CN110193026B - 干细胞有效成分提取物的制备及其与干细胞外泌体的组合和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合。该组合能够在较低浓度下获得显著的疾病，例如急性肝衰竭治疗效果。此外，本发明还确定了破碎人脂肪干细胞的最佳方案，从而能够得到人脂肪干细胞的有效成分的提取液。

Description

干细胞有效成分提取物的制备及其与干细胞外泌体的组合和 应用

技术领域

本发明涉及干细胞及生物医药领域。具体地说，本发明涉及人源脂肪干细胞(Human-Adipose Derived Stem Cell，hADSC)的裂解液与人源脂肪干细胞来源的外泌体的组合物及其制备方法和应用。

背景技术

间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，不仅能够从骨髓、脐带、脂肪中分离，也可以从脾脏、肝脏、肾脏、肺、胰腺中得到，尽管其组织来源不同，但是都拥有相似的表型特征。间充质干细胞可通过分泌外泌体的方式携带大量的可溶性因子，执行生物学功能。由于膜性结构的保护，可以防止细胞因子的降解，同时也能够促进目的细胞表面受体与膜的相互作用。近年来多项研究显示间充质干细胞及其旁分泌的外泌体均具有组织修复、免疫抑制、炎症抑制等功能，已广泛应用于肝病、心血管疾病、神经系统疾病等多种领域。

然而，目前尚没有干细胞有效成分提取物的相关研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干细胞有效成分提取物与干细胞外泌体的组合，其制备方法和应用。

在第一方面，本发明提供一种脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合。

在优选的实施方式中，所述脂肪干细胞是人脂肪干细胞。

在具体的实施方式中，所述组合中脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的浓度量使得给予受试者时，给药量达到50-250μg/kg受试者体重，优选90-120μg/kg受试者体重，最优选110μg/kg受试者体重。

在具体的实施方式中，所述组合中脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的浓度比为1:1。

在具体的实施方式中，所述组合中脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的浓度量使得给予受试者时，给药量达到90-120μg/kg受试者体重，优选110μg/kg受试者体重。

在具体的实施方式中，所述脂肪干细胞裂解液通过超声破碎法获得。

在具体的实施方式中，所述超声破碎法为将细胞溶于生理盐水，密度为5×10⁶/ml，使用超声破碎法处理15min。

在优选的实施方式中，所述超声破碎法利用超声破碎机(Misonix,美国)，设置条件为：振幅20，水浴温度为4℃。

在第二方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合和任选的药学上可接受的赋形剂。

在第三方面，本发明提供一种治疗用试剂盒，所述试剂盒装有：

1)第一方面所述的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合或第二方面所述的药物组合物；和

2)将1)所述的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合或药物组合物给予有此需要的对象以治疗疾病的使用说明书。

在优选的实施方式中，所述疾病是急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化，优选急性肝衰竭。

在第四方面，本发明提供第一方面所述的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合在制备药物中的用途。

在具体的实施方式中，所述药物是治疗急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化，优选急性肝衰竭的药物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了人脂肪干细胞的形态；

图2显示了超声破碎法处理ADSC的细胞破碎率以及裂解液蛋白浓度与超声时间的关系；

图3显示了反复冻融法处理ASC的细胞破碎率以及裂解液蛋白浓度与冻融次数的关系；

图4显示了人脂肪干细胞外泌体的粒径分布；

图5-1显示了人脂肪干细胞外泌体的抗体芯片；其中，图片显示FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、EpCAM、ANXA5、TSG101等蛋白均呈弱阳性表达，而GM130呈阴性，空白组中间的黑点疑为芯片质量问题所呈现的污点；

图5-2显示了抗体芯片的灰度值；其中，FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、EpCAM、ANXA5、TSG101的灰度值均高于空白组，而GM130低于空白组；

图6显示了干细胞各提取物成分移植大鼠生存率；其中，A：高、低浓度hASC外泌体移植组(Exo-high、Exo-low)，高、低浓度hASC裂解液移植组(Lys-high、Lys-low)，hASC移植组和PBS对照组大鼠的72小时生存率。其中，与对照组相比，高、低浓度hASC外泌体移植组在不同时间点的生存率对比均表现出显著差异(P<0.05)。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现了破碎人脂肪干细胞的最佳方案，进而发现了干细胞裂解液与干细胞外泌体的组合具有显著的协同效果，其疗效显著高于单用干细胞裂解液或干细胞外泌体；特别是这种组合能够在较低浓度下改善急性肝衰竭大鼠生存率。在此基础上完成了本发明。

