CN106282264A - 一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，以动植物提取及再加工油类为原料，包括原料油类的水解方法、槐糖脂的发酵方法和萃取分离方法，运用于化妆品生产具有更好的生发、抗脱发作用，且天然无毒害，并能促进细胞增值，加强细胞新陈代谢，有助于毛发生长。

Description

一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法
技术领域
本发明涉及化妆品领域，尤其是涉及一种以动植物提取及再加工油类为原料的槐糖脂的生产方法。
背景技术
槐糖脂是一类可降解的生物表面活性剂，由科学家Spencer在1954年首次发现，目前国际上对槐糖脂的理论研究及应用开发已开展多年，而我国如今在该领域的发展仍处于起步阶段。
生物表面活性剂是天然表面活性剂的一种，是微生物在一定培养条件下产生的集亲水性和亲油性结构于一体的代谢产物。生物表面活性剂不仅具有增溶、乳化、润湿、发泡、分散、降低表面张力等表面活性剂所共有的性能，还具有无毒、可生物降解、生态安全以及高表面活性等优点，因此在工业生产中起着举足轻重的作用。
槐糖脂为糖脂系生物表面活性剂，由于糖脂系生物表面活性剂具有天然无毒、生物可降解、环境友好的特点，使其在环境保护、食品、化妆品、洗涤剂及医药等方面显示出了良好的研究价值和应用前景。而其中槐糖脂结构稳定性高，可制得各种衍生物，在糖脂系生物表面活性剂中最具有应用前景，目前已广泛应用于日化、食品工业、石油工业等领域。
槐糖脂由亲水性的槐糖（2个葡萄糖分子以β-1，2糖苷键结合）和疏水性的饱和或不饱和的长链ω-（或ω-1）羟基脂肪酸两部分构成。不同结构的槐糖脂具有不同的理化性质。已知槐糖脂主要有2种类型：内酯型和酸型。内酯型槐糖脂能较好的降低表面张力且抗菌活性较强；而酸型槐糖脂有较好的泡沫形成能力和溶解性，乙酰基基团能够降低槐糖脂的亲水性，增强其抗病毒能力。
槐糖脂的作用：作为表面活性剂的一种，槐糖脂具有一般表面活性剂所具有的作用：
(1)乳化作用
油脂在水中表面张力大，不溶于水，即使用力搅拌，静置后又会重新分层。而如果向水中加入表面活性剂，搅拌静置后却不易分层，这就是乳化作用。
化妆品在生产膏霜、乳液时离不开表面活性剂的乳化作用。
(2)增溶作用
表面活性剂在水溶液中形成胶束后能明显提高不溶或微溶于水的有机化合物的溶解度，且形成的溶液呈透明状，这种作用称为增溶作用。
化妆品生产中化妆水、生发油、生发养发剂的生产增依赖于表面活性剂的增溶作用。
(3)分散作用
在水中的灰尘和污粒等固体粒子比较容易聚集在一起发生沉降，加入表面活性剂分子能使固体粒子聚集体分割成细小的微粒，使其分散悬浮在溶液中，起到促使固体粒子均匀分散的作用。
化妆品中的遮瑕和防晒产品需要表面活性剂的分散作用。
(4)泡沫作用
活性剂的定向吸附作用使气液两相间的表面张力降低从而形成泡沫。一般低分子活性剂容易发泡，高分子活性剂泡沫少。
(5)润湿作用
当液体与固体表面接触时，气体被排斥，原来的固-气界面消失，代之以固-液界面，这种现象称为润湿。从普遍意义而言，润湿是一种流体被另一种流体自表面取代的过程。当水溶液中加入表面活性剂时，被接触面上的表面张力大大降低，从而达到润湿目的。
此外，槐糖脂还具有其它功效：
(6)抗菌作用
槐糖脂经实验证明对枯草芽孢杆菌、木糖葡萄球菌、变异链球菌有较好抗菌活性；对霉菌和腐霉菌有生长抑制作用；对多种细菌和真菌有良好的生长抑制作用。
(7)抗炎作用
实验研究表明槐糖脂通过调节一氧化氮、粘附因子和炎症细胞因子的生成，能减少实验鼠败血性腹膜炎模型中脓毒症的死亡率；槐糖脂作用于骨髓瘤细胞系U266，可以降低IgE失调疾病的产生。
(8)原材料
槐糖脂还可以作为ω和ω-1羟基脂肪酸和槐糖的原材料。在香水行业中，槐糖脂的疏水部分-羟基脂肪酸可通过内酯化反应合成大环脂类，或者作为多聚反应中的单体，这些自然界难以得到的脂肪酸分子可以通过酸或者酶（比如柚苷酶）分解槐糖脂分子来获得。槐糖脂还可以诱导红褐肉座菌产
生纤维素酶。
