CN109956856A - 从辅酶q10发酵菌粉中提取辅酶q10和磷脂的方法 - Google Patents

从辅酶q10发酵菌粉中提取辅酶q10和磷脂的方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法。该方法的特征在于，以三维Hansen溶解度参数在21‑23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10‑12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂对辅酶Q10生产菌株的发酵菌粉进行浸提。本发明从辅酶Q10发酵菌粉中可以高效提取辅酶Q10和磷脂两种产品，工艺过程可操作性强，易于工业化生产，产品纯度和收率高，经济效益好。

Description

从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，特别涉及一种从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法。
背景技术
辅酶Q10广泛应用于生物医药、化妆品和保健品等领域，具有增强人体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、保护心脏和大脑、改善微循环、促进学习记忆、提高运动能力等作用，其分子式如下。
制备辅酶Q10的方法主要有动物细胞提取法、烟叶茄尼醇半合成法、完全合成法、微生物发酵法和植物细胞培养法等。其中微生物发酵提取法是主要生产方式。关于辅酶Q10的提取方法，传统的方法为有机溶剂提取法，近年则发展了超声辅助法、超临界二氧化碳提取法、亚临界流体提取法等。
中国专利CN101314782A公开了一种从菌体中提取辅酶Q10的方法，以氯仿、丙酮、四氯化碳、石油醚等为溶剂进行回流萃取5-60分钟，将提取物蒸干溶剂后再用乙醚或石油醚溶解，然后进行硅胶柱层析提纯得辅酶Q10。
中国专利CN102557912A公开了一种辅酶Q10提取液的皂化方法，首先以石油醚、戊烷、正己烷、庚烷、辛烷等为溶剂，在10-50℃下搅拌1-3小时，从辅酶Q10菌体中进行提取，提取次数为2-4次，然后将提取液进行皂化。
中国专利CN104529738A公开了一种从菌体中提取辅酶Q10的方法，将菌体经破壁和皂化处理后，以石油醚为溶剂萃取2次，将溶剂蒸发后再经纯化处理得到辅酶Q10。
中国专利CN104694613A公开了一种从菌体中提取辅酶Q10的方法，先以正己烷为溶剂进行提取，再进行皂化，最后经硅胶柱层析、重结晶等步骤得到辅酶Q10。
中国专利CN106146278A公开了一种从菌渣中提取辅酶Q10的方法，以正己烷、乙酸乙酯、正庚烷、石油醚、丙酮等为溶剂进行渗漉提取，渗漉液浓缩得固态粗产物后用正己烷、正庚烷或石油醚中的任一种溶解，再经多级萃取除杂后得到辅酶Q10。
中国专利CN101381747A公开了一种超声辅助提取辅酶Q10的方法，以水、丙酮、氯仿、正己烷、乙醚、甲醇、乙醇或石油醚为溶剂，于0℃下进行超声，超声频率为0.2-0.8，功率为300-500W，然后分离得到辅酶Q10。
中国专利CN103819326A公开了一种超声辅助提取辅酶Q10的方法，先将菌体在盐酸溶液中进行超声破碎，超声频率为0.3-0.8，功率为200-800W，调整pH值为5-9后以甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷中的至少一种为溶剂萃取2次，每次搅拌提取2-3小时，提取温度为20-80℃，然后经层析和结晶得到辅酶Q10。
中国专利CN102391092A公开了一种用超临界二氧化碳从菌体中提取辅酶Q10的方法，萃取条件为：压力24.5MPa，温度35℃，萃取时间45分钟，萃取液经碱处理、硅胶柱层析等得到辅酶Q10。
中国专利CN104591993A公开了一种用亚临界丙烷、丁烷、二甲醚等从菌体中提取辅酶Q10的方法，萃取条件为：压力0.2-1.0MPa，温度10-60℃，萃取时间10-60分钟，再经后续提纯处理得到辅酶Q10。
上述方法从辅酶Q10发酵菌粉中仅提取出一种有效成分，即辅酶Q10。对于菌粉中的其它有效成分，如磷脂等，则以菌渣的形式废弃，或在皂化过程中被破坏，造成了磷脂的浪费。
磷脂，是含有磷脂根的类脂化合物，是生命基础物质，几种常见磷脂的分子式如下:
磷脂对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用。另外，磷脂还具有促进脂肪代谢，防止脂肪肝，降低血清胆固醇、改善血液循环、预防心血管疾病的作用。磷脂可以分解过高的血脂和过高的胆固醇，清扫血管，使血管循环顺畅，被公认为“血管清道夫”。在美国，卵磷脂类保健品总销量仅次于复合维生素和维生素E而名列第三。在食品工业中，磷脂常被用作乳化剂，让油类能分散于水中。
在辅酶Q10发酵菌粉中，磷脂含量在10％以上，是辅酶Q10含量的3倍以上。然而辅酶Q10和磷脂分子结构差异很大，想要高效地将辅酶Q10和磷脂两者从辅酶Q10发酵菌粉中提取出来存在巨大的技术难度。而现有技术中也鲜有关于辅酶Q10发酵菌粉中磷脂提取技术的报道。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是解决现有技术中从辅酶Q10发酵菌粉中仅提取辅酶Q10，而大量的磷脂成分作为菌渣处理的问题，提供了一种从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法。
用于解决问题的方案
本发明涉及一种从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法，以三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂对辅酶Q10生产菌株的发酵菌粉进行浸提。
上述方法中，所述混合溶剂是由溶剂(a)与溶剂(b)形成的混合溶剂，所述溶剂(a)为四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醚、丁酮、二氯甲烷、氯仿、正戊烷、正己烷、正庚烷、和环己烷的至少一种，且所述溶剂(b)为甲醇、乙醇、正丙醇、和异丙醇的至少一种。
上述方法中，所述混合溶剂优选为四氢呋喃-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-乙醇、氯仿-甲醇、氯仿-乙醇、正己烷-甲醇、正己烷-乙醇、或正己烷-正丙醇。
上述方法中，所述混合溶剂的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的3-10倍；优选所述浸提的温度为10-60℃，和进行2-5次的所述浸提。
上述方法中，所述浸提为浸渍提取、渗漉提取、回流提取、煎煮提取、和超声波辅助提取中的一种；优选地，所述浸提为浸渍提取。
上述方法中，进行所述浸提后得到的浸提液通过下述方法进行分离：
1)将所述浸提液浓缩至干，用低极性溶剂溶解，过滤去除不溶物，再浓缩至辅酶Q10发酵菌粉重量的30％-90％，再将其加入到丙酮中；待其完全混溶后，进行冷却结晶，过滤得滤饼和滤液；滤饼用丙酮进行洗涤，干燥后得到磷脂；和
2)合并步骤1)中得到的滤液和洗涤液，浓缩至干，加入正己烷溶解，然后用低碳醇水溶液进行洗涤；将洗涤后的溶液浓缩至干，加入乙醇溶解，然后降温结晶，得辅酶Q10粗品。
上述方法中，步骤1)中所述低极性溶剂为戊烷、己烷、和石油醚中的一种；优选所述低极性溶剂的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的1-5倍。
上述方法中，步骤1)中所述丙酮的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的2-8倍；步骤2)中所述正己烷的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的0.5-4倍。
上述方法中，步骤2)中所述低碳醇水溶液为甲醇水溶液、乙醇水溶液、和异丙醇水溶液中的一种；优选其中低碳醇的质量百分数为50％-95％；还优选所述低碳醇水溶液的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的1-8倍。
上述方法中，步骤2)所述结晶的温度为0-20℃，优选所述乙醇的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的0.2-0.8倍。
上述方法中，步骤2)中在结晶前，加入脱色剂，进行脱色处理；优选所述脱色剂为活性炭、白土、和吸附性树脂中的一种。
上述方法中，步骤2)得到的辅酶Q10粗品经硅胶柱层析，得到高纯辅酶Q10。
发明的效果
本发明从辅酶Q10发酵菌粉中可以高效提取辅酶Q10和磷脂两种产品，工艺过程可操作性强，易于工业化生产，产品纯度和收率高，经济效益好。
附图说明
图1是本发明实施例1得到的磷脂31P核磁谱图。
图2是本发明实施例1得到的辅酶Q10成品HPLC谱图。
具体实施方式