脂肪干细胞

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSC)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。它是来源于脂肪组织的一种间充质干细胞，可以分化为间质类细胞，如骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等。ADSC细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。在优选的实施方式中，本文所述的脂肪干细胞是指人源脂肪干细胞。

近年来，多潜能人源脂肪干细胞(hADSC)已成为治疗人类一些严重疾病，如脊髓损伤、脑卒中、急性肝衰竭等的很好的细胞来源。

为了举例和方便的目的，本发明的实施例部分从人体抽脂术得到的脂肪组织中分离人源脂肪干细胞(hADSC)。但本领域公知，可以通过各种来源，包括但不限于商业来源获得人源脂肪干细胞(hADSC)。

外泌体

本文所述的“外泌体”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，是指活细胞分泌的具有脂质双分子层结构的小囊泡。这种外泌体在其表面表达有不同的标志蛋白。

干细胞外泌体可通过携带大量包装过的蛋白质和RNA等，参与免疫调节、减轻炎症反应、促进血管生成、促进受损组织增殖以及细胞凋亡等[30-36]。由于具有内在的靶向特性，可以将其内的蛋白质和RNA直接递送到受体细胞中；并且由于其为自然的细胞产物，可以避免受体巨噬细胞的吞噬作用或降解，避免胞内通路和溶酶体降解，从而在体内循环更长时间。此外，外泌体还可以穿透很多药物难以穿透的血脑屏障。因此，hASC外泌体可以从体外分离，递送到体内针对疾病进行治疗。

脂肪干细胞外泌体及裂解液均为脂肪干细胞提取物，均含大量蛋白及RNA等物质，对肝组织再生及抑制免疫、炎症具有很好的疗效。但两者蛋白质及RNA的种类及含量不完全相同，对急性肝衰竭大鼠的治疗效果也难以发挥完全。另外，干细胞有效成分提取物更利于储存，外泌体为磷脂双分子囊泡，长期保存容易破碎导致活性减弱，如果将干细胞外泌体储存于细胞裂解后所获得的蛋白溶液中，可进一步延长其保存寿命。

为此，本发明提供了一种脂肪干细胞(例如人脂肪干细胞)外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合。这种组合能够在较低浓度下改善急性肝衰竭大鼠生存率，例如，所述组合中脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的浓度量使得给予受试者时，给药量达到50-250μg/kg受试者体重，优选90-120μg/kg受试者体重，最优选110μg/kg受试者体重。在优选的实施方式中，所述组合中脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的浓度比为1:1。

本发明的脂肪干细胞裂解液可以通过超声破碎法获得。本发明人进一步确定了所述脂肪干细胞的最佳破碎方法。例如将细胞溶于生理盐水，密度为5×10⁶/ml，使用超声破碎法处理15min。本领域技术人员基于本发明的教导以及现有技术中的物质手段，例如不同公司的超声破碎机可以适当修改上述范围。在优选的实施方式中，所述超声破碎法利用超声破碎机(Misonix,美国)，设置条件为：振幅20，水浴温度为4℃。

在上述脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合的基础上，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述组合和任选的药学上可接受的赋形剂；或者，提供一种治疗用试剂盒，所述试剂盒装有：上述的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合或药物组合物；和将所述组合或药物组合物给予有此需要的对象以治疗疾病的使用说明书。

本发明的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合或药物组合物或治疗试剂盒可用于治疗急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化，优选急性肝衰竭等疾病。

本发明的主要优点包括：

1.本发明首次确定了破碎人脂肪干细胞的最佳方案，从而能够得到人脂肪干细胞的有效成分的提取液；

2.本发明首次发现了人脂肪干细胞的裂解液与人脂肪干细胞外泌体联用能够显著提高治疗效果；

3.本发明的人脂肪干细胞的裂解液与人脂肪干细胞外泌体的组合中二者为1:1的比例时，能够在低浓度下实现单独使用人脂肪干细胞的裂解液或人脂肪干细胞外泌体时在高浓度才能实现的100％的72小时存活率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