槐糖脂作为天然表面活性剂的一种，不仅具有表面活性剂的一般作用，还有很多其他功效。此外，槐糖脂还可以刺激皮肤真皮层纤维细胞代谢和胶原重新合成，减少皮下脂肪储存，适合用于化妆品中。然而，由于槐糖脂生产过程中存在转化率低、分离难度大等问题，大部分研究还停留在实验室阶段。因此，需要对槐糖脂工业化生产进行进一步研究探索，扩大其应用范围，并最终应用于日常生活。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法。
本发明采用的技术方案是：
一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，包括原料油类的水解方法、槐糖脂的发酵方法和萃取分离方法，其中，所述原料油类的水解方法包括如下步骤：
步骤1：将摇瓶培养基原料置于烧杯中并利用纯化水进行溶解，溶解之后平均分装至摇瓶，然后每个摇瓶中添加原料油类并调节pH为8-9，灭菌得到摇瓶培养基，其中摇瓶培养基原料按重量份由如下原料组成：葡萄糖28-32份、酵母提取物14-16份、KH2PO40.9-1.4份、CaCl20.1-0.4份、氯化钠1-2份、硫酸镁1.5-4份、氢氧化钾2-5份，纯化水的用量为摇瓶培养基原料重量的4-5倍，原料油类添加量为每个摇瓶装瓶量的28-32%；
步骤2：将试管生物酶菌分离接入摇瓶培养基中，用透气棉塞封口，放入恒温培养振荡器中，转速150rpm，培养温度30℃，培养7天，得到水解油类粗品，将水解油类粗品常温放置12h熟成，把摇瓶中的物料转到分液漏斗里面分离，放下下层水层去除盐分和其它营养成分，上层即为水解油类；
步骤3：将水解油类经水洗一次，加入乙醇，溶解水解油类，其中，乙醇的用量为发酵所投入原料油类质量的0.3倍，然后，通过纯化树脂柱去除异味并调节pH至4.5-6.5，收集液体；
步骤4：将收集的液体，第一次加入活性炭，常温搅拌12h后快速滤纸过滤，再用慢速滤纸过滤收集滤液，滤液第二次加入活性炭，常温搅拌12h后先用快速滤纸过滤再用慢速滤纸过滤，再用1um滤纸过滤，再用0.45um滤纸过滤，再用0.22um滤纸过滤收集滤液，将收集的滤液经50℃减压浓缩完全并去除水分，用0.22um滤纸过滤除菌，得到水解油类成品。
所述槐糖脂的发酵方法包括如下步骤：
步骤5：在锥形瓶中加入纯水，按2.1%加入YM Broth培养基，超声震荡溶解后，用透气棉塞封口，用铝箔包好，高压蒸汽灭菌30min，温度为121℃，在超净台中冷却至27℃后接入3%冷藏酵母菌，塞上棉塞，放入摇床，转速180rpm、27℃培养48h；
步骤6：配制产业化培养基加入发酵罐中，准备碱液和消泡剂，装入碱液瓶与消泡剂瓶中，与发酵罐一起用铝箔包好，温度为121℃，高压蒸汽灭菌30min，灭完菌后装好发酵罐与碱液瓶、消泡剂瓶，待培养基冷却后从接种口接入已摇床培养48h的酵母菌液，开始发酵，发酵期间pH值控制在4,转速300rpm，通风0.5vvm；
步骤7：每天从取样口取样，对培养液的pH值、含糖量进行测量，并通过吸光度的测试确定菌种生长情况，当菌种度过调整期进入对数期后加入发酵原料——10%动植物油类，不再进行pH值控制，转速450rpm，通风0.75vvm，含糖量控制在3%--4%；
所述萃取分离阶段包括以下步骤：
步骤8：在加入动植物油类后，每天从取样口取样10ml，加入等体积正己烷震荡分层，取上清液50℃浓缩至干，称量得出重量即为样品中动植物油类含量，再向下层液中两次加入等体积乙酸乙酯震荡分层，将两次所得上层液合并，50℃浓缩至干，称量得出重量即为样品中槐糖脂含量；
步骤9：发酵周期结束后，以两种方法对发酵液进行生发用槐糖脂的分离，方法一：向一半发酵液内加入等质量95%的乙醇，搅拌均匀后过滤，滤液称重，加入滤液质量1%的活性炭，搅拌0.5h，用1μm滤纸过滤，所得滤液内再加入1%质量的活性炭，搅拌0.5h，用硅藻土助滤，滤液再用0.22μm滤膜过滤，之后70℃浓缩至干，所得浓缩产物即为终产品；方法二：向一半发酵液内加入等质量二氯甲烷，搅拌0.5h后静置分层，二氯甲烷层保留，向水层内再加入1/2质量的二氯甲烷，搅拌分层，保留二氯甲烷层。将两次所得的二氯甲烷汇集，加入1/3质量的水，搅拌0.5h，静置分层，取二氯甲烷层，再向所得二氯甲烷层加入1/3质量的水，搅拌0.5h，静置分层，取二氯甲烷层。向所得的二氯甲烷层加入1%质量的活性炭，搅拌0.5h，用1μm滤纸过滤，所得活性炭加适量二氯甲烷搅拌0.5h，与先前所得的二氯甲烷滤液汇集后用硅藻土过滤，向滤液内加入所加原料动植物油质量的0.01%质量的TBHQ（特丁基对苯二酚），50℃浓缩至干，向浓缩产物内加适量乙醇溶解，70℃浓缩至干，再向浓缩产物内加适量乙醇，之后70℃浓缩至干，所得浓缩产物即为终产品；
