯胺蓝染色，第三列的第四图为关节腔注射稳转空载质粒的人软骨祖细胞组大鼠关节部位的I型胶原免疫组化；第四列的第一图为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞组大鼠关节部位的苏木精-伊红染色，第四列的第二图为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞组大鼠关节部位番红O固绿染色，第四列的第三图为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞组大鼠关节部位甲苯胺蓝染色，第四列的第四图为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞组大鼠关节部位的I型胶原免疫组化。
图10为诱导坏死性凋亡的成骨细胞在TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞培养上清处理后的免疫荧光染色。从左往右的第一列的上图为对照组软骨下成骨细胞RIPK3的免疫荧光，第一列的下图为对照组软骨下成骨细胞pMLKL的免疫荧光；第二列的上张图为坏死性凋亡诱导组软骨下成骨细胞RIPK3的免疫荧光，第二列的下图为坏死性凋亡诱导组软骨下成骨细胞pMLKL的免疫荧光；第三列的上图为使用含10%的稳转空载质粒人软骨祖细胞培养上清的培养基处理的软骨下成骨细胞RIPK3的免疫荧光，第三列的下图为使用含10%的稳转空载质粒人软骨祖细胞培养上清的培养基处理的软骨下成骨细胞pMLKL的免疫荧光；第四列的上图为含有10%TNFAIP3基因修饰软骨祖细胞上清的培养基处理的软骨下成骨细胞RIPK3的免疫荧光，第四列的下图为含有10%TNFAIP3基因修饰软骨祖细胞上清的培养基处理的软骨下成骨细胞pMLKL的免疫荧光。
图11为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的人软骨祖细胞抑制软骨下成骨细胞坏死性凋亡。从左往右的第一列的第一图为对照组大鼠软骨下骨中RIPK3及OCN的免疫荧光，第一列的第二图为第一图的局部放大图，第一列的第三图为对照组大鼠软骨下骨中pMLKL及OCN的免疫荧光，第一列的第四图为第三图的局部放大图；第二列的第一图为OA组大鼠软骨下骨中RIPK3及OCN的免疫荧光，第二列的第二图为第一图的局部放大图，第二列的第三图为OA组大鼠软骨下骨中pMLKL及OCN的免疫荧光，第二列的第四图为第三图的局部放大图；第三列的第一图为关节腔注射稳转空载质粒的人软骨祖细胞组大鼠软骨下骨中RIPK3及OCN的免疫荧光，第三列的第二图为第一图的局部放大图，第三列的第三图为关节腔注射稳转空载质粒的人软骨祖细胞组大鼠软骨下骨中pMLKL及OCN的免疫荧光，第三列的第四图为第三图的局部放大图；第四列的第一图为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞组大鼠软骨下骨中RIPK3及OCN的免疫荧光，第四列的第二图为第一图的局部放大图，第四列的第三图为关节腔注射TNFAIP3基因修饰的软骨祖细胞组大鼠软骨下骨中pMLKL及OCN的免疫荧光，第四列的第四图为第三图的局部放大图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、TNFAIP3基因修饰的人软骨祖细胞制备及TNFAIP3表达检测
一、构建TNFAIP3过表达的载体
1、过表达载体制备
编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒是TNFAIP3的重组过表达载体，该TNFAIP3的重组过表达载体是以SEQ ID No.2所示的DNA分子替换LV5(EF-1a/GFP&Puro)载体（为GenePharma公司产品，记载于非专利文献“Hansen Yang, Jia Wang, Zheng Zhang, RuiPeng, Dan Lv , Handeng Liu, Yan Sun. Sp1-Induced lncRNA Rmrp PromotesMesangial Cell Proliferation and Fibrosis in Diabetic Nephropathy byModulating the miR-1a-3p/JunD Pathway. Front Endocrinol (Lausanne). 2021 Aug27;12:690784. doi: 10.3389/fendo.2021.690784. eCollection 2021.”）的NotI和BamHI酶切识别位点之间的核苷酸序列且保持其他核苷酸序列不变得到的重组表达载体。该重组过表达载体表达TNFAIP3。
TNFAIP3的氨基酸序列（SEQ ID No.1）
MAEQVLPQALYLSNMRKAVKIRERTPEDIFKPTNGIIHHFKTMHRYTLEMFRTCQFCPQFREIIHKALIDRNIQATLESQKKLNWCREVRKLVALKTNGDGNCLMHATSQYMWGVQDTDLVLRKALFSTLKETDTRNFKFRWQLESLKSQEFVETGLCYDTRNWNDEWDNLIKMASTDTPMARSGLQYNSLEEIHIFVLCNILRRPIIVISDKMLRSLESGSNFAPLKVGGIYLPLHWPAQECYRYPIVLGYDSHHFVPLVTLKDSGPEIRAVPLVNRDRGRFEDLKVHFLTDPENEMKEKLLKEYLMVIEIPVQGWDHGTTHLINAAKLDEANLPKEINLVDDYFELVQHEYKKWQENSEQGRREGHAQNPMEPSVPQLSLMDVKCETPNCPFFMSVNTQPLCHECSERRQKNQNKLPKLNSKPGPEGLPGMALGASRGEAYEPLAWNPEESTGGPHSAPPTAPSPFLFSETTAMKCRSPGCPFTLNVQHNGFCERCHNARQLHASHAPDHTRHLDPGKCQACLQDVTRTFNGICSTCFKRTTAEASSSLSTSLPPSCHQRSKSDPSRLVRSPSPHSCHRAGNDAPAGCLSQAARTPGDRTGTSKCRKAGCVYFGTPENKGFCTLCFIEYRENKHFAAASGKVSPTASRFQNTIPCLGRECGTLGSTMFEGYCQKCFIEAQNQRFHEAKRTEEQLRSSQRRDVPRTTQSTSRPKCARASCKNILACRSEELCMECQHPNQRMGPGAHRGEPAPEDPPKQRCRAPACDHFGNAKCNGYCNECFQFKQMYG