研究发现，虽然辅酶Q10和磷脂的分子结构差异很大，但均具备长碳链结构和可形成氢键的官能团。当对辅酶Q10发酵菌粉浸提所用溶剂的三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间时，可以高效地将辅酶Q10和磷脂两者从辅酶Q10发酵菌粉中提取出来。
常见溶剂的三维Hansen溶解度参数可以方便地在文献(如工具书：《HansenSolubility Parameters A User's Handbook》)中获取，然而，几乎所有单一溶剂的三维Hansen溶解度参数及其氢键项的贡献并不在上述范围之内，为此，需使用混合溶剂。混合溶剂的溶解度参数具有线性加和性，按如下公式I计算：
公式I
其中δmix为混合溶剂的三维Hansen溶解度参数，为混合溶剂中第i个组分所占的体积分数，δi为混合溶剂中第i个组分的三维Hansen溶解度参数。
混合溶剂溶解度参数氢键项的贡献按如下公式II计算：
公式II
其中δh,mix为混合溶剂的三维Hansen溶解度参数氢键项的贡献，为混合溶剂中第i个组分所占的体积分数，δh,i为混合溶剂中第i个组分的三维Hansen溶解度参数氢键项的贡献。
本发明从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法是：以三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂对辅酶Q10发酵菌粉进行浸提，然后再对浸提液进行分离，得到磷脂和辅酶Q10。
所述三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂是由溶剂(a)与溶剂(b)形成的混合溶剂，所述溶剂(a)为四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醚、丁酮、二氯甲烷、氯仿、正戊烷、正己烷、正庚烷、和环己烷的至少一种，且所述溶剂(b)为甲醇、乙醇、正丙醇、和异丙醇的至少一种。
作为优选的，所述三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂的组合为四氢呋喃-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-乙醇、氯仿-甲醇、氯仿-乙醇、正己烷-甲醇、正己烷-乙醇、正己烷-正丙醇中的一种。
所述混合溶剂的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的3-10倍。
所述浸提方式没有特别的要求。作为优选的，所述浸提可以为浸渍提取、渗漉提取、回流提取、煎煮提取或超声波辅助提取中的一种。更为优选的，所述浸提为浸渍提取。
所述浸提的操作可以采用本领域通用的操作方式，只要能够有效提取辅酶Q10和磷脂即可。其中，优选浸提温度为10-60℃，优选浸提2-5次。
在本发明中以三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂对辅酶Q10发酵菌粉中的有效成分进行提取，能够兼顾辅酶Q10和磷脂的提取效率，实现了辅酶Q10和磷脂两种有效成分的高效提取。
上述的从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法所得到的浸提液用如下方法进行分离：
1)将浸提液浓缩至干，用低极性溶剂溶解，过滤去除不溶物，再浓缩至辅酶Q10发酵菌粉重量的30％-90％，再将其加入到丙酮中。待其完全混溶后，进行冷却结晶，过滤得滤饼和滤液。滤饼用丙酮进行洗涤，干燥后得到磷脂。
2)合并步骤1)中得到的滤液和洗涤液，浓缩至干，加入正己烷溶解，然后用低碳醇水溶液进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干，加入乙醇溶解，进行结晶，得辅酶Q10粗品。
在步骤1)中将浸提物进行浓缩，浓缩物用低极性溶剂溶解，过滤，将大部分高极性杂质以不溶物的形式去除，提高了浸提液中辅酶Q10和磷脂的纯度。所述低极性溶剂为戊烷(正戊烷、异戊烷、新戊烷及其混合物)、己烷(正己烷、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、2，3-二甲基丁烷、2，2-二甲基丁烷及其混合物)或石油醚中的一种，所述低极性溶剂的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的1-5倍。