步骤10：分别取适量的两种方法分离得到的最终浓缩产物，以20倍质量的水加热溶解，加入等体积正己烷充分震荡后静置分层，取上层液50℃浓缩至干，称量得出重量即为终产物中动植物油类或水解油类的含量；再向下层液中两次加入等体积乙酸乙酯充分震荡后静置分层，将两次所得上层液合并，50℃浓缩至干，称量得出重量即为终产物中生发用槐糖脂的含量，由此可计算出本次发酵生产所用原料动植物油类或水解油类的转化率。
所述步骤1中，摇瓶培养基原料按重量份由如下原料组成：葡萄糖30份、酵母提取物15份、KH2PO41.2份、CaCl20.3份、氯化钠1.5份、硫酸镁3份、氢氧化钾3份,所述原料油类添加量为每个摇瓶装瓶量的30%，所述pH值通过5mol/L 氢氧化钾调节，所述摇瓶培养基灭菌采用蒸汽灭菌，该蒸汽灭菌步骤为：a.预热：40分钟内升温至100℃；
b.保温灭菌：20-30分钟内升温至121-123℃，保温30分钟；
c.一次降温：30分钟降温到100℃；
d.二次降温：120分钟降温至30℃。
所述步骤5中，所述冷藏酵母菌的获取步骤：
a.富集：在YM Broth培养基中180rpm、27℃摇瓶培养24h；
b.保菌：向菌液内加入等体积高压蒸汽灭菌并冷却的50%的甘油溶液，混合均匀，分装入10ml离心管内；
c.藏菌：将离心管包好放入冰箱冷冻柜中，低温保藏。
所述步骤4、9中活性炭为医药级粉末活性炭，所述步骤4中的水解油类成品采用无菌包装。
所述步骤5中，培养基及接种菌液量的和值不超过锥形瓶装瓶量的10%。
所述步骤6中，利用6mol/L 氢氧化钠调节发酵中培养基的pH值，所述消泡剂为乳状消泡剂，与水以1：5比例混合均匀后使用。
所述步骤7中测量样品吸光度所用波长为660nm。
所述步骤5、6中，冷却后的培养基温度应维持在25-32℃。
所述步骤9中，所用95%的乙醇、二氯甲烷均可以在浓缩后回收再利用。
所述步骤6中，培养基有以下三种配制方法：
方法一：Industrial Medium（产业化培养基）：葡萄糖：10%、磷酸二氢钾：0.1%、氯化钠：0.01%、二水氯化钙：0.01%、七水硫酸镁：0.05%、蛋白胨：0.07%、酵母提取物：0.5%、纯水：89.26%，混合溶解，葡萄糖在水中易结块，因此需要边搅拌边加入。
方法二：Rice Bran Extract（TC）Medium（纤维素酶处理米糠提取物培养基）：纤维素酶处理米糠提取物：5%、葡糖糖：10%、纯水85%，混合，将纯水加热溶解，由于米糠提取物溶解缓慢，可使用超声波震荡仪加速溶解。
纤维素酶处理米糠提取物制作步骤：取适量米糠，加入20倍质量的纯水搅拌均匀，取米糠质量3%的纤维素酶（Cellulase），用少量纯水溶解之后加入到米糠的悬浮液中，将上述溶液放入水浴锅中，45℃搅拌12h，使其充分水解，之后将米糠悬浮液90℃水浴加热30min对纤维素酶进行灭活，待液体冷却后加入等质量95%的乙醇溶液，充分搅拌后用1μm滤纸过滤，所得滤液70℃浓缩至干，得到的浓缩产物即为纤维素酶处理米糠提取物。另外，浓缩得到的乙醇溶液浓度可达70%，可回收再利用。
方法三：Orange Peel Extract（TC）Medium（桔皮提取物培养基）：纤维素酶处理桔皮提取物制作步骤：取适量新鲜桔皮，用刀切成细小碎块，称量重量，加入10倍质量的纯水搅拌均匀，取新鲜桔皮质量3%的纤维素酶（Cellulase），用少量纯水溶解之后加入到新鲜桔皮的悬浮液中，将上述溶液装入浓缩瓶，放入旋转蒸发器中，45℃旋转加热12h，使纤维素酶（Cellulase）充分发挥作用，之后将温度升高到90℃旋转加热30min对纤维素酶进行灭活，待液体冷却后加入等质量95%的乙醇溶液，充分搅拌后用1μm滤纸过滤，所得滤液70℃浓缩至干，得到的浓缩产物即为纤维素酶处理桔皮提取物。另外，浓缩得到的乙醇溶液浓度可到85%，可回收再利用。