TNFAIP3的编码区序列（SEQ ID No.2）
atggctgaacaagtccttcctcaggctttgtatttgagcaatatgcggaaagctgtgaagatacgggagagaactccagaagacatttttaaacctactaatgggatcattcatcattttaaaaccatgcaccgatacacactggaaatgttcagaacttgccagttttgtcctcagtttcgggagatcatccacaaagccctcatcgacagaaacatccaggccaccctggaaagccagaagaaactcaactggtgtcgagaagtccggaagcttgtggcgctgaaaacgaacggtgacggcaattgcctcatgcatgccacttctcagtacatgtggggcgttcaggacacagacttggtactgaggaaggcgctgttcagcacgctcaaggaaacagacacacgcaactttaaattccgctggcaactggagtctctcaaatctcaggaatttgttgaaacggggctttgctatgatactcggaactggaatgatgaatgggacaatcttatcaaaatggcttccacagacacacccatggcccgaagtggacttcagtacaactcactggaagaaatacacatatttgtcctttgcaacatcctcagaaggccaatcattgtcatttcagacaaaatgctaagaagtttggaatcaggttccaatttcgcccctttgaaagtgggtggaatttacttgcctctccactggcctgcccaggaatgctacagataccccattgttctcggctatgacagccatcattttgtacccttggtgaccctgaaggacagtgggcctgaaatccgagctgttccacttgttaacagagaccggggaagatttgaagacttaaaagttcactttttgacagatcctgaaaatgagatgaaggagaagctcttaaaagagtacttaatggtgatagaaatccccgtccaaggctgggaccatggcacaactcatctcatcaatgccgcaaagttggatgaagctaacttaccaaaagaaatcaatctggtagatgattactttgaacttgttcagcatgagtacaagaaatggcaggaaaacagcgagcaggggaggagagaggggcacgcccagaatcccatggaaccttccgtgccccagctttctctcatggatgtaaaatgtgaaacgcccaactgccccttcttcatgtctgtgaacacccagcctttatgccatgagtgctcagagaggcggcaaaagaatcaaaacaaactcccaaagctgaactccaagccgggccctgaggggctccctggcatggcgctcggggcctctcggggagaagcctatgagcccttggcgtggaaccctgaggagtccactggggggcctcattcggccccaccgacagcacccagcccttttctgttcagtgagaccactgccatgaagtgcaggagccccggctgccccttcacactgaatgtgcagcacaacggattttgtgaacgttgccacaacgcccggcaacttcacgccagccacgccccagaccacacaaggcacttggatcccgggaagtgccaagcctgcctccaggatgttaccaggacatttaatgggatctgcagtacttgcttcaaaaggactacagcagaggcctcctccagcctcagcaccagcctccctccttcctgtcaccagcgttccaagtcagatccctcgcggctcgtccggagcccctccccgcattcttgccacagagctggaaacgacgcccctgctggctgcctgtctcaagctgcacggactcctggggacaggacggggacgagcaagtgcagaaaagccggctgcgtgtattttgggactccagaaaacaagggcttttgcacactgtgtttcatcgagtacagagaaaacaaacattttgctgctgcctcagggaaagtcagtcccacagcgtccaggttccagaacaccattccgtgcctggggagggaatgcggcacccttggaagcaccatgtttgaaggatactgccagaagtgtttcattgaagctcagaatcagagatttcatgaggccaaaaggacagaagagcaactgagatcgagccagcgcagagatgtgcctcgaaccacacaaagcacctcaaggcccaagtgcgcccgggcctcctgcaagaacatcctggcctgccgcagcgaggagctctgcatggagtgtcagcatcccaaccagaggatgggccctggggcccaccggggtgagcctgcccccgaagacccccccaagcagcgttgccgggcccccgcctgtgatcattttggcaatgccaagtgcaacggctactgcaacgaatgctttcagttcaagcagatgtatggctaa