实施例1.人脂肪干细胞的分离与培养

将健康人体脂肪组织用PBS缓冲液清洗3遍，至PBS缓冲液清澈为止，用组织剪将脂肪组织剪成约为1mm3的小块。0.1％胶原酶I于37℃水浴消化30分钟后置于离心机中，1200转离心5分钟后留取细胞沉淀，用适量PBS缓冲液重悬后再次以上述条件离心。将细胞沉淀加入含有10％胎牛血清的F12/DMEM培养基中，放入10cm培养皿中培养，密度为1×10⁶/ml，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中，48h后换液，观察细胞生长至80％时，0.25％胰酶消化后按1:3传代培养，培养至P3代留取后续实验使用。

分离和培养的人脂肪干细胞的形态学观察结果为：原代人脂肪干细胞在培养扩增的过程中，P2代以后细胞维持成纤维样形态，大小均一且排列紧密，呈漩涡状或放射状生长(如图1所示，在显微镜下观察到人脂肪干细胞的形态呈长梭形，排列紧密)。

实施例2.ADSC细胞裂解液的收集

本发明人进一步考察了ADSC细胞裂解液的收集方法。考虑到细胞在不同渗透浓度(如在生理盐水和蒸馏水)下破碎速率也不同，通常低渗溶液(蒸馏水)会加速细胞膨胀破裂，因此考察的方法均设置了不同的溶剂分组，即，溶于生理盐水和蒸馏水。

1.超声破碎法

将3种不同密度(依次为密度a：4×10⁶个/ml、密度b：2×10⁶个/ml及密度c：1×10⁶个/ml)的待处理ADSC分成生理盐水组和蒸馏水组，超声破碎机(Misonix,美国)设置条件为：振幅20，水浴温度为4℃，观察总时间为33min，细胞破碎前后台盼蓝(Solarbio,Beijing,中国)染色，显微镜下计算细胞破碎率，每次计数时间点平行计数4次。随后将不同破碎时间点下的ADSC以10000g/min离心5min后取上清液检测蛋白浓度，加入BCA试剂(Solarbio)在37℃温箱中孵育15min，酶标仪下(SpectraMax M5；Molecular Devices,美国)562nm处读出相应的吸光度并计算蛋白浓度。

图2显示了超声破碎法处理ADSC的细胞破碎率以及裂解液蛋白浓度与超声时间的关系；其中，(A)细胞溶于生理盐水中时采用超声破碎法后所得细胞破碎率与超声时间的关系；(B)细胞溶于蒸馏水中时采用超声破碎法后所得细胞破碎率与超声时间的关系；(C)细胞溶于生理盐水中时采用超声破碎法后所得裂解液蛋白浓度与超声时间的关系；和(D)细胞溶于蒸馏水中时采用超声破碎法后所得裂解液蛋白浓度与超声时间的关系。

从图2中的细胞破碎曲线可以看出，在蒸馏水中，密度c的细胞在1min时的破碎率已经达到95％以上，密度a的细胞则在10min时破碎率达到98.25％，3个密度的细胞随着破碎时间的延长破碎率均不断升高；在生理盐水中也观察到了相似的现象。这说明在相同溶质中，细胞密度越高、破壁所需时间越长，单位时间破碎率越低；随着破碎时间的延长，细胞破碎率明显增大。

对比不同溶质的情况，发现细胞处于蒸馏水中3种密度的细胞破碎均比同密度下的生理盐水中破碎快，例如密度b在蒸馏水中达到完全破碎(＞98％)约需10min，而在生理盐水中则需要13min。这说明超声法时相同细胞密度在蒸馏水中的破碎率要快于生理盐水。

利用BCA法测定的蛋白浓度曲线可以看出，随着超声时间的延长，两种溶质中裂解液的蛋白浓度大致呈上升趋势，其中细胞在生理盐水中破碎时各个时间点的蛋白浓度明显要高于蒸馏水。为及时保持细胞内容物的蛋白活性，本发明人比较了各种密度的细胞在达到刚刚完全破碎时的蛋白浓度，结合细胞破碎曲线，发现细胞在生理盐水中达到完全破碎时，3个密度的蛋白浓度分别为0.573mg/ml、0.277mg/ml和0.114mg/ml，均高于同一密度细胞在蒸馏水中完全破碎时的蛋白浓度。