本发明的优点：运用于化妆品生产具有更好的生发、抗脱发作用，且天然无毒害，并能促进细胞增值，加强细胞新陈代谢，有助于毛发生长。
具体实施方式
一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，包括原料油类的水解方法、槐糖脂的发酵方法和萃取分离方法，其中，原料油类的水解方法包括如下步骤：
步骤1：将摇瓶培养基原料置于烧杯中并利用纯化水进行溶解，溶解之后平均分装至摇瓶，然后每个摇瓶中添加原料油类并调节pH为8-9，灭菌得到摇瓶培养基，其中摇瓶培养基原料按重量份由如下原料组成：葡萄糖28-32份、酵母提取物14-16份、KH2PO40.9-1.4份、CaCl20.1-0.4份、氯化钠1-2份、硫酸镁1.5-4份、氢氧化钾2-5份，纯化水的用量为摇瓶培养基原料重量的4-5倍，原料油类添加量为每个摇瓶装瓶量的28-32%；
步骤2：将试管生物酶菌分离接入摇瓶培养基中，用透气棉塞封口，放入恒温培养振荡器中，转速150rpm，培养温度30℃，培养7天，得到水解油类粗品，将水解油类粗品常温放置12h熟成，把摇瓶中的物料转到分液漏斗里面分离，放下下层水层去除盐分和其它营养成分，上层即为水解油类；
步骤3：将水解油类经水洗一次，加入乙醇，溶解水解油类，其中，乙醇的用量为发酵所投入原料油类质量的0.3倍，然后，通过纯化树脂柱去除异味并调节pH至4.5-6.5，收集液体；
步骤4：将收集的液体，第一次加入活性炭，常温搅拌12h后快速滤纸过滤，再用慢速滤纸过滤收集滤液，滤液第二次加入活性炭，常温搅拌12h后先用快速滤纸过滤再用慢速滤纸过滤，再用1um滤纸过滤，再用0.45um滤纸过滤，再用0.22um滤纸过滤收集滤液，将收集的滤液经50℃减压浓缩完全并去除水分，用0.22um滤纸过滤除菌，得到水解油类成品。
槐糖脂的发酵方法包括如下步骤：
步骤5：在锥形瓶中加入纯水，按2.1%加入YM Broth培养基，超声震荡溶解后，用透气棉塞封口，用铝箔包好，高压蒸汽灭菌30min，温度为121℃，在超净台中冷却至27℃后接入3%冷藏酵母菌，塞上棉塞，放入摇床，转速180rpm、27℃培养48h；
步骤6：配制产业化培养基加入发酵罐中，准备碱液和消泡剂，装入碱液瓶与消泡剂瓶中，与发酵罐一起用铝箔包好，温度为121℃，高压蒸汽灭菌30min，灭完菌后装好发酵罐与碱液瓶、消泡剂瓶，待培养基冷却后从接种口接入已摇床培养48h的酵母菌液，开始发酵，发酵期间pH值控制在4,转速300rpm，通风0.5vvm；培养基有以下三种配制方法：
方法一：Industrial Medium（产业化培养基）：葡萄糖：10%、磷酸二氢钾：0.1%、氯化钠：0.01%、二水氯化钙：0.01%、七水硫酸镁：0.05%、蛋白胨：0.07%、酵母提取物：0.5%、纯水：89.26%，混合溶解，葡萄糖在水中易结块，因此需要边搅拌边加入。
方法二：Rice Bran Extract（TC）Medium（纤维素酶处理米糠提取物培养基）：纤维素酶处理米糠提取物：5%、葡糖糖：10%、纯水85%，混合，将纯水加热溶解，由于米糠提取物溶解缓慢，可使用超声波震荡仪加速溶解。
纤维素酶处理米糠提取物制作步骤：取适量米糠，加入20倍质量的纯水搅拌均匀，取米糠质量3%的纤维素酶（Cellulase），用少量纯水溶解之后加入到米糠的悬浮液中，将上述溶液放入水浴锅中，45℃搅拌12h，使其充分水解，之后将米糠悬浮液90℃水浴加热30min对纤维素酶进行灭活，待液体冷却后加入等质量95%的乙醇溶液，充分搅拌后用1μm滤纸过滤，所得滤液70℃浓缩至干，得到的浓缩产物即为纤维素酶处理米糠提取物。另外，浓缩得到的乙醇溶液浓度可达70%，可回收再利用。
方法三：Orange Peel Extract（TC）Medium（桔皮提取物培养基）：纤维素酶处理桔皮提取物制作步骤：取适量新鲜桔皮，用刀切成细小碎块，称量重量，加入10倍质量的纯水搅拌均匀，取新鲜桔皮质量3%的纤维素酶（Cellulase），用少量纯水溶解之后加入到新鲜桔皮的悬浮液中，将上述溶液装入浓缩瓶，放入旋转蒸发器中，45℃旋转加热12h，使纤维素酶（Cellulase）充分发挥作用，之后将温度升高到90℃旋转加热30min对纤维素酶进行灭活，待液体冷却后加入等质量95%的乙醇溶液，充分搅拌后用1μm滤纸过滤，所得滤液70℃浓缩至干，得到的浓缩产物即为纤维素酶处理桔皮提取物。另外，浓缩得到的乙醇溶液浓度可到85%，可回收再利用。