TNFAIP3的核苷酸序列（SEQ ID No.3）
GCAGTCTGCAGTCTTCGTGGCGGGCCAAGCGAGCTTGGAGCCCGCGGGGGCGGAGCGGTGAGAGCGGCCGCCAAGAGAGATCACACCCCCAGCCGACCCTGCCAGCGAGCGAGCCCGACCCCAGGCGTCCATGGAGCGTCGCCTCCGCCCGGTCCCTGCCCCGACCCCCGCCTGCGGCGCGCTCCTGCCTTGACCAGGACTTGGGACTTTGCGAAAGGATCGCGGGGCCCGGAGAGGTAACCGCCGCGCCTCCCGGAGAGGTAACCGCCGCGCCTCCCGGAGAGGTGTTGGAGAGCACAATGGCTGAACAAGTCCTTCCTCAGGCTTTGTATTTGAGCAATATGCGGAAAGCTGTGAAGATACGGGAGAGAACTCCAGAAGACATTTTTAAACCTACTAATGGGATCATTCATCATTTTAAAACCATGCACCGATACACACTGGAAATGTTCAGAACTTGCCAGTTTTGTCCTCAGTTTCGGGAGATCATCCACAAAGCCCTCATCGACAGAAACATCCAGGCCACCCTGGAAAGCCAGAAGAAACTCAACTGGTGTCGAGAAGTCCGGAAGCTTGTGGCGCTGAAAACGAACGGTGACGGCAATTGCCTCATGCATGCCACTTCTCAGTACATGTGGGGCGTTCAGGACACAGACTTGGTACTGAGGAAGGCGCTGTTCAGCACGCTCAAGGAAACAGACACACGCAACTTTAAATTCCGCTGGCAACTGGAGTCTCTCAAATCTCAGGAATTTGTTGAAACGGGGCTTTGCTATGATACTCGGAACTGGAATGATGAATGGGACAATCTTATCAAAATGGCTTCCACAGACACACCCATGGCCCGAAGTGGACTTCAGTACAACTCACTGGAAGAAATACACATATTTGTCCTTTGCAACATCCTCAGAAGGCCAATCATTGTCATTTCAGACAAAATGCTAAGAAGTTTGGAATCAGGTTCCAATTTCGCCCCTTTGAAAGTGGGTGGAATTTACTTGCCTCTCCACTGGCCTGCCCAGGAATGCTACAGATACCCCATTGTTCTCGGCTATGACAGCCATCATTTTGTACCCTTGGTGACCCTGAAGGACAGTGGGCCTGAAATCCGAGCTGTTCCACTTGTTAACAGAGACCGGGGAAGATTTGAAGACTTAAAAGTTCACTTTTTGACAGATCCTGAAAATGAGATGAAGGAGAAGCTCTTAAAAGAGTACTTAATGGTGATAGAAATCCCCGTCCAAGGCTGGGACCATGGCACAACTCATCTCATCAATGCCGCAAAGTTGGATGAAGCTAACTTACCAAAAGAAATCAATCTGGTAGATGATTACTTTGAACTTGTTCAGCATGAGTACAAGAAATGGCAGGAAAACAGCGAGCAGGGGAGGAGAGAGGGGCACGCCCAGAATCCCATGGAACCTTCCGTGCCCCAGCTTTCTCTCATGGATGTAAAATGTGAAACGCCCAACTGCCCCTTCTTCATGTCTGTGAACACCCAGCCTTTATGCCATGAGTGCTCAGAGAGGCGGCAAAAGAATCAAAACAAACTCCCAAAGCTGAACTCCAAGCCGGGCCCTGAGGGGCTCCCTGGCATGGCGCTCGGGGCCTCTCGGGGAGAAGCCTATGAGCCCTTGGCGTGGAACCCTGAGGAGTCCACTGGGGGGCCTCATTCGGCCCCACCGACAGCACCCAGCCCTTTTCTGTTCAGTGAGACCACTGCCATGAAGTGCAGGAGCCCCGGCTGCCCCTTCACACTGAATGTGCAGCACAACGGATTTTGTGAACGTTGCCACAACGCCCGGCAACTTCACGCCAGCCACGCCCCAGACCACACAAGGCACTTGGATCCCGGGAAGTGCCAAGCCTGCCTCCAGGATGTTACCAGGACATTTAATGGGATCTGCAGTACTTGCTTCAAAAGGACTACAGCAGAGGCCTCCTCCAGCCTCAGCACCAGCCTCCCTCCTTCCTGTCACCAGCGTTCCAAGTCAGATCCCTCGCGGCTCGTCCGGAGCCCCTCCCCGCATTCTTGCCACAGAGCTGGAAACGACGCCCCTGCTGGCTGCCTGTCTCAAGCTGCACGGACTCCTGGGGACAGGACGGGGACGAGCAAGTGCAGAAAAGCCGGCTGCGTGTATTTTGGGACTCCAGAAAACAAGGGCTTTTGCACACTGTGTTTCATCGAGTACAGAGAAAACAAACATTTTGCTGCTGCCTCAGGGAAAGTCAGTCCCACAGCGTCCAGGTTCCAGAACACCATTCCGTGCCTGGGGAGGGAATGCGGCACCCTTGGAAGCACCATGTTTGAAGGATACTGCCAGAAGTGTTTCATTGAAGCTCAGAATCAGAGATTTCATGAGGCCAAAAGGACAGAAGAGCAACTGAGATCGAGCCAGCGCAGAGATGTGCCTCGAACCACACAAAGCACCTCAAGGCCCAAGTGCGCCCGGGCCTCCTGCAAGAACATCCTGGCCTGCCGCAGCGAGGAGCTCTGCATGGAGTGTCAGCATCCCAACCAGAGGATGGGCCCTGGGGCCCACCGGGGTGAGCCTGCCCCCGAAGACCCCCCCAAGCAGCGTTGCCGGGCCCCCGCCTGTGATCATTTTGGCAATGCCAAGTGCAACGGCTACTGCAACGAATGCTTTCAGTTCAAGCAGATGTATGGCTAACCGGAAACAGGTGGGTCACCTCCTGCAAGAAGTGGGGCCTCGAGCTGTCAGTCATCATGGTGCTATCCTCTGAACCCCTCAGCTGCCACTGCAACAGTGGGCTTAAGGGTGTCTGAGCAGGAGAGGAAAGATAAGCTCTTCGTGGTGCCCACGATGCTCAGGTTTGGTAACCCGGGAGTGTTCCCAGGTGGCCTTAGAAAGCAAAGCTTGTAACTGGCAAGGGATGATGTCAGATTCAGCCCAAGGTTCCTCCTCTCCTACCAAGCAGGAGGCCAGGAACTTCTTTGGACTTGGAAGGTGTGCGGGGACTGGCCGAGGCCCCTGCACCCTGCGCATCAGGACTGCTTCATCGTCTTGGCTGAGAAAGGGAAAAGACACACAAGTCGCGTGGGTTGGAGAAGCCAGAGCCATTCCACCTCCCCTCCCCCAGCATCTCTCAGAGATGTGAAGCCAGATCCTCATGGCAGCGAGGCCCTCTGCAAGAAGCTCAAGGAAGCTCAGGGAAAATGGACGTATTCAGAGAGTGTTTGTAGTTCATGGTTTTTCCCTACCTGCCCGGTTCCTTTCCTGAGGACCCGGCAGAAATGCAGAACCATCCATGGACTGTGATTCTGAGGCTGCTGAGACTGAACATGTTCACATTGACAGAAAAACAAGCTGCTCTTTATAATATGCACCTTTTAAAAAATTAGAATATTTTACTGGGAAGACGTGTAACTCTTTGGGTTATTACTGTCTTTACTTCTAAAGAAGTTAGCTTGAACTGAGGAGTAAAAGTGTGTACATATATAATATACCCTTACATTATGTATGAGGGATTTTTTTAAATTATATTGAAATGCTGCCCTAGAAGTACAATAGGAAGGCTAAATAATAATAACCTGTTTTCTGGTTGTTGTTGGGGCATGAGCTTGTGTATACACTGCTTGCATAAACTCAACCAGCTGCCTTTTTAAAGGGAGCTCTAGTCCTTTTTGTGTAATTCACTTTATTTATTTTATTACAAACTTCAAGATTATTTAAGTGAAGATATTTCTTCAGCTCTGGGGAAAATGCCACAGTGTTCTCCTGAGAGAACATCCTTGCTTTGAGTCAGGCTGTGGGCAAGTTCCTGACCACAGGGAGTAAATTGGCCTCTTTGATACACTTTTGCTTGCCTCCCCAGGAAAGAAGGAATTGCATCCAAGGTATACATACATATTCATCGATGTTTCGTGCTTCTCCTTATGAAACTCCAGCTATGTAATAAAAAACTATACTCTGTGTTCTGTTAATGCCTCTGAGTGTCCTACCTCCTTGGAGATGAGATAGGGAAGGAGCAGGGATGAGACTGGCAATGGTCACAGGGAAAGATGTGGCCTTTTGTGATGGTTTTATTTTCTGTTAACACTGTGTCCTGGGGGGGCTGGGAAGTCCCCTGCATCCCATGGTACCCTGGTATTGGGACAGCAAAAGCCAGTAACCATGAGTATGAGGAAATCTCTTTCTGTTGCTGGCTTACAGTTTCTCTGTGTGCTTTGTGGTTGCTGTCATATTTGCTCTAGAAGAAAAAAAAAAAAGGAGGGGAAATGCATTTTCCCCAGAGATAAAGGCTGCCATTTTGGGGGTCTGTACTTATGGCCTGAAAATATTTGTGATCCATAACTCTACACAGCCTTTACTCATACTATTAGGCACACTTTCCCCTTAGAGCCCCCTAAGTTTTTCCCAGACGAATCTTTATAATTTCTTTCCAAAGATACCAAATAAACTTCAGTGTTTTCATCTAATTCTCTTAAAGTTGATATCTTAATATTTTGTGTTGATCATTATTTCCATTCTTAATGTGAAAAAAAGTAATTATTTATACTTATTATAAAAAGTATTTGAAATTTGCACATTTAATTGTCCCTAATAGAAAGCCACCTATTCTTTGTTGGATTTCTTCAAGTTTTTCTAAATAAATGTAACTTTTCACAAGAGTCAACATTAAAAAATAAATTATTTAAGAACA