在步骤1)中将低极性溶剂进行浓缩后，利用了磷脂在丙酮中溶解度低，而辅酶Q10在丙酮中溶解度高的特点，十分简单的就可以将磷脂以不溶物的形式从丙酮溶液中分离出来，以高收率得到了高纯度的磷脂产品。所述丙酮的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的2-8倍；步骤2)中正己烷用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的0.5-4倍。
在步骤2)中将合并的滤液和洗涤液中丙酮浓缩后，加入正己烷进行溶解，用低碳醇水溶液进行洗涤，将高极性杂质去除，进一步提高了溶液中辅酶Q10的纯度，为后续结晶过程的顺利进行提供了保证。所述低碳醇水溶液为甲醇水溶液、乙醇水溶液、和异丙醇水溶液中的一种，其中低碳醇的质量百分数为50％-95％，所述低碳醇水溶液的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的1-8倍。
步骤2)所述的结晶温度为0-20℃，所述乙醇的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的0.2-0.8倍。
步骤2)中进行结晶前，可加入脱色剂，进行脱色处理。所述脱色剂可以为活性炭、白土或吸附树脂中的一种。
上述步骤2)得到的辅酶Q10粗品可再进行纯化处理，如进行硅胶柱层析，即可得到高纯度的辅酶Q10。
在本发明中，所述辅酶Q10发酵菌粉是指辅酶Q10生产菌株在发酵后的经烘干后得到的干菌体。
所述产辅酶Q10细菌可以为土壤杆菌属、曲霉属、醋酸杆菌属、氨基杆菌属、土壤单胞菌属、嗜酸菌属、布勒担孢酵母属(Bulleromyces)、布勒掷胞酵母属、短波单胞菌属、隐球菌属、雪球酵母属(Chionosphaera)、念珠菌属、片花耳属(Cerinosterus)、网柄菌属(Exisophiala)、外担子菌属、费落酵母属(Fellomyces)、线状黑粉菌属、费落担子属(Filobasidium)、地霉属、粉座菌属、葡糖杆菌属、考克娃酵母属(Kockovaella)、克氏担孢酵母属(Kurtzmanomyces)、拉拉利亚属(Lalaria)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、军团菌属、甲基杆菌属、枝动菌属、卵胞酵母属、假单胞菌属、普西多酵母属(Psedozyma)、副球菌属、石座菌属(Petromyces)、红酵母属、红冬胞属、根单胞菌属、红菌属、红游动菌属、红假单胞菌属、红细菌属、掷胞酵母属、锁掷酵母属、齐藤酵母属(Saitoella)、裂殖糖酵母属、鞘氨醇单胞菌属、孢子丝菌属、子囊分生孢霉属(Sympodiomycopsis)、小梗担孢子属(Sterigmatosporidium)、外囊菌属、银耳属、丝胞酵母属、替拉替利属(Tilletiaria)、腥黑粉菌属、褶胞黑粉菌属、腥掷孢菌属(Tilletiopsis)、黑粉菌属、优地诺酵母属(Udeniomyces)、嗜黄酵母属(Xanthophilomyces)、黄色杆菌属、拟青霉属、顶胞霉属、生丝单胞菌属或根瘤菌属的微生物。
作为优选的，所述产辅酶Q10微生物为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)；更优选地，类球红细菌为菌种保藏编号CGMCC No.5997的类球红细菌、菌种保藏编号CGMCCNo.5998的类球红细菌；和/或菌种保藏编号CGMCC No.5999的类球红细菌。
所述产辅酶Q10微生物的发酵方法可参考现有技术，如JP2008253271(A)、CN105420417A等专利文献中的发酵技术。优选的，参照CN105420417A，利用在线控制氧消耗速率和电导率结合本发明技术方案进行。具体的，在类红球细菌发酵生长阶段控制氧消耗速率在30-150mmol/(L·h)之间，同时电导率稳定在5-30ms/cm之间；在底物合成积累阶段控制氧消耗速率在60-120mmol/(L·h)之间，同时电导率稳定在8-15ms/cm之间。在发酵阶段，使用的培养基为本领域常规的含有碳源、氮源、磷源和微量营养素的培养基。例如，每升培养基中酵母粉8g，氯化铵3g，氯化钠2.8g，柠檬酸铁0.005g，磷酸二氢钾0.6g，磷酸氢二钾0.9g，硫酸镁12.55g，氯化钙0.1g，pH值7.0。所述电导率通过补料培养基控制，用于本发明的补料培养基没有特别限制，可以是各种常规的含有碳源、氮源、磷源和微量营养素的培养基。例如所述补料培养基为如下配方—每升补料液中含酵母粉8～12g，硫酸铵5～10g，硫酸镁1～2g，氯化钠3～6g，磷酸二氢钾2～4g，磷酸氢二钾2～4g，氯化钙1～2g，生物素0.013～0.025g，pH值7.0。