2.反复冻融法

将3种不同密度的生理盐水组和双蒸水组ADSC反复冻融数次。冻融条件为：-80℃冰箱中冷冻30min达到完全冷冻，随后室温(25℃)下融解至完全解冻。细胞破碎前后台盼蓝染色，显微镜下计算细胞破碎率，每次计数时间点平行计数4次。每次均取出裂解液作蛋白浓度的测定，方法同超声破碎法。

图3显示了反复冻融法处理ASC的细胞破碎率以及裂解液蛋白浓度与冻融次数的关系；其中，(A)细胞溶于生理盐水中时采用反复冻融法后所得细胞破碎率与冻融次数的关系；(B)细胞溶于蒸馏水中时采用反复冻融法后所得细胞破碎率与冻融次数的关系；(C)细胞溶于生理盐水中时采用反复冻融法后所得裂解液蛋白浓度与冻融次数的关系；(D)细胞溶于蒸馏水中时采用反复冻融法后所得裂解液蛋白浓度与冻融次数的关系。

从反复冻融法的细胞破碎曲线来看，在蒸馏水中，3种密度的细胞在第1次冻融结束后均能达到95％以上的破碎率，2次冻融结束后几乎均达到完全破碎；在生理盐水中，第1次冻融结束后密度a的破碎率仅有14％，而密度c已达到87.88％，随着冻融次数的增加，细胞的破碎率也逐渐增高。这说明反复冻融法的细胞破碎同样符合超声法的规律。对比不同溶质可以发现细胞处于蒸馏水中冻融后的破碎速率明显要高于生理盐水。

从BCA法测定的蛋白浓度曲线中可以看出，随着冻融次数的增加，不同溶质中的细胞裂解液的蛋白浓度均呈升高趋势，本发明人同样比较各个条件下细胞刚刚达到完全破碎时的蛋白浓度，发现生理盐水高于蒸馏水。

综合分析各项结果，获得裂解液的最佳方式为将细胞溶于生理盐水，密度为5×10⁶/ml，使用超声破碎法处理15min可获得最大破碎率以及最大蛋白浓度。

实施例3.人脂肪干细胞外泌体的提取

取P3代人脂肪干细胞复苏，首先用含有10％FBS的DMEM/F12培养基培养，待其生长至70％以上时换用无血清的基础培养基继续培养24h，培养过程在37℃，5％CO2的恒温温箱中进行；24h后将空白培养基收集至离心管中，0.22μm的过滤器过滤后转移到100KD的超滤浓缩离心管中，以4000g/min、4℃的条件下离心40min，收集浓缩液；培养皿中的细胞根据细胞密度以适当比例传代培养至P4代，待其生长至80％以上时按照上述方法再次收集人脂肪干细胞外泌体，所收集的人脂肪干细胞外泌体均放置在-80℃冰箱中储存备用。

实施例4.粒度仪(NS300)检测人脂肪干细胞外泌体

将样品外泌体制成1mL合适浓度的溶液，打开NS300软件，将样品注射入样品槽，注满为止，调整软件参数使视频清晰，点开软件中的RUN键，收集需要的数据。

利用粒度仪检测到收集人脂肪干细胞外泌体的大小如图4所示，横坐标代表直径范围，纵坐标代表人脂肪干细胞外泌体的浓度/强度。从图4可以看出，粒度仪检测到人脂肪干细胞外泌体的大小参数：人脂肪干细胞外泌体的平均大小和浓度/强度均通过粒子追踪软件检测得到，曲线描述了粒子大小(横轴)和浓度/强度分布(纵轴)的关系，可以看到大部分的人脂肪干细胞外泌体大小均在30-150nm之间。

实施例5.抗体芯片检测人脂肪干细胞外泌体所含的蛋白质

超滤浓缩离心法收集到的外泌体样品加入抗体芯片检测试剂盒中的外泌体裂解液，再与外泌体芯片结合缓冲液混合并滴加在芯片上，2-8℃的摇床上放置过夜，洗涤3次后，加2抗孵育半小时，洗涤3次，将芯片取出，滴加显色液后，置于化学发光成像系统中拍照。

抗体芯片检测人脂肪干细胞外泌体蛋白的结果为：抗体芯片显示人脂肪干细胞外泌体特殊蛋白FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、EpCAM、ANXA5、TSG101均为弱阳性，而GM130呈阴性表达，空白组中间的黑点疑为芯片质量问题所呈现的污点(见图5-1)；