步骤7：每天从取样口取样，对培养液的pH值、含糖量进行测量，并通过吸光度的测试确定菌种生长情况，当菌种度过调整期进入对数期后加入发酵原料——10%动植物油类，不再进行pH值控制，转速450rpm，通风0.75vvm，含糖量控制在3%--4%；
萃取分离阶段包括以下步骤：
步骤8：在加入动植物油类后，每天从取样口取样10ml，加入等体积正己烷震荡分层，取上清液50℃浓缩至干，称量得出重量即为样品中动植物油类含量，再向下层液中两次加入等体积乙酸乙酯震荡分层，将两次所得上层液合并，50℃浓缩至干，称量得出重量即为样品中槐糖脂含量；
步骤9：发酵周期结束后，以两种方法对发酵液进行生发用槐糖脂的分离，方法一：向一半发酵液内加入等质量95%的乙醇，搅拌均匀后过滤，滤液称重，加入滤液质量1%的活性炭，搅拌0.5h，用1μm滤纸过滤，所得滤液内再加入1%质量的活性炭，搅拌0.5h，用硅藻土助滤，滤液再用0.22μm滤膜过滤，之后70℃浓缩至干，所得浓缩产物即为终产品；方法二：向一半发酵液内加入等质量二氯甲烷，搅拌0.5h后静置分层，二氯甲烷层保留，向水层内再加入1/2质量的二氯甲烷，搅拌分层，保留二氯甲烷层。将两次所得的二氯甲烷汇集，加入1/3质量的水，搅拌0.5h，静置分层，取二氯甲烷层，再向所得二氯甲烷层加入1/3质量的水，搅拌0.5h，静置分层，取二氯甲烷层。向所得的二氯甲烷层加入1%质量的活性炭，搅拌0.5h，用1μm滤纸过滤，所得活性炭加适量二氯甲烷搅拌0.5h，与先前所得的二氯甲烷滤液汇集后用硅藻土过滤，向滤液内加入所加原料动植物油质量的0.01%质量的TBHQ（特丁基对苯二酚），50℃浓缩至干，向浓缩产物内加适量乙醇溶解，70℃浓缩至干，再向浓缩产物内加适量乙醇，之后70℃浓缩至干，所得浓缩产物即为终产品；
步骤10：分别取适量的两种方法分离得到的最终浓缩产物，以20倍质量的水加热溶解，加入等体积正己烷充分震荡后静置分层，取上层液50℃浓缩至干，称量得出重量即为终产物中动植物油类或水解油类的含量；再向下层液中两次加入等体积乙酸乙酯充分震荡后静置分层，将两次所得上层液合并，50℃浓缩至干，称量得出重量即为终产物中生发用槐糖脂的含量，由此可计算出本次发酵生产所用原料动植物油类或水解油类的转化率。
步骤5中，所述冷藏酵母菌的获取步骤：
a.富集：在YM Broth培养基中180rpm、27℃摇瓶培养24h；
b.保菌：向菌液内加入等体积高压蒸汽灭菌并冷却的50%的甘油溶液，混合均匀，分装入10ml离心管内；
c.藏菌：将离心管包好放入冰箱冷冻柜中，低温保藏。
步骤1中，摇瓶培养基原料按重量份由如下原料组成：葡萄糖30份、酵母提取物15份、KH2PO41.2份、CaCl20.3份、氯化钠1.5份、硫酸镁3份、氢氧化钾3份,所述原料油类添加量为每个摇瓶装瓶量的30%，所述pH值通过5mol/L 氢氧化钾调节，所述摇瓶培养基灭菌采用蒸汽灭菌，该蒸汽灭菌步骤为：a.预热：40分钟内升温至100℃；
b.保温灭菌：20-30分钟内升温至121-123℃，保温30分钟；
c.一次降温：30分钟降温到100℃；
d.二次降温：120分钟降温至30℃。
步骤5中，所述冷藏酵母菌的获取步骤：
a.富集：在YM Broth培养基中180rpm、27℃摇瓶培养24h；
b.保菌：向菌液内加入等体积高压蒸汽灭菌并冷却的50%的甘油溶液，混合均匀，分装入10ml离心管内；
c.藏菌：将离心管包好放入冰箱冷冻柜中，低温保藏。
步骤4、9中活性炭为医药级粉末活性炭，步骤4中的水解油类成品采用无菌包装，步骤5中，培养基及接种菌液量的和值不超过锥形瓶装瓶量的10%，步骤6中，利用6mol/L 氢氧化钠调节发酵中培养基的pH值，消泡剂为乳状消泡剂，与水以1：5比例混合均匀后使用，步骤7中测量样品吸光度所用波长为660nm，步骤5、6中，冷却后的培养基温度应维持在25-32℃，步骤9中，所用95%的乙醇、二氯甲烷均可以在浓缩后回收再利用。