2、表达TNFAIP3的慢病毒制备
将TNFAIP3的重组过表达载体和三种辅助包装原件载体质粒pGag/Pol质粒、pRev质粒和pVSV-G质粒（GenePharma公司）按照吉玛重组慢病毒操作手册共转染293T细胞，转染72h后收集细胞培养上清，得到表达TNFAIP3的重组慢病毒。
含有空载质粒的慢病毒制备：以LV5(EF-1a/GFP&Puro)载体空质粒替换TNFAIP3过表达质粒，其余操作同表达TNFAIP3的重组慢病毒的操作步骤。
3、进行慢病毒细胞转染
1）将受体软骨祖细胞接种在六孔板上，镜下观察细胞生长密度，待细胞密度达到30%左右时进行病毒感染。根据感染细胞MOI及病毒滴度，分别加入相应体积表达TNFAIP3的慢病毒和含有空载质粒的慢病毒。计算公式：病毒体积=(MOI×细胞数目)/病毒滴度。感染体系配制：1ml完全培养基+1ul促转染剂+病毒体积。37℃培养72小时，更换为完全培养基，继续于37℃、5% CO2培养培养。
2）转染3天后，用荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达情况；加嘌呤霉素1ug/ml对病毒感染过的细胞进行抗性筛选，另使用未感染过的细胞做对照，当对照组细胞完全死亡后筛选结束。
3）继续培养病毒感染过的细胞，对细胞进行常规传代，最后传代至75cm2细胞培养瓶中。
4）通过Western blotting对TNFAIP3的表达进行检测。结果如图1所示，从图1的左图可知，经TNFAIP3慢病毒及空载质粒修饰过的人软骨祖细胞明显表达绿色荧光，由图1中右图表明TNFAIP3过表达基因修饰人软骨祖细胞中的TNFAIP3表达量明显高于稳转空载质粒的人软骨祖细胞中的TNFAIP3表达量。由此可见，TNFAIP3过表达构建成功。验证正确的细胞命名为TNFAIP3过表达基因修饰的人软骨祖细胞。将含有空载质粒的慢病毒按照前述方法转入人软骨祖细胞，验证正确的细胞命名为稳转空载质粒的人软骨祖细胞。
其中，受体软骨祖细胞为P3代软骨祖细胞，按照如下方法制备：
1、关节平台组织的获取
从医院采集废弃的人膝关节胫骨平台组织（患者已签署知情同意书）。
2、软骨祖细胞的分离和培养
下述操作均在无菌条件下进行。
1）.将收集的人膝关节胫骨平台组织转移到无菌采集瓶中，于2-8℃保存。在超净工作台内用预冷含1%双抗（青霉素/链霉素）PBS磷酸缓冲液（青霉素的含量为100单位/ml，链霉素的含量为100ng/ml）中将关节平台组织清洗5分钟。
2）.采用无菌手术刀分离人膝关节胫骨平台相对正常侧中间区域的关节透明软骨，分离时先手持手术刀取薄片状软骨，取关节表层中心承重面，避免边缘，（关节表层为透明软骨，富含干细胞群体，关节边缘较多成纤维软骨），得到关节透明软骨，将关节透明软骨置于六孔板中。
3）.用眼科剪将关节透明软骨剪碎，得到剪碎的软骨。
4）.将剪碎的软骨转移到10 mL离心管中，用含1%双抗PBS洗涤三遍，去除上清。
5）.37℃预热0.1%Ⅱ型胶原酶（购买厂家Sigma，货号V900892）溶液，往步骤4）的离心管中加入2倍组织体积的0.1%Ⅱ型胶原酶溶液得到酶解反应体系，使酶解消化反应体系中Ⅱ型胶原酶的含量为125 CDU/mL，涡旋混匀后放置于37℃ 80rpm摇床中消化2小时，得到消化完成的软骨组织。
6）.将步骤5）中酶解消化完成的软骨组织离心，吸出胶原酶，再往离心管中加入5mL含1%双抗的PBS重悬，500 rpm离心3 min，弃上清，取沉淀得到清洗后的软骨组织块（即酶解物）。
7）.软骨祖细胞的培养及传代
培养贴壁细胞的培养基：向α-MEM培养基（Gibco，货号C12571500BT）中添加FBS、青霉素和链霉素得到的液体培养基（又称完全培养基）。培养贴壁细胞的培养基中，FBS的体积百分数为10%，青霉素的含量为100单位/ml，链霉素的含量为100ng/ml）。
①将步骤6）中清洗后的软骨组织块用镊子转移至25 cm2培养瓶中，加入约5 mL培养贴壁细胞的培养基，移至培养箱中培养3天保持培养瓶不动，该细胞即为P0代软骨祖细胞（简称P0）。
②待P0代软骨祖细胞长至融合率达80%-90%时，去除培养瓶中培养基，加入0.25%EDTA-胰酶（Servicebio，货号G4004-100ML）进行消化，待细胞变圆时加入2倍体积的上述完全培养基终止消化，收集离心后，用适量完全培养基重悬，调整细胞密度为5×105个/瓶进行接种，并将培养瓶置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，每3天用10% FBS的α-MEM培养基（向α-MEM培养基中添加FBS得到的液体培养基，该液体培养基中FBS的体积含量为10%）换液，得到P1代软骨祖细胞（简称P1）。
③按照步骤②中所示方法将P1代软骨祖细胞传代培养至P3代，命名为P3代软骨祖细胞（简称P3）。按前述方法培养并收集P4代软骨祖细胞（简称P4）、P5代软骨祖细胞（简称P5）和P8代软骨祖细胞（简称P8）。P0-P5代软骨祖细胞生长曲线图见图2中的左图，P1-P5代软骨祖细胞的群体倍增时间（population doubling time, PDT）见图2中的右图。（PDT = t×[lg2/(lgNt − lgN0)]），Nt为是t时间培养细胞的终末数目，t为第5天（P1)、第6.5天（P2)、第9天（P3）、第12天（P4）和第16天（P5），N0为培养细胞的初始数目2×105个，即每孔的接种细胞数。
8）.对步骤2中的细胞进行鉴定：
①形态学鉴定
使用光学显微镜分别对P0代、P4代、P8代软骨祖细胞进行观察并拍照。结果如图3所示，软骨祖细胞形态为梭形，成纤维细胞样生长。
②流式鉴定
