CN114159375A - 一种用于护肤品制剂的干细胞破碎液的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于护肤品制剂的技术领域，具体涉及一种用于护肤品制剂的干细胞破碎液的制备方法及应用。其制备为通过动物脂肪，离心除去水分和油分，在得到的脂肪滤渣中加入胶原酶进行消化，离心、清洗，得到含有脂肪干细胞的SVF细胞团，之后播种培养分离干细胞与培养基，将获得的细胞破碎液以及浓缩培养基混合，即得到干细胞破碎液。本发明通过除去细胞膜结构，从而释放出生物活性物质如生长因子、磷脂分子和细胞外泌体囊泡等，均为能够穿过皮肤细胞膜的小分子物质，并采用所制备的培养基进行培养，保留小分子物质的生物活性，应用于护肤制剂中，能起到相应的修复效果。

Description

一种用于护肤品制剂的干细胞破碎液的制备方法及应用
技术领域
本发明属于护肤品制剂的技术领域，具体涉及一种用于护肤品制剂的干细胞破碎液的制备方法及应用。
背景技术
干细胞例如脐带干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞等具有较好的组织修复活性，一方面干细胞可以进行多向分化补充源头细胞来达到修复功能，另一方面，干细胞可以释放多种生长因子，如转化生长因子(TGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF) 的等启动组织修复。
干细胞应用在美容领域一直在探索阶段，曾有专家将脂肪干细胞注射在面部，但是预期效果并不理想，原因是干细胞的多向分化功能难以控制。也有人运用干细胞培养基进行提纯注射，然而，其安全和有效性始终难以足够得到保证。干细胞类护肤品目前由于技术手段限制的原因，一直没有得到很好的发展，然而，将干细胞制备成相应的皮肤外用护肤品，可以在很大程度上减少干细胞带来的安全隐患，并且能够很好地发挥它们的作用红利。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于护肤品制剂的干细胞破碎液的制备方法及应用，
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种用于护肤品制剂的干细胞破碎液的制备方法，包括如下步骤：
1)选取哺乳动物的脂肪，全程采用生理盐水清洗，通过离心除去水分和油分，在得到的脂肪滤渣中加入Ⅰ型胶原酶进行消化，离心、清洗，得到含有脂肪干细胞的SVF细胞团；
2)将SVF细胞团P0代进行细胞重悬，之后播种于培养瓶中进行扩增培养，得到P1代，之后进行换代培养，并将每次换下来的培养基收集起来，最后除去培养基，得到干细胞，将收集到的培养基置于低温冻干机中进行浓缩，浓缩至10～15倍，得到浓缩培养基；
3)将步骤2)得到的干细胞放置于生理盐水中形成浓度为(1～5) ×108/mL的混悬液，置于低温环境中，进行超声波破碎，作用时间 9～11s间隔4～5s，总时长8～12min，频率280～330Hz，即获得细胞破碎液，经滤菌器进行过滤，再通过核酸酶去除具有抗原性的核酸成分；不加入任何外来物质，将干细胞培养基进行冷藏冻干浓缩，最后加入核酸酶去除整体溶液的具有抗原性的核酸物质，进行均质搅拌，再进行浓缩得到浓缩培养基，从而解决干细胞破碎液后续的免疫排斥的问题。
将获得的细胞破碎液以及浓缩培养基混合，即得到干细胞破碎液。
步骤1)所述离心的条件为转速为800～1000r/min，时间为 8～12min；
步骤2)所述细胞重悬为采用10～12％胎牛血清或者10～12％人血清，之后接种在T75的培养瓶中；
经过破碎以后，得到细胞内部以及细胞培养基中的多种活性因子，比如说生长因子，细胞外泌体，其中像细胞外泌体，它具有膜结构，分子小，比较容易穿过皮肤发挥作用。直接得到内部及培养基中多种活性分子，而且作为护肤品使用，限制性很小，去除免疫原性，是一种含有多种具有活性的蛋白质、脂质、糖类的复合物质。