本发明的细胞实验中细胞增值实验，具体为：细胞增殖实验中使用米诺地尔(minoxidil,MXD)为阳性对照，使用由菜籽油经Industrial Medium（产业化培养基）方法发酵生产的生发用槐糖脂 (ROS, rapeseed oil sophorolipid),由水飞蓟油经Rice BranExtract（TC）Medium（纤维素酶处理米糠提取物培养基）方法发酵生产的生发用槐糖脂(SOS, silybum marianum marianum oil sophorolipid), 以及由水解水飞蓟油经RiceBran Extract（TC）Medium（纤维素酶处理米糠提取物培养基）方法发酵生产的生发用槐糖脂(LSOS, lipase treatment silybum marianum marianum oil sophorolipid)为阴性对照，通过比较添加物不同而对HDP Cell(Human Dermal Papilla Cell)的细胞增殖的影响来确定生发用sophorolipid（槐糖脂）的生发效果。作为阳性对照米诺地尔(minoxidil,MXD) )是得到美国食品药品监督管理局 (Food and Drug Administration, FDA)公证的促进毛发生长的药物。
本发明的细胞实验中生发相关遗传因子发现量检测实验，具体为：生发相关遗传因子发现量检测实验中主要观察三种遗传因子的发现量：与生发、防脱发、抗衰老、抗皱相关的遗传因子HGF(Hepatocyte growth factor)；纤维芽细胞生长因子的一种、能够刺激毛发生长的遗传因子KGF (Keratiocyte growth factor) ；在毛发生长休止期时诱导新生毛发到生长期、促进新生血管生长的血管内皮细胞生长因子-VEGF (Vescular endothelialgrowth factor)。实验时在培养的HDP Cell(Human Dermal Papilla Cell)中添加不同浓度的生发用sophorolipid（槐糖脂），通过观察三种生发相关遗传因子表达比例依存于浓度而增加或减少的情况来确定生发用sophorolipid（槐糖脂）的生发效果。实验中通过RT-PCRRNA的增幅来确认HGF(Hepatocyte growth factor)、KGF (Keratiocyte growth factor)、-VEGF (Vescular endothelial growth factor)这三种遗传因子的发现量。
以动植物油类或水解油类为原料的生发用槐糖脂产品在化妆品原料中的用途包括但不仅限于作为添加剂使用。
本发明运用于化妆品生产具有更好的生发、抗脱发作用，且天然无毒害，并能促进细胞增值，加强细胞新陈代谢，有助于毛发生长。

Claims (10)

1.一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，其特征在于：包括原料油类的水解方法、槐糖脂的发酵方法和萃取分离方法，其中，所述原料油类的水解方法包括如下步骤：
步骤1：将摇瓶培养基原料置于烧杯中并利用纯化水进行溶解，溶解之后平均分装至摇瓶，然后每个摇瓶中添加原料油类并调节pH为8-9，灭菌得到摇瓶培养基，其中摇瓶培养基原料按重量份由如下原料组成：葡萄糖28-32份、酵母提取物14-16份、KH2PO40.9-1.4份、CaCl20.1-0.4份、氯化钠1-2份、硫酸镁1.5-4份、氢氧化钾2-5份，纯化水的用量为摇瓶培养基原料重量的4-5倍，原料油类添加量为每个摇瓶装瓶量的28-32%；
步骤2：将试管生物酶菌分离接入摇瓶培养基中，用透气棉塞封口，放入恒温培养振荡器中，转速150rpm，培养温度30℃，培养7天，得到水解油类粗品，将水解油类粗品常温放置12h熟成，把摇瓶中的物料转到分液漏斗里面分离，放下下层水层去除盐分和其它营养成分，上层即为水解油类；
步骤3：将水解油类经水洗一次，加入乙醇，溶解水解油类，其中，乙醇的用量为发酵所投入原料油类质量的0.3倍，然后，通过纯化树脂柱去除异味并调节pH至4.5-6.5，收集液体；