在流式管中，调整P3代软骨祖细胞浓度为5×105个每管，终体积为100 μL。在各流式管内分别加入CD45流式抗体（购买厂家Biolegend，货号304016）、CD31流式抗体（购买厂家Biolegend，货号303118）、CD235A流式抗体（购买厂家Biolegend，货号349112）、CD29流式抗体（购买厂家eBioscience，货号12-0299-41）、CD44流式抗体（购买厂家Invitrogen，货号17-0441-81）、CD90流式抗体（购买厂家Biolegend，货号328108）、CD105流式抗体（购买厂家Invitrogen，货号1930337）和PDPN流式抗体（购买厂家Biolegend，货号337022）5 μL，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤三遍后，使用流式细胞仪检测。结果如图4所示，分离的P3代软骨祖细胞不表达CD45、CD31和CD235A等造血细胞、内皮细胞和红细胞的表面标志物，但会表达软骨祖细胞的标志物CD29、CD44、CD90、CD105和PDPN（podoplanin，平足蛋白）。
③自我更新和三系分化能力鉴定
A.软骨祖细胞的自我更新能力
将P3代软骨祖细胞以500个/孔细胞铺板，加入2 mL 10% FBS的α-MEM培养基，前三天静置不动；之后每隔3天更换完全培养基；10天后，固定，加入0.1%结晶紫溶液染色。
结晶紫染色结果如图5中的左起第一张图所示，存在紫色染色，表明有细胞集落形成。
B.软骨祖细胞诱导分化成骨细胞
实验组：将P3代软骨祖细胞按5×103个/孔种于48孔板中，每隔3天更换成骨诱导培养基（购买厂家cyagen，货号HUXMX-90021）。诱导10天后，使用碱性磷酸酶（ALP）进行染色。
对照组：以10% FBS的α-MEM培养基替代成骨诱导培养基，其他操作同实验组。
ALP染色结果如图5中的左起第二张图所示，存在红色染色，表明存在成骨细胞，即P3代软骨祖细胞可被诱导分化为成骨细胞。
C.软骨祖细胞诱导分化成软骨细胞
实验组：将P3代软骨祖细胞按5×103个/孔种于48孔板中，每隔3天更换成软骨诱导培养基（购买厂家cyagen，货号HUXMX-90041）。诱导14天后，使用甲苯胺蓝（ToluidineBlue）进行染色。
对照组：以10% FBS的α-MEM培养基替代成软骨诱导培养基，其他操作同实验组。
Toluidine Blue染色结果如图5中的左起第三张图所示，存在紫色染色，表明存在成软骨细胞，即P3代软骨祖细胞可被诱导分化为成软骨细胞。
D.软骨祖细胞诱导分化脂肪细胞
实验组：将P3代软骨祖细胞按1×104个/孔种于48孔板中，每隔3天更换成脂肪诱导培养基（购买厂家cyagen，货号HUXMX-90031）。诱导14天后，使用油红O（Oil Red O）进行染色。
对照组：以10% FBS的α-MEM培养基替代脂肪诱导培养基，其他操作同实验组。
Oil Red O染色结果如图5中的左起第四张图所示，存在红色染色，表明存在脂肪细胞，即P3代软骨祖细胞可被诱导分化为脂肪细胞。
④核型分析
收获前，在P3代细胞培养瓶中加入20 μL秋水仙素溶液（20 μg/mL）处理20分钟，1100 rpm离心10分钟收获细胞。加入浓度为0.075 M的氯化钾溶液（溶质为氯化钾，溶剂为水）37 ℃水浴处理15 min，然后使用1 mL新鲜固定液(乙酸：甲醇=1：3)进行预固定，离心后按细胞计数留适量固定液，将100 μL细胞悬液滴在玻片上，空气干燥后，放入烤箱内90 ℃烘烤2 h。将烤好的玻片用胰酶消化30s，FBS终止消化，最后在吉姆萨染色液中浸染2.5min，自来水冲洗并吹干，封片。
使用GSL120全自动荧光显微镜扫描玻片，使用Cytovision软件对染色体形态进行检查，每个样本检查20个，对每个细胞进行染色体数目、形态和结构检查，对所见异常细胞进行分类和计数。染色体条带和核型结果的命名参照《人类细胞基因组学国际命名体系(ISCN2020)》。结果显示，分离的软骨祖细胞染色体正常（图6）。
⑤裸鼠皮下成瘤实验
实验组：用胰蛋白酶消化P3代软骨祖细胞，使用适量Matrix胶调整细胞浓度为5×106个/mL。在8W的裸鼠（购买厂家维通利华，货号品系代码：401）皮下注射软骨祖细胞，注射量为0.2ml。注射后每日观察细胞团块大小，4周后对细胞团块进行取材，固定后进行石蜡包埋，切片Masson染色。
对照组：以Matrix胶替代P3代软骨祖细胞，其他操作同实验组。
结果如图7所示，4周后注射部位未见异常，未见细胞呈巢状或腺样排列，未见细胞变形、坏死。
实施例2、TNFAIP3基因修饰的人软骨祖细胞治疗骨关节炎的研究实验
1、TNFAIP3基因修饰的人软骨祖细胞制剂的制备
TNFAIP3过表达基因修饰人软骨祖细胞制剂：取实施例1制备得到的生长状态良好的TNFAIP3过表达基因修饰的人软骨祖细胞，加入适量体积的0.25%胰蛋白酶，37℃、5%CO2培养箱中消化3min；加入2倍体积的10% FBS的α-MEM培养基终止消化，1200 rpm/min离心5min，用磷酸盐缓冲液调整TNFAIP3基因修饰的人软骨祖细胞使浓度至106个/100ul，得到TNFAIP3过表达基因修饰人软骨祖细胞制剂。
稳转空载质粒的人软骨祖细胞制剂：以稳转空载质粒的人软骨祖细胞替代TNFAIP3过表达基因修饰人软骨祖细胞，其余操作同TNFAIP3过表达基因修饰人软骨祖细胞制剂。
2、构建创伤性骨关节炎大鼠模型及假手术大鼠模型
（1）提前将所需要的手术器械灭菌备用。在大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司，品系代码：101）腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，待麻醉成功后，将膝关节周围的毛剃除干净，然后将其固定在手术台上，在膝关节处擦拭碘伏杀菌。构建骨关节炎大鼠模型的大鼠，用手术刀片从髌骨内侧纵向切开，撕开筋膜，暴露前交叉韧带，用手术刀将其切断；将髌骨复位，进行前抽屉试验验证是否造模成功；造模成功后用手术针线将筋膜和皮肤缝合，待苏醒后归笼，饲养一周后，即为造模后1周SD大鼠。