蛋白芯片的灰度值柱形图也显示FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、EpCAM、ANXA5、TSG101的灰度值均高于空白组，而GM130的灰度值低于空白组(见图5-2)。

实施例6.干细胞有效成分提取物的制备

分别在干细胞裂解液和外泌体中加入BCA试剂(Solarbio)在37℃温箱中孵育15min，酶标仪下(SpectraMax M5；Molecular Devices,美国)562nm处读出相应的吸光度并计算蛋白浓度。分别取100ug裂解液和外泌体混合，储存于-80℃。

实施例7.干细胞裂解液或外泌体在急性肝衰竭大鼠模型中的疗效

D-gal+LPS诱导的急性肝衰竭大鼠动物模型的构建

选用健康雄性SPF级Sprague Dawley(SD)大鼠21只，7周龄，体重180g左右。一次性腹腔内注射0.8g/kg D-氨基半乳糖和5ug/kg LPS建立急性肝衰竭模型。

干细胞各提取物成分移植

大鼠急性肝衰竭模型建立后24h，将急性肝衰竭模型大鼠随机分为6组，分别经髂静脉移植低浓度hASC外泌体(20μg/只)、高浓度hASC外泌体(100μg/只)、低浓度裂解液(20μg/只)、高浓度裂解液(100μg/只)、hASC(2×10⁶个细胞/只)以及PBS作为对照。

72h总体生存率：腹腔注射D-gal造模24h后，经髂静脉分别注射高浓度hASC外泌体(100μg/只)、低浓度hASC外泌体(20μg/只)和PBS，72h总体生存率分别为100％、62.5％和10％；高浓度hASC裂解液(100μg/只)、低浓度hASC裂解液(20μg/只)、hASC(2×10⁶个细胞/只)，72h总体生存率分别为50％、25％和37.5％。各组之间在不同时间点的生存率对比均表现出显著差异(P<0.05)。

实施例8.干细胞裂解液与外泌体的组合在急性肝衰竭大鼠模型中的疗效

本发明人进一步重复了实施例8，不同之处是采用干细胞裂解液与外泌体的组合，而非分别采用干细胞裂解液与外泌体。

在经髂静脉给急性肝衰竭模型大鼠移植hASC外泌体和裂解液(1:1)的组合以及PBS作为对照，各组合中hASC外泌体和裂解液的浓度分别为10μg/只、20μg/只、40μg/只、60μg/只和80μg/只。

72h总体生存率分别为50％、100％、100％、100％和100％。这是非常出乎意料的，因为在各组合中hASC外泌体和裂解液的浓度分别为20μg/只的情况下即实现了高浓度hASC外泌体(100μg/只)能够达到的100％的72h总体生存率。

实施例9.干细胞裂解液与外泌体的组合在急性肝衰竭大鼠模型中的疗效

本发明人进一步重复了实施例9，不同之处是改变了干细胞裂解液与外泌体的组合中干细胞裂解液与外泌体的含量比。在各组合中，hASC外泌体的浓度如实施例8所述，裂解液的浓度减半；或者，裂解液的浓度如实施例8所述，hASC外泌体的浓度减半。

72h总体生存率分别为40％、70％、100％、100％和100％；以及30％、50％、80％、100％和100％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合，所述脂肪干细胞外泌体及脂肪干细胞裂解液均为脂肪干细胞提取物。

2. 如权利要求1所述的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合，其特征在于，所述组合中脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的浓度比为1: 1。

3.如权利要求1或2所述的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合，其特征在于，所述脂肪干细胞裂解液通过超声破碎法获得。

4. 如权利要求3所述的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合，其特征在于，所述超声破碎法为将细胞溶于生理盐水，密度为5×10⁶/ml，使用超声破碎法处理15 min。

5.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-4中任一项所述的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合和任选的药学上可接受的赋形剂。

6. 一种治疗用试剂盒，所述试剂盒装有：

1) 权利要求1-4中任一项所述的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合或权利要求5所述的药物组合物；和

2) 将1)所述的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合或药物组合物给予有此需要的对象以治疗疾病的使用说明书。

7.权利要求1-4中任一项所述的脂肪干细胞外泌体与脂肪干细胞裂解液的组合在制备药物中的用途；

所述药物是治疗急性肝衰竭的药物。

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