本发明还提供了一种上述所制备的干细胞破碎液，应用于制备护肤品，包括护肤水、护肤乳、精华液以及保湿霜；
所述护肤水的组成以及质量占比为：上述干细胞破碎液1～5％、卵磷脂1～2％、蓖麻油0.1～0.3％、角鲨烷0.1～0.3％、维生素E 0.05～0.1％、硫酸软骨素钠0.01％、山梨醇3～5％、PEG20000 3～5％、维生素B 0.01～0.05％、维生素C 0.01～0.05％、调香精油适量，去离子水加满至 100；
所述护肤乳为抗过敏乳，其组成以及质量占比为：上述干细胞破碎液3～5％、柠檬酸钠0.5～1％、丁二醇10～15％、氢化卵磷脂10％、胆固醇3～5％、神经酰胺0.5～1％、泛醌3～5％、厚朴酚3～5％、调香精油适量，去离子水加满至100；
所述精华液的组成以及质量占比为：上述干细胞破碎液5～10％、甘油1～3％、1,2-戊二醇2～4％、1,2-乙二醇0.5～1％、EDTA-Na2 0.03～0.05％、丁二醇8～10％、卡波姆0.3～0.5％、精氨酸0.3～0.5％、玫瑰花水20％、海藻糖1～3％、甘油0.3～0.5％、甘草酸二钾0.03～0.05％、乳酸杆菌1～2％、莲胚芽提取物1～2％、去离子水加满至100；
所述保湿霜的组成以及质量占比为：上述干细胞破碎液5～20％、蜂蜡10～15％、卵磷脂1～2％、羊毛脂1～2％、C16醇3～5％、胚芽油 10～12％、植物抗氧化剂0.3～0.5％、硼砂1～2％、甘油3～5％，调香精油适量，去离子水加满至100。
本发明的有益效果如下：
本发明的一种用于护肤品制剂的干细胞破碎液及制备方法，通过除去细胞膜结构，从而释放出生物活性物质如生长因子、磷脂分子和细胞外泌体囊泡等，包括葡萄糖、维生素(B,C,PP等)、生长因子 VEGF、PDGF、TGF、活性酶SOD、谷胱甘肽、总蛋白量、细胞囊泡以及外泌体等分子，均为能够穿过皮肤细胞膜的小分子物质，并采用所制备的培养基进行培养，保留小分子物质的生物活性，应用于护肤制剂中，能起到相应的修复效果；
所制备的干细胞破碎液应用于制备护肤制剂，由于小分子物质更易于渗入皮肤，所采用的干细胞破碎液有助于促进皮肤组织的修复，配合其它护肤成分的使用，引导其它护肤成分的渗入，进一步实现护肤制剂的相应护肤效果，如护肤水的使用，有助于美白、保湿、嫩肤功效的发挥；如乳液的使用，有助于提高皮肤的过敏修复以及抗过敏能力；如精华液的使用，进一步促进对皮肤的舒缓镇定；如面霜的使用，增强美白以及保湿的能力。
附图说明
图1为志愿者A使用了实施例4护肤水的皮肤状况对比图；
图2为志愿者B使用了实施例5护肤乳的皮肤状况对比图；
图3为志愿者C使用了实施例6精华乳的皮肤状况对比图；
图4为志愿者D使用了了实施例4～实施例7所述护肤品之后的皮肤状况。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1
一种用于护肤品制剂的干细胞破碎液的制备方法：
1)选取哺乳动物的脂肪，全程采用生理盐水清洗，通过离心除去水分和油分，转速为900r/min，时间为10min，在得到的脂肪滤渣中加入0.1wt％Ⅰ型胶原酶进行消化，离心、清洗，得到含有脂肪干细胞的SVF细胞团；
2)将SVF细胞团P0代采用10％胎牛血清进行细胞重悬，之后播种于T75培养瓶中进行扩增培养，得到P1代，之后进行换代培养，并将每次换下来的培养基收集起来，培养至P6代，最后除去培养瓶，得到干细胞，将收集到的培养基置于低温冻干机中进行浓缩，浓缩至12倍，得到浓缩培养基；
3)将步骤2)得到的干细胞放置于生理盐水中形成浓度为3×108/mL的混悬液，置于低温环境中，进行超声波破碎，作用时间 10s间隔4s，总时长10min，频率300Hz，即获得细胞破碎液，经滤菌器进行过滤，再通过核酸酶去除具有抗原性的核酸成分；
将获得的细胞破碎液以及浓缩培养基混合，即得到干细胞破碎液，在得到干细胞破碎液中加入0.02mol/L EDTA和0.3％传明酸。
实施例2
一种用于护肤品制剂的干细胞破碎液的制备方法：
1)选取哺乳动物的脂肪，全程采用生理盐水清洗，通过离心除去水分和油分，转速为800r/min，时间为12min，在得到的脂肪滤渣中加入0.1wt％的Ⅰ型胶原酶进行消化，离心、清洗，得到含有脂肪干细胞的SVF细胞团；
2)将SVF细胞团P0代采用12％胎牛血清进行细胞重悬，之后播种于T75培养瓶中进行扩增培养，得到P1代，之后进行换代培养，并将每次换下来的培养基收集起来，培养至P6代，最后除去培养瓶，得到干细胞，将收集到的培养基置于低温冻干机中进行浓缩，浓缩至10倍，得到浓缩培养基；
3)将步骤2)得到的干细胞放置于生理盐水中形成浓度为 1×108/mL的混悬液，置于低温环境中，进行超声波破碎，作用时间 9s间隔4s，总时长12min，频率330Hz，即获得细胞破碎液，经滤菌器进行过滤，再通过核酸酶去除具有抗原性的核酸成分；
将获得的细胞破碎液以及浓缩培养基混合，即得到干细胞破碎液，在得到干细胞破碎液中加入0.02mol/L EDTA和0.5％传明酸。
实施例3
一种用于护肤品制剂的干细胞破碎液的制备方法：
1)选取哺乳动物的脂肪，全程采用生理盐水清洗，通过离心除去水分和油分，转速为1000r/min，时间为8min，在得到的脂肪滤渣中加入0.1wt％Ⅰ型胶原酶进行消化，离心、清洗，得到含有脂肪干细胞的SVF细胞团；
2)将SVF细胞团P0代采用10％人血清进行细胞重悬，之后播种于T75培养瓶中进行扩增培养，得到P1代，之后进行换代培养，并将每次换下来的培养基收集起来，培养至P6代，最后除去培养瓶，得到干细胞，将收集到的培养基置于低温冻干机中进行浓缩，浓缩至 15倍，得到浓缩培养基；
3)将步骤2)得到的干细胞放置于生理盐水中形成浓度为 5×108/mL的混悬液，置于低温环境中，进行超声波破碎，作用时间 11s间隔5s，总时长8min，频率280Hz，即获得细胞破碎液，经滤菌器进行过滤，再通过核酸酶去除具有抗原性的核酸成分；
将获得的细胞破碎液以及浓缩培养基混合，即得到干细胞破碎液，在得到干细胞破碎液中加入0.03mol/L EDTA和0.1％传明酸。
检测实施例1～3所获得的干细胞破碎液中的营养物质：
表1干细胞破碎液中的营养物质(mg/mL)
Figure BDA0003433206320000071
Figure 1
所述葡萄糖能够提供能量，维生素主要参与细胞的多种活性功能有关，可以促进细胞活性表达，生长因子可以促进细胞的增殖和活性，可以让肌肤重现年轻化状态，可以促进受损肌肤修复，SOD和谷胱甘肽均具有良好的抗衰性能，可以阻止细胞的氧化受损，细胞囊泡含有多种与细胞生命活动相关的活性成分，可以包裹活蛋白或者多糖，组织其活性丧失从而发挥更好的作用，除此以外，细胞囊泡和外泌体因为外层的脂质结构，可以很好地进入细胞内部发挥作用。
实施例4
一种干细胞破碎液应用于制备护肤水：
表2护肤水配方
Figure BDA0003433206320000082
Figure BDA0003433206320000091
如图1所示，为志愿者A是使用了A组护肤水一段时间之后的皮肤情况，其皮肤色素沉淀的问题有所改善，左图为改善之后的检测图。
实施例5
一种干细胞破碎液应用于制备护肤乳：
表3护肤乳配方
Figure BDA0003433206320000092
Figure BDA0003433206320000101
如图2所示，为志愿者B是使用了A组护肤乳一段时间之后的皮肤情况，可见，其皮肤粗糙问题有所改善，并且效果显著。
实施例6
一种干细胞破碎液应用于制备精华液：
表4精华液配方
Figure BDA0003433206320000102
Figure BDA0003433206320000111
如图3所示，为志愿者C是使用了A组精华液一段时间之后的皮肤情况，皮肤色素沉着问题达到较为显著的改善效果。
实施例7
一种干细胞破碎液应用于制备保湿霜：
表5保湿霜配方
Figure BDA0003433206320000112