假手术组（对照组）大鼠模型只打开关节囊，不横断韧带，然后缝合切口。
（2）实验分组：
将造模后1周SD大鼠分为三组：OA组、载体LV5组和TNFAIP3过表达组，每组3只大鼠；随后进行关节腔注射。同时设置对照组，对照组所用小鼠即步骤（1）中的假手术组（对照组）。
其中对照组与OA组的每只SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL磷酸盐缓冲液；载体LV5组的每只SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL稳转空载质粒的人软骨祖细胞制剂（含有磷酸盐缓冲液和1×106个稳转空载质粒的人软骨祖细胞）；TNFAIP3过表达组的每只SD大鼠术侧关节腔注射0.1mL TNFAIP3过表达基因修饰人软骨祖细胞制剂（含磷酸盐缓冲液和1×106个TNFAIP3过表达基因修饰人软骨祖细胞）。
3、microCT系统检测骨影像学结构
（1）SD大鼠关节腔注射后6周，对大鼠实施安乐死，取全膝关节对组织样本进行microCT（Scanco Medical，Bassersodrf，Zurich，Switzerland）扫描成像，检测骨影像学结构，根据骨质增生形成和关节破坏程度评估骨关节炎的病变程度。
（2）骨影像学结构检测结果（图8）：图8中第一列从上到下依次为对照组的关节整体Micro CT、软骨下骨的Micro CT及胫骨的三维图像，由此可见，对照组关节面平整，无明显的骨质增生；图8中第一列从上到下依次为OA组的关节整体Micro CT、软骨下骨的MicroCT及胫骨的三维图像，由此可见，OA组关节面有明显破坏，软骨下骨破坏，骨小梁间距增大；图8中第三列从上到下依次为载体LV5组的关节整体Micro CT、软骨下骨的Micro CT及胫骨的三维图像，图8中第四列从上到下依次为TNFAIP3过表达组的关节整体Micro CT、软骨下骨的Micro CT及胫骨的三维图像，由此可见，与载体LV5组相比，TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞在一定程度上减轻关节面破坏。结果表明，TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞可以改善创伤性骨关节炎大鼠模型的骨影像学结构，减轻关节损伤。
4、组织切片病理及免疫组化染色
（1）SD大鼠关节腔注射后6周，对大鼠实施安乐死，取膝关节组织在多聚甲醛中进行固定后置于10% EDTA脱钙液（溶剂为中性磷酸盐缓冲液）中脱钙4周，随后进行石蜡包埋，切成4 μm切片。
（2）通过苏木精-伊红（H&E）、番红O-fast绿（SOFG）和甲苯胺蓝（Toluidine Blue）染色观察组织形态改变。
结果表明（图9）：与对照组（图9中第一列的从上往下第1-3图）相比，OA组（图9中第二列的从上往下第1-3图）关节表面不平整，软骨层变薄，软骨基质减少；与OA组和载体LV5组（图9中第四列的从上往下第1-3图）相比，经TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞治疗后（图9中第四列的从上往下第1-3图），软骨基质增多，关节面平整，一定程度上保护了软骨组织。
（3）通过I型胶原（COL I）免疫组化染色分析关节组织样本中软骨下骨COL I情况，评价软骨下骨重塑。切片在内源性过氧化物酶淬灭和阻断非特异性结合位点后，将其与anti-COL I孵育（1：100;Servicebio，中国）进行免疫组化染色。
实验结果（图9）显示：与对照组（图9中第一列的从上往下第4图）相比，OA组（图9中第二列的从上往下第4图）软骨下骨COL I染色区域明显减少；与OA组和载体LV5组（图9中第三列的从上往下第4图）相比，经TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞治疗后（图9中第四列的从上往下第4图）软骨下骨COL I染色区域增加。结果表明，TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞可以改善创伤性骨关节炎的软骨下骨重塑。
5、细胞免疫荧光染色
含TNF-α+ZVD-FMK的培养基：向含10% FBS的α-MEM培养基中添加TNF-α和ZVD-FMK，使TNF-α的含量为100 ng/mL，ZVD-FMK的含量为40mmol/L。
含10%的稳转空载质粒人软骨祖细胞培养上清的培养基：按适当密度接种实施例1制备得到的稳转空载质粒的人软骨祖细胞于25cm2的细胞培养瓶，37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至50 %汇合，更换培养基，继续培养 48 h，得到稳转空载质粒的人软骨祖细胞培养上清，将稳转空载质粒的人软骨祖细胞培养上清与含TNF-α+ZVD-FMK的培养基按照体积比1：9混合，得到含10%的稳转空载质粒的人软骨祖细胞培养上清的培养基。
含10%的TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞培养上清的培养基：按适当密度接种实施例1制备得到的TNFAIP3过表达基因修饰的人软骨祖细胞于25cm2的细胞培养瓶，37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至50 %汇合，更换培养基，继续培养 48 h，得到TNFAIP3过表达基因修饰人软骨祖细胞培养上清，将TNFAIP3过表达基因修饰人软骨祖细胞培养上清与含TNF-α+ZVD-FMK的培养基按照体积比1：9混合，得到含10%的TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞培养上清的培养基。