步骤4：将收集的液体，第一次加入活性炭，常温搅拌12h后快速滤纸过滤，再用慢速滤纸过滤收集滤液，滤液第二次加入活性炭，常温搅拌12h后先用快速滤纸过滤再用慢速滤纸过滤，再用1um滤纸过滤，再用0.45um滤纸过滤，再用0.22um滤纸过滤收集滤液，将收集的滤液经50℃减压浓缩完全并去除水分，用0.22um滤纸过滤除菌，得到水解油类成品；
所述槐糖脂的发酵方法包括如下步骤：
步骤5：在锥形瓶中加入纯水，按2.1%加入YM Broth培养基，超声震荡溶解后，用透气棉塞封口，用铝箔包好，高压蒸汽灭菌30min，温度为121℃，在超净台中冷却至27℃后接入3%冷藏酵母菌，塞上棉塞，放入摇床，转速180rpm、27℃培养48h；
步骤6：配制产业化培养基加入发酵罐中，准备碱液和消泡剂，装入碱液瓶与消泡剂瓶中，与发酵罐一起用铝箔包好，温度为121℃，高压蒸汽灭菌30min，灭完菌后装好发酵罐与碱液瓶、消泡剂瓶，待培养基冷却后从接种口接入已摇床培养48h的酵母菌液，开始发酵，发酵期间pH值控制在4,转速300rpm，通风0.5vvm；
步骤7：每天从取样口取样，对培养液的pH值、含糖量进行测量，并通过吸光度的测试确定菌种生长情况，当菌种度过调整期进入对数期后加入发酵原料——10%动植物油类，不再进行pH值控制，转速450rpm，通风0.75vvm，含糖量控制在3%--4%；
所述萃取分离阶段包括以下步骤：
步骤8：在加入动植物油类后，每天从取样口取样10ml，加入等体积正己烷震荡分层，取上清液50℃浓缩至干，称量得出重量即为样品中动植物油类含量，再向下层液中两次加入等体积乙酸乙酯震荡分层，将两次所得上层液合并，50℃浓缩至干，称量得出重量即为样品中槐糖脂含量；
步骤9：发酵周期结束后，以两种方法对发酵液进行生发用槐糖脂的分离，方法一：向一半发酵液内加入等质量95%的乙醇，搅拌均匀后过滤，滤液称重，加入滤液质量1%的活性炭，搅拌0.5h，用1μm滤纸过滤，所得滤液内再加入1%质量的活性炭，搅拌0.5h，用硅藻土助滤，滤液再用0.22μm滤膜过滤，之后70℃浓缩至干，所得浓缩产物即为终产品；方法二：向一半发酵液内加入等质量二氯甲烷，搅拌0.5h后静置分层，二氯甲烷层保留，向水层内再加入1/2质量的二氯甲烷，搅拌分层，保留二氯甲烷层，将两次所得的二氯甲烷汇集，加入1/3质量的水，搅拌0.5h，静置分层，取二氯甲烷层，再向所得二氯甲烷层加入1/3质量的水，搅拌0.5h，静置分层，取二氯甲烷层，向所得的二氯甲烷层加入1%质量的活性炭，搅拌0.5h，用1μm滤纸过滤，所得活性炭加适量二氯甲烷搅拌0.5h，与先前所得的二氯甲烷滤液汇集后用硅藻土过滤，向滤液内加入所加原料动植物油质量的0.01%质量的TBHQ（特丁基对苯二酚），50℃浓缩至干，向浓缩产物内加适量乙醇溶解，70℃浓缩至干，再向浓缩产物内加适量乙醇，之后70℃浓缩至干，所得浓缩产物即为终产品；
步骤10：分别取适量的两种方法分离得到的最终浓缩产物，以20倍质量的水加热溶解，加入等体积正己烷充分震荡后静置分层，取上层液50℃浓缩至干，称量得出重量即为终产物中动植物油类或水解油类的含量；再向下层液中两次加入等体积乙酸乙酯充分震荡后静置分层，将两次所得上层液合并，50℃浓缩至干，称量得出重量即为终产物中生发用槐糖脂的含量，由此可计算出本次发酵生产所用原料动植物油类或水解油类的转化率。
2.根据权利要求1所述的一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，其特征在于：所述步骤1中，摇瓶培养基原料按重量份由如下原料组成：葡萄糖30份、酵母提取物15份、KH2PO41.2份、CaCl20.3份、氯化钠1.5份、硫酸镁3份、氢氧化钾3份,所述原料油类添加量为每个摇瓶装瓶量的30%，所述pH值通过5mol/L 氢氧化钾调节，所述摇瓶培养基灭菌采用蒸汽灭菌，该蒸汽灭菌步骤为：a.预热：40分钟内升温至100℃；
b.保温灭菌：20-30分钟内升温至121-123℃，保温30分钟；
c.一次降温：30分钟降温到100℃；
d.二次降温：120分钟降温至30℃。