实施例
参考专利CN105420417A中的发酵技术制备得到发酵菌粉，具体如下：
种子培养：用无菌水洗涤培养好的斜面，制成108～109个细胞每毫升的菌悬液，移取10ml到装量500ml/1000ml的种子瓶中，在30℃、180-250rpm的条件下培养22-26小时。
发酵培养：将上述步骤所得种子液接种到装有发酵培养基的5升发酵罐，接种量10％，培养温度29-33℃，罐内压力0.03～0.05Mpa，接种后初始搅拌转速500rpm，空气流量9L/min。24小时后调节转速至600rpm，控制补料培养基的加入速率使发酵液电导率维持在10-20ms/cm范围内，全程罐内残留葡萄糖控制在0.5-2.0％之间，发酵培养110小时左右。
采用的菌种为菌种保藏编号CGMCC No.5999的类红球细菌。
发酵培养基为每升培养基中含：酵母粉8g、氯化铵3g、氯化钠2.8g、柠檬酸铁0.005g、磷酸二氢钾0.6g、磷酸氢二钾0.9g、硫酸镁12.55g、氯化钙0.1g，pH值调节为7.0。
补料培养基配方为每升补料液中含：酵母粉12g、硫酸铵10g、硫酸镁2g、氯化钠6g、磷酸二氢钾4g、磷酸氢二钾4g、氯化钙2g、生物素0.025g，pH值调整为7.0，补料培养基电导率为23.0ms/cm。
发酵结束后，过滤发酵液，得到湿菌体。在60℃下进行烘干，得到干燥的发酵菌粉。
液相色谱外标法检测菌粉中磷脂含量为11.99％，辅酶Q10含量为2.83％。
实施例1
取100g上述辅酶Q10发酵菌粉，加入300g四氢呋喃-甲醇混合溶剂(四氢呋喃所占体积分数为72％，混合溶剂的三维Hansen溶解度参数为22.2(J/cm3)1/2，其氢键项的贡献为12.0(J/cm3)1/2)进行浸渍提取，浸提温度为10℃，浸提3次，得浸提液。将浸提液浓缩至干，回收混合溶剂，浓缩物用200g正己烷溶解，过滤去除不溶物，再浓缩至60g，将其加入到300g丙酮中，于50℃搅拌2小时，而后降温至0℃，保温结晶2小时，过滤，得滤饼和滤液。将所得滤饼用少量丙酮洗涤，干燥后得磷脂12.1g，纯度为95.2％，收率为96.1％，主要成分为磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂，其31P核磁谱图见图1。
合并上述滤液和丙酮洗涤液，浓缩至干，加入100g正己烷溶解，然后用800g甲醇水溶液(甲醇所占的质量百分比为80％)进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干，加入40g乙醇于60℃搅拌溶解，加入活性炭脱色2小时，过滤，滤液降温至0℃，保温结晶5小时，过滤，得辅酶Q10粗品。将辅酶Q10粗品进行硅胶柱层析分离，得辅酶Q10成品2.72g，纯度为99.2％，收率为95.3％，HPLC谱图见图2。
实施例2
取100g上述辅酶Q10发酵菌粉，加入300g四氢呋喃-甲醇混合溶剂(四氢呋喃所占体积分数为78％，混合溶剂的三维Hansen溶解度参数为21.6(J/cm3)1/2，其氢键项的贡献为11.1(J/cm3)1/2)进行浸渍提取，浸提温度为10℃，浸提5次，得浸提液。将浸提液浓缩至干，回收混合溶剂，浓缩物用100g 2-甲基戊烷溶解，过滤去除不溶物，再浓缩至30g，将其加入到200g丙酮中，于50℃搅拌0.5小时，而后降温至0℃，保温结晶2小时，过滤，得滤饼和滤液。将得到的滤饼用少量丙酮洗涤，干燥后得磷脂11.9g，纯度为96.5％，收率为95.8％，主要成分为磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂。
合并上述滤液和丙酮洗涤液，浓缩至干，加入50g正己烷溶解，然后用400g甲醇水溶液(甲醇所占的质量百分比为95％)进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干，加入30g乙醇于50℃搅拌溶解，加入活性炭脱色1小时，过滤，滤液降温至0℃，保温结晶1小时，过滤，得辅酶Q10粗品。将辅酶Q10粗品进行硅胶柱层析分离，得辅酶Q10成品2.76g，纯度为99.1％，收率为96.6％。
实施例3
取100g上述辅酶Q10发酵菌粉，加入800g四氢呋喃-甲醇混合溶剂(四氢呋喃所占体积分数为84％，混合溶剂的三维Hansen溶解度参数为21.0(J/cm3)1/2，其氢键项的贡献为10.3(J/cm3)1/2)进行浸渍提取，浸提温度为30℃，浸提2次，得浸提液。将浸提液浓缩至干，回收混合溶剂，浓缩物用300g正戊烷溶解，过滤去除不溶物，再