（1）收集全膝关节置换术患者的胫骨平台，从软骨下骨处分离骨组织并剪成1-2mm的切片并进行培养，每三天更换培养基，待成骨细胞迁移生长融合至80%-90%满时进行稳定传代。使用P3-P6代的成骨细胞铺于六孔板种（2×105个/孔），待细胞贴壁之后更换条件培养基（其中对照组使用完全培养基，坏死性凋亡诱导组使用含TNF-α+ZVD-FMK的培养基，载体LV5组使用含10%的稳转空载质粒人软骨祖细胞培养上清的培养基，TNFAIP3过表达组使用含10%的TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞培养上清的培养基）。
（2）更换条件培养基24h后将成骨细胞固定进行免疫荧光染色，所使用的一抗和二抗方法如下：RIPK3 (1:300, Proteintech, 17563-1-AP)， p-MLKL (1:300, Immunoway,YP1224)，Alexa Fluor® CY3-labeled goat anti-rabbit IgG (1:350, Servicebio,GB25303)。
结果显示（图10）：与对照组（图10中第一列图）相比，诱导组（图10中第二列图）成骨细胞中RIPK3和p-MLKL染色增多；经TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞培养上清处理后（图10中第四列图）的成骨细胞RIPK3和p-MLKL染色减少。结果表明，TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞上清可部分抑制经过诱导的软骨下成骨细胞发生坏性凋亡。
6、组织切片免疫荧光染色
SD大鼠关节腔注射后6周，对大鼠实施安乐死，取膝关节组织在多聚甲醛中进行固定后置于10% EDTA脱钙液（溶剂为中性磷酸盐缓冲液）中脱钙4周，随后进行石蜡包埋，切成4 μm切片。组织切片进行免疫荧光染色所使用的一抗和二抗方法如下：RIPK3 (1:100,Proteintech, 17563-1-AP)， p-MLKL (1:100, Immunoway, YP1224)，OCN (1:100,Servicebio, GB11233)，Alexa Fluor® 488-labeled goat anti-rabbit IgG (1:200,Servicebio, GB25303)， Alexa Fluor® CY3-labeled goat anti-rabbit IgG (1:200,Servicebio, GB25303)。
结果显示（图11）：与对照组（图11中第一列的四张图）相比，OA组（图11中第二列的四张图）软骨下成骨细胞RIPK3和p-MLKL染色增多；与OA组和载体LV5组（图11中第三列的四张图）相比，经TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞治疗后（图11中第四列的四张图）软骨下成骨细胞RIPK3和p-MLKL染色减少。结果表明，TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞可部分抑制创伤性骨关节炎中软骨下成骨细胞发生坏性凋亡，改善骨重塑。
上述结果表明，TNFAIP3基因修饰人软骨祖细胞可以有效减轻骨关节炎的病理损害，同时可抑制软骨下成骨细胞发生坏死性凋亡，对创伤性骨关节炎具有保护作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.制备重组软骨祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）分离软骨祖细胞：酶解消化离体的关节透明软骨得到酶解物，利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物得到软骨祖细胞；
2）向所述软骨祖细胞中导入肿瘤坏死因子α诱导蛋白3的编码基因，得到所述重组软骨祖细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组软骨祖细胞表达所述肿瘤坏死因子α诱导蛋白3。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法不包括软骨细胞的去分化。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物包括利用培养贴壁细胞的培养基进行培养的步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述关节透明软骨来源于人。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述酶解消化用胶原酶进行。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述软骨祖细胞具有通过分泌作用抑制破骨细胞的形成和/或骨吸收的能力。
8.重组软骨祖细胞，其特征在于，所述重组软骨祖细胞由权利要求1-6中任一项所述方法制备。
9.治疗和/或预防和/或缓解和/或改善骨关节炎的药物，其特征在于，所述药物由药用辅料和权利要求8所述的重组软骨祖细胞组成。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。
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