3.根据权利要求1所述的一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，其特征在于：所述步骤5中，所述冷藏酵母菌的获取步骤：
a.富集：在YM Broth培养基中180rpm、27℃摇瓶培养24h；
b.保菌：向菌液内加入等体积高压蒸汽灭菌并冷却的50%的甘油溶液，混合均匀，分装入10ml离心管内；
c.藏菌：将离心管包好放入冰箱冷冻柜中，低温保藏。
4.根据权利要求1所述的一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，其特征在于：所述步骤4、9中活性炭为医药级粉末活性炭，所述步骤4中的水解油类成品采用无菌包装。
5.根据权利要求1所述的一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，其特征在于：所述步骤5中，培养基及接种菌液量的和值不超过锥形瓶装瓶量的10%。
6.根据权利要求1所述的一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，其特征在于：所述步骤6中，利用6mol/L 氢氧化钠调节发酵中培养基的pH值，所述消泡剂为乳状消泡剂，与水以1：5比例混合均匀后使用。
7.根据权利要求1所述的一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，其特征在于：所述步骤7中测量样品吸光度所用波长为660nm。
8.根据权利要求1所述的一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，其特征在于：所述步骤5、6中，冷却后的培养基温度应维持在25-32℃。
9.根据权利要求1所述的一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，其特征在于：所述步骤9中，所用95%的乙醇、二氯甲烷均可以在浓缩后回收再利用。
10.根据权利要求1所述的一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法，其特征在于：所述步骤6中，培养基有以下三种配制方法：
方法一：Industrial Medium（产业化培养基）：葡萄糖：10%、磷酸二氢钾：0.1%、氯化钠：0.01%、二水氯化钙：0.01%、七水硫酸镁：0.05%、蛋白胨：0.07%、酵母提取物：0.5%、纯水：89.26%，混合溶解，葡萄糖在水中易结块，因此需要边搅拌边加入；
方法二：Rice Bran Extract（TC）Medium（纤维素酶处理米糠提取物培养基）：纤维素酶处理米糠提取物：5%、葡糖糖：10%、纯水85%，混合，将纯水加热溶解，由于米糠提取物溶解缓慢，可使用超声波震荡仪加速溶解，
纤维素酶处理米糠提取物制作步骤：取适量米糠，加入20倍质量的纯水搅拌均匀，取米糠质量3%的纤维素酶（Cellulase），用少量纯水溶解之后加入到米糠的悬浮液中，将上述溶液放入水浴锅中，45℃搅拌12h，使其充分水解，之后将米糠悬浮液90℃水浴加热30min对纤维素酶进行灭活，待液体冷却后加入等质量95%的乙醇溶液，充分搅拌后用1μm滤纸过滤，所得滤液70℃浓缩至干，得到的浓缩产物即为纤维素酶处理米糠提取物，
另外，浓缩得到的乙醇溶液浓度可达70%，可回收再利用，
方法三：Orange Peel Extract（TC）Medium（桔皮提取物培养基）：纤维素酶处理桔皮提取物制作步骤：取适量新鲜桔皮，用刀切成细小碎块，称量重量，加入10倍质量的纯水搅拌均匀，取新鲜桔皮质量3%的纤维素酶（Cellulase），用少量纯水溶解之后加入到新鲜桔皮的悬浮液中，将上述溶液装入浓缩瓶，放入旋转蒸发器中，45℃旋转加热12h，使纤维素酶（Cellulase）充分发挥作用，之后将温度升高到90℃旋转加热30min对纤维素酶进行灭活，待液体冷却后加入等质量95%的乙醇溶液，充分搅拌后用1μm滤纸过滤，所得滤液70℃浓缩至干，得到的浓缩产物即为纤维素酶处理桔皮提取物，另外，浓缩得到的乙醇溶液浓度可到85%，可回收再利用。
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