利用无菌超声波头依次倒入实施例4～实施例7的产品，每种产品操作时间为3～5min，选取1名志愿者对其面部进行以上产品的依次使用；
如图4所示，为志愿者D使用产品后的面部状态效果呈现，可见各个指标的数值均有所提高，志愿者的皮肤毛孔、色斑、皮肤纹理、粗糙度、粉刺、色素、水分、紫外线斑的数值的改善程度均为提升趋势，其所示指标均为改善程度，表明指标提高，效果越好，并且效果显著。

Claims (9)

1.一种用于护肤品制剂的干细胞破碎液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)选取哺乳动物的脂肪，全程采用生理盐水清洗，通过离心除去水分和油分，在得到的脂肪滤渣中加入Ⅰ型胶原酶进行消化，离心、清洗，得到含有脂肪干细胞的SVF细胞团；
2)将SVF细胞团P0代进行细胞重悬，之后播种于培养瓶中进行扩增培养，得到P1代，之后进行换代培养，并将每次换下来的培养基收集起来，最后除去培养瓶，得到干细胞，将收集到的培养基置于低温冻干机中进行浓缩，浓缩至10～15倍，得到浓缩培养基；
3)将步骤2)得到的干细胞放置于生理盐水中形成浓度为(1～5)×108/mL的混悬液，置于低温环境中，进行超声波破碎，作用时间9～11s间隔4～5s，总时长8～12min，频率280～330Hz，即获得细胞破碎液，经滤菌器进行过滤，再通过核酸酶去除具有抗原性的核酸成分；
将获得的细胞破碎液以及浓缩培养基混合，即得到干细胞破碎液。
2.由权利要求1所述的干细胞破碎液的制备方法，其特征在于，步骤1)所述离心的条件为转速为800～1000r/min，时间为8～12min。
3.由权利要求1所述的干细胞破碎液的制备方法，其特征在于，步骤2)所述细胞重悬为采用10％胎牛血清或者人血清，之后接种在T75的培养瓶中。
4.由权利要求1所述的干细胞破碎液的制备方法，其特征在于，步骤3)中在得到干细胞破碎液中加入0.02～0.03mol/L EDTA和0.1～0.5％传明酸。
5.一种权利要求1～5任一项所述干细胞破碎液应用于制备护肤品，其特征在于，包括护肤水、护肤乳、精华液以及保湿霜。
6.由权利要求6所述的干细胞破碎液应用于制备护肤品，其特征在于，所述护肤水的组成以及质量占比为：权利要求1所述干细胞破碎液1～5％、卵磷脂1～2％、蓖麻油0.1～0.3％、角鲨烷0.1～0.3％、维生素E 0.05～0.1％、硫酸软骨素钠0.01％、山梨醇3～5％、PEG20000 3～5％、维生素B 0.01～0.05％、维生素C 0.01～0.05％、调香精油适量，去离子水加满至100。
7.由权利要求6所述的干细胞破碎液应用于制备护肤品，其特征在于，所述护肤乳为抗过敏乳，其组成以及质量占比为：权利要求1所述干细胞破碎液3～5％、柠檬酸钠0.5～1％、丁二醇10～15％、氢化卵磷脂10％、胆固醇3～5％、神经酰胺0.5～1％、泛醌3～5％、厚朴酚3～5％、调香精油适量，去离子水加满至100。
8.由权利要求6所述的干细胞破碎液应用于制备护肤品，其特征在于，所述精华液的组成以及质量占比为：权利要求1所述干细胞破碎液5～10％、甘油1～3％、1,2-戊二醇2～4％、1,2-乙二醇0.5～1％、EDTA-Na20.03～0.05％、丁二醇8～10％、卡波姆0.3～0.5％、精氨酸0.3～0.5％、玫瑰花水20％、海藻糖1～3％、甘油0.3～0.5％、甘草酸二钾0.03～0.05％、乳酸杆菌1～2％、莲胚芽提取物1～2％、去离子水加满至100。
9.由权利要求6所述的干细胞破碎液应用于制备护肤品，其特征在于，所述保湿霜的组成以及质量占比为：权利要求1所述干细胞破碎液5～20％、蜂蜡10～15％、卵磷脂1～2％、羊毛脂1～2％、C16醇3～5％、胚芽油10～12％、植物抗氧化剂0.3～0.5％、硼砂1～2％、甘油3～5％，调香精油适量，去离子水加满至100。
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