CN108486178A - 一种藻油dha的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种藻油DHA的制备方法，所述方法包括：(1)选定微藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异养发酵，得到微藻原料；(2)干燥；将微藻原料进行干燥处理，得到微藻粉末；(3)破壁预处理；将微藻粉末采用超声处理法进行微藻破壁预处理，得到微藻干粉；(4)藻油提取；取微藻藻粉，以质量分数为60‑100％乙醇作为萃取剂，利用加速溶剂萃取仪进行萃取，萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发后所得剩余物即为藻油；(5)尿素包合富集纯化；(6)滤液浓缩得到藻油DHA成品。采用本发明方法所得到的产品纯度高，不仅弥补了目前鱼油、微藻提取制备DHA资源的不足，而且可以作为药品、保健品、食品添加及高级化工产品的原料。
Description
技术领域
本发明涉及保健食品技术领域，尤其涉及一种藻油DHA的制备方法。
背景技术
DHA在中枢神经系统、心血管系统和视觉神经系统等方面重要的生理功 能，已得到广泛的社会认可，世界多国已规定DHA可作为营养强化剂和食品 添加剂使用。目前，DHA已经被用于婴幼儿食品、乳品、饮料、豆奶及食 用油脂等方面，市场需求很大，因此，DHA的生产蕴藏着巨大商机。
DHA的来源主要是鱼油和藻油。鱼油有较大的鱼腥味和高含量EPA，在 食品添加上有一定的困难，食用人群也受到限制，并且鱼油资源有限。而大 规模、高密度培养的微藻异养发酵，可以解决上述问题。寇氏隐甲藻是生产 DHA的高产菌株，且脂肪酸组成简单，EPA较少，没有鱼腥味，具有非常广 阔的应用前景。目前，世界很多国家已有藻油商业生产的成功先例，但在我 国，对隐甲藻的研究还多停留在高产DHA藻株的筛选及发酵条件的优化上，大规模的工业化生产较少且多为外资企业。因此，利用寇氏隐甲藻高密度发 酵生产DHA的研究，具有很大的经济效益和社会效应。
目前，现有微藻提取DHA的制备工艺较为落后，生产效率低，良品率低， 不能够高效的实现大规模的工厂化生产制备。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种藻油DHA的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供的一种藻油DHA的制备方法，所述方法包 括如下步骤：
(1)选定微藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异养发酵， 得到微藻原料；
(2)干燥；将步骤(1)得到的微藻原料进行干燥处理，得到微藻粉末；
(3)破壁预处理；将步骤(2)得到的微藻粉末采用超声处理法进行微藻破 壁预处理，得到微藻干粉。
(4)藻油提取；取步骤(3)得到的微藻干粉，以质量分数为60-100％ 乙醇作为萃取剂，利用加速溶剂萃取仪进行萃取，萃取液置于真空旋转蒸发 器将有机溶解蒸发，蒸发后所得剩余物即为藻油；
(5)尿素包合富集纯化；按藻油质量、尿素质量和95％乙醇体积比为1： 2：8～12的比例称量，先将尿素加入到95％乙醇溶液中，50～55℃水浴搅拌至 尿素完全溶解，然后加入藻油，充氮气保护，继续搅拌回流30～40min，自然 冷却至25℃后，低温放置，抽滤分离得滤液和晶体；
(6)滤液浓缩得到藻油DHA成品。
优选地，所述步骤(5)之后还包括：
(7)脱色除臭；将尿素包合富集纯化所得的微藻DHA藻油加入占油体 质量3％的活性白土进行脱色，脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时 抽真空并适度搅拌，过滤除去白土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度 为85℃，真空度为0.30Kpa，脱臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢 冷却，离心得藻油DHA成品。
优选地，所述步骤(6)之后还包括：
(8)回收尿素
将步骤(5)和(6)的水相溶液合并，于2～6℃放置结晶2～4h，抽滤， 滤液浓缩至1/4体积后，2～6℃放置二次结晶2～4h，抽滤，合并两次抽滤所得 固体，干燥得到尿素晶体，循环使用；
步骤(5)中的低温放置条件为：①25℃～5℃，降温速率为0.2℃/min；② 5℃保持3～4h；③5℃～-5℃，降温速率为0.1℃/min；④-5℃保持3～4h。
优选地，所述步骤(4)中的工艺参数为：所述的萃取温度为55～120℃， 萃取时间25～85min，萃取次数为2～5次；萃取结束后将萃取液置于真空旋转 蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发后所得剩余物即为藻油。
优选地，所述的微藻包括裂殖壶藻、等鞭金藻、寇式隐甲藻、微绿球藻、 绿色巴夫藻、布朗葡萄藻、三角褐指藻、菱形藻、小球藻、栅藻或者杜氏藻。
优选地，所述步骤(3)的具体执行过程如下：
(31)将一定量微藻粉末置于烧杯中，加入少量提取溶剂，放入超声水浴 中，在一定超声功率下进行超声预处理一定时间；
(32)超声预处理之后，把烧杯中的微藻抽滤；
(33)微藻粉末装入滤纸筒，滤液倒入圆底烧瓶，作为索氏抽提的提取溶 剂，安装索氏提取器。
优选地，所述步骤1)包含准备培养基以及异氧发酵的过程；
所述准备培养基包含,
步骤11)固体培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢 钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液 2ml，纯净水1000ml；琼脂2％；
步骤12)一级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖40g，味精35g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢 钾5g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.5g，A5溶液1ml，土浸液2ml， 纯净水1000ml；
步骤13)二级种子培养基：
培养基组成：培养基组成：葡萄糖50g，味精40g，酵母膏6g，氯化钠 10g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.3g，A5溶液 1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
步骤14)发酵培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢 钾4g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液2ml， 纯净水1000ml；
步骤15)菌种保藏培养基：
所述固体培养基或发酵培养基中添加有青霉素，添加量为50～100mg/L， 并低温保藏。
优选地，所述异养发酵包含如下步骤，
(S21)一级种子培养：
从固体培养基的平板上取一定量纯的寇氏隐甲藻，接种到一级种子培养 基，置于摇床上，28℃、120rpm条件下培养48小时，得到一级种子；
(S22)二级种子培养：
将一级种子按20％的接种量转接到二级种子培养基，28℃、150rpm条件 下培养48小时，得到二级液体种子；
(S23)发酵培养：
取5L标准发酵罐，自动调控温度、pH、溶氧、搅拌速度、通风量和流加 速度；发酵条件为：将二级液体种子按4％接种量接种于发酵培养基中，在 25℃和4L/min的通气量下培养；每12h取样，测定葡萄糖浓度、生物量；每 24h测定脂肪酸和DHA含量；通过流加2mol/LHCl或2mol/LNaOH自动控制 发酵液pH。
本发明藻油DHA的制备方法包括(1)选定微藻进行培养和发酵；所述 培养和发酵为藻种培养和异养发酵，得到微藻原料；(2)干燥；将步骤(1) 得到的微藻原料进行干燥处理，得到微藻粉末；(3)破壁预处理；将步骤(2) 得到的微藻粉末采用超声处理法进行微藻破壁预处理，得到微藻干粉。(4) 藻油提取；取步骤(3)得到的微藻干粉，以质量分数为60-100％乙醇作为萃 取剂，利用加速溶剂萃取仪进行萃取，萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶 解蒸发，蒸发后所得剩余物即为藻油；(5)尿素包合富集纯化；按藻油质量、 尿素质量和95％乙醇体积比为1：2：8～12的比例称量，先将尿素加入到95％ 乙醇溶液中，50～55℃水浴搅拌至尿素完全溶解，然后加入藻油，充氮气保护， 继续搅拌回流30～40min，自然冷却至25℃后，低温放置，抽滤分离得滤液和 晶体；(6)滤液浓缩得到藻油DHA成品。
(1)本发明的方法获得的藻油DHA含量高达93％以上，几乎不含EPA， 尤其适合作为婴幼儿和孕产妇的营养食品、保健品的添加原料。产品纯度高， 不仅弥补了目前鱼油、微藻提取制备DHA资源的不足，而且可以作为药品、 保健品、食品添加及高级化工产品的原料。
(3)本发明利用尿素包合分离富集出藻油中DHA的同时，也从尿素包 合物中回收大量的饱和脂肪酸和尿素，尿素的回收率达到70％以上。该发明 达到资源再利用的效果，具有可观的经济价值。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限 定本发明。
实施例1：
(1)选定裂殖壶藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异养 发酵，得到微藻原料；
(2)干燥；将步骤(1)得到的裂殖壶藻原料进行干燥处理，得到裂殖壶藻 粉末；
(31)将一定量裂殖壶藻粉末置于烧杯中，加入少量提取溶剂，放入超声水 浴中，在一定超声功率下进行超声预处理一定时间；
(32)超声预处理之后，把烧杯中的微藻抽滤；
(33)裂殖壶藻粉末装入滤纸筒，滤液倒入圆底烧瓶，作为索氏抽提的提取 溶剂，安装索氏提取器；
(4)藻油提取；取裂殖壶藻藻粉，以质量分数为60％乙醇作为萃取剂， 利用加速溶剂萃取仪进行萃取，萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发， 蒸发后所得剩余物即为藻油；
(5)尿素包合富集纯化；按藻油质量、尿素质量和95％乙醇体积比为1： 2：8的比例称量，先将尿素加入到95％乙醇溶液中，50℃水浴搅拌至尿素完 全溶解，然后加入藻油，充氮气保护，继续搅拌回流30min，自然冷却至25℃ 后，低温放置，抽滤分离得滤液和晶体；
(6)脱色除臭；将尿素包合富集纯化所得的微藻DHA藻油加入占油体 质量3％的活性白土进行脱色，脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时 抽真空并适度搅拌，过滤除去白土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度 为85℃，真空度为0.30Kpa，脱臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢 冷却，离心得藻油DHA成品；
(7)回收尿素
将步骤(5)和(6)的水相溶液合并，于2～6℃放置结晶24h，抽滤，滤 液浓缩至1/4体积后，2～6℃放置二次结晶2h，抽滤，合并两次抽滤所得固体， 干燥得到尿素晶体，循环使用；
步骤(5)中的低温放置条件为：①25℃～5℃，降温速率为0.2℃/min；② 5℃保持3h；③5℃～-5℃，降温速率为0.1℃/min；④-5℃保持3h。
(8)滤液浓缩得到藻油DHA成品。
所述步骤(4)中的工艺参数为：所述的萃取温度为55℃，萃取时间50min， 萃取次数为3次；萃取结束后将萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发， 蒸发后所得剩余物即为藻油。
实施例2：
(1)选定寇式隐甲藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异 养发酵，得到寇式隐甲藻原料；
(2)干燥；将步骤(1)得到的寇式隐甲藻原料进行干燥处理，得到寇式隐 甲藻粉末；
(31)将一定量寇式隐甲藻粉末置于烧杯中，加入少量提取溶剂，放入超声 水浴中，在一定超声功率下进行超声预处理一定时间；
(32)超声预处理之后，把烧杯中的微藻抽滤；
(33)寇式隐甲藻粉末装入滤纸筒，滤液倒入圆底烧瓶，作为索氏抽提的提 取溶剂，安装索氏提取器；
(4)藻油提取；取寇式隐甲藻藻粉，以质量分数为70％乙醇作为萃取剂， 利用加速溶剂萃取仪进行萃取，萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发， 蒸发后所得剩余物即为藻油；
(5)尿素包合富集纯化；按藻油质量、尿素质量和95％乙醇体积比为1： 2：10的比例称量，先将尿素加入到95％乙醇溶液中，52℃水浴搅拌至尿素完 全溶解，然后加入藻油，充氮气保护，继续搅拌回流35min，自然冷却至25℃ 后，低温放置，抽滤分离得滤液和晶体；
(6)脱色除臭；将尿素包合富集纯化所得的微藻DHA藻油加入占油体 质量3％的活性白土进行脱色，脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时 抽真空并适度搅拌，过滤除去白土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度 为85℃，真空度为0.30Kpa，脱臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢 冷却，离心得藻油DHA成品；
(7)回收尿素
将步骤(5)和(6)的水相溶液合并，于2～6℃放置结晶3h，抽滤，滤 液浓缩至1/4体积后，2～6℃放置二次结晶3h，抽滤，合并两次抽滤所得固体， 干燥得到尿素晶体，循环使用；
步骤(5)中的低温放置条件为：①25℃～5℃，降温速率为0.2℃/min；②5℃保持4h；③5℃～-5℃，降温速率为0.1℃/min；④-5℃保持4h。
(8)滤液浓缩得到藻油DHA成品。
所述步骤(4)中的工艺参数为：所述的萃取温度为70℃，萃取时间50min， 萃取次数为4次；萃取结束后将萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发， 蒸发后所得剩余物即为藻油。
实施例3：
(1)选定等鞭金藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异养 发酵，得到等鞭金藻原料；
(2)干燥；将步骤(1)得到的等鞭金藻原料进行干燥处理，得到等鞭金藻 粉末；
(31)将一定量等鞭金藻粉末置于烧杯中，加入少量提取溶剂，放入超声水 浴中，在一定超声功率下进行超声预处理一定时间；
(32)超声预处理之后，把烧杯中的微藻抽滤；
(33)等鞭金藻粉末装入滤纸筒，滤液倒入圆底烧瓶，作为索氏抽提的提取 溶剂，安装索氏提取器；
(4)藻油提取；取等鞭金藻藻粉，以质量分数为800％乙醇作为萃取剂， 利用加速溶剂萃取仪进行萃取，萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发， 蒸发后所得剩余物即为藻油；
(5)尿素包合富集纯化；按藻油质量、尿素质量和95％乙醇体积比为1： 2：12的比例称量，先将尿素加入到95％乙醇溶液中，55℃水浴搅拌至尿素完 全溶解，然后加入藻油，充氮气保护，继续搅拌回流40min，自然冷却至25℃ 后，低温放置，抽滤分离得滤液和晶体；
(6)脱色除臭；将尿素包合富集纯化所得的微藻DHA藻油加入占油体 质量3％的活性白土进行脱色，脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时 抽真空并适度搅拌，过滤除去白土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度 为85℃，真空度为0.30Kpa，脱臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢 冷却，离心得藻油DHA成品；
(7)回收尿素
将步骤(5)和(6)的水相溶液合并，于2～6℃放置结晶4h，抽滤，滤 液浓缩至1/4体积后，2～6℃放置二次结晶4h，抽滤，合并两次抽滤所得固体， 干燥得到尿素晶体，循环使用；
步骤(5)中的低温放置条件为：①25℃～5℃，降温速率为0.2℃/min；② 5℃保持4h；③5℃～-5℃，降温速率为0.1℃/min；④-5℃保持4h。
(8)滤液浓缩得到藻油DHA成品。
所述步骤(4)中的工艺参数为：所述的萃取温度为90℃，萃取时间60min， 萃取次数为5次；萃取结束后将萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发， 蒸发后所得剩余物即为藻油。
在一些优选实施例中，上述步骤(1)包含准备培养基以及异氧发酵的过 程；
所述准备培养基包含,
步骤(11)固体培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢 钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液 2ml，纯净水1000ml；琼脂2％；
步骤(12)一级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖40g，味精35g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢 钾5g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.5g，A5溶液1ml，土浸液2ml， 纯净水1000ml；
步骤(13)二级种子培养基：
培养基组成：培养基组成：葡萄糖50g，味精40g，酵母膏6g，氯化钠 10g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.3g，A5溶液 1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
步骤(14)发酵培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢 钾4g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液2ml， 纯净水1000ml；
步骤(15)菌种保藏培养基：
所述固体培养基或发酵培养基中添加有青霉素，添加量为50～100mg/L， 并低温保藏。
在一些优选实施例中，所述菌种保藏培养基为用于保藏寇氏隐甲藻的固 体培养基。所述固体培养基的平板上保藏有寇氏隐甲藻。
在一些优选实施例中，所述异养发酵包含如下步骤，
(S21)一级种子培养：
从固体培养基的平板上取一定量纯的寇氏隐甲藻，接种到一级种子培养 基，置于摇床上，28℃、120rpm条件下培养48小时，得到一级种子；
(S22)二级种子培养：
将一级种子按20％的接种量转接到二级种子培养基，28℃、150rpm条件 下培养48小时，得到二级液体种子；
(S23)发酵培养：
取5L标准发酵罐，自动调控温度、pH、溶氧、搅拌速度、通风量和流加 速度；发酵条件为：将二级液体种子按4％接种量接种于发酵培养基中，在 25℃和4L/min的通气量下培养；每12h取样，测定葡萄糖浓度、生物量；每 24h测定脂肪酸和DHA含量；通过流加2mol/LHCl或2mol/LNaOH自动控制 发酵液pH。
我们在一些具体实施例中，还进行了培养基优化的工作；具体的，我们 运用Design-Expert软件，对发酵培养基的葡萄糖、味精和酵母膏进行优化， 其他无机盐和微量元素保持不变。运用Box-BehnkenDesign(BBD)实验设计方 法，考察的因素和因素的低值、高值分别为葡萄糖(g/L):20，100；味精(g/L)： 10，50；酵母膏(g/L)：2，10。选择的因变量为生物量、油脂产量和DHA产 量。
在一些实施例中，我们针对性的进行了发酵条件的具体实施例，其中对 温度和pH值进行不同的数值控制，获取更优选的技术方案效果；具体实施例 如下：
(1)关于温度的实施例：
微藻生长和油脂积累的最适温度因种而异，将二级种子接入到发酵培养 基之后，分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的温度条件下发酵，来研究 不同温度对隐甲藻生物量及油脂含量的影响。
(2)关于pH值的实施例：
培养基的初始pH值是影响微藻生长速度的重要因子之一。有许多研究者 发现，多种藻类在pH5-7左右生长速度最快，在极端酸性或碱性条件下较难 生长。用HCl或NaOH溶液调整发酵培养基初始pH值分别为4.5、5.5、6.5、 7.0、7.5，来研究不同初始pH值对隐甲藻生物量及油脂含量的影响。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是 利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用 在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种藻油DHA的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)选定微藻进行培养和发酵；所述培养和发酵为藻种培养和异养发酵，得到微藻原料；
(2)干燥；将步骤(1)得到的微藻原料进行干燥处理，得到微藻粉末；
(3)破壁预处理；将步骤(2)得到的微藻粉末采用超声处理法进行微藻破壁预处理，得到微藻干粉；
(4)藻油提取；取步骤(3)得到的微藻干粉，以质量分数为60-100％乙醇作为萃取剂，利用加速溶剂萃取仪进行萃取，萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发后所得剩余物即为藻油；
(5)尿素包合富集纯化；按藻油质量、尿素质量和95％乙醇体积比为1：2：8～12的比例称量，先将尿素加入到95％乙醇溶液中，50～55℃水浴搅拌至尿素完全溶解，然后加入藻油，充氮气保护，继续搅拌回流30～40min，自然冷却至25℃后，低温放置，抽滤分离得滤液和晶体；
(6)滤液浓缩得到藻油DHA成品。
2.根据权利要求1所述的藻油DHA的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)之后还包括：
(7)脱色除臭；将尿素包合富集纯化所得的微藻DHA藻油加入占油体质量3％的活性白土进行脱色，脱色温度为80℃，脱色时间为45分钟，同时抽真空并适度搅拌，过滤除去白土，对油脂进行水蒸气气提除臭，汽提温度为85℃，真空度为0.30Kpa，脱臭时间为1小时，然后维持真空状态下缓慢冷却，离心得藻油DHA成品。
3.根据权利要求1所述的藻油DHA的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)之后还包括：
(8)回收尿素：
将步骤(5)和(6)的水相溶液合并，于2～6℃放置结晶2～4h，抽滤，滤液浓缩至1/4体积后，2～6℃放置二次结晶2～4h，抽滤，合并两次抽滤所得固体，干燥得到尿素晶体，循环使用；
步骤(5)中的低温放置条件为：①25℃～5℃，降温速率为0.2℃/min；②5℃保持3～4h；③5℃～-5℃，降温速率为0.1℃/min；④-5℃保持3～4h。
4.根据权利要求1所述的一种藻油DHA的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的工艺参数为：所述的萃取温度为55～120℃，萃取时间25～85min，萃取次数为2～5次；萃取结束后将萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发后所得剩余物即为藻油。
5.根据权利要求1所述的一种藻油DHA的制备方法，其特征在于，所述的微藻包括裂殖壶藻、等鞭金藻、寇式隐甲藻、微绿球藻、绿色巴夫藻、布朗葡萄藻、三角褐指藻、菱形藻、小球藻、栅藻或者杜氏藻。
6.如权利要求1所述的一种藻油DHA提取制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体执行过程如下：
(31)将一定量微藻粉末置于烧杯中，加入少量提取溶剂，放入超声水浴中，在一定超声功率下进行超声预处理一定时间；
(32)超声预处理之后，把烧杯中的微藻抽滤；
(33)微藻粉末装入滤纸筒，滤液倒入圆底烧瓶，作为索氏抽提的提取溶剂，安装索氏提取器。
7.根据权利要求1所述的一种藻油DHA的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)包含准备培养基以及异氧发酵的过程；
所述准备培养基包含,
步骤(11)固体培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；琼脂2％；
步骤(12)一级种子培养基：
培养基组成：葡萄糖40g，味精35g，酵母膏6g，氯化钠8g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.5g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
步骤(13)二级种子培养基：
培养基组成：培养基组成：葡萄糖50g，味精40g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁8g，无水氯化钙0.8g，碳酸氢钠0.3g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
步骤(14)发酵培养基：
培养基组成：葡萄糖30g，味精30g，酵母膏6g，氯化钠10g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁6g，无水氯化钙1g，碳酸氢钠0.4g，A5溶液1ml，土浸液2ml，纯净水1000ml；
步骤(15)菌种保藏培养基：
所述固体培养基或发酵培养基中添加有青霉素，添加量为50～100mg/L，并低温保藏。
8.根据权利要求7所述的一种藻油DHA的制备方法，其特征在于：所述异养发酵包含如下步骤，
(S21)一级种子培养：
从固体培养基的平板上取一定量纯的寇氏隐甲藻，接种到一级种子培养基，置于摇床上，28℃、120rpm条件下培养48小时，得到一级种子；
(S22)二级种子培养：
将一级种子按20％的接种量转接到二级种子培养基，28℃、150rpm条件下培养48小时，得到二级液体种子；
(S23)发酵培养：
取5L标准发酵罐，自动调控温度、pH、溶氧、搅拌速度、通风量和流加速度；发酵条件为：将二级液体种子按4％接种量接种于发酵培养基中，在25℃和4L/min的通气量下培养；每12h取样，测定葡萄糖浓度、生物量；每24h测定脂肪酸和DHA含量；通过流加2mol/LHCl或2mol/LNaOH自动控制发酵液pH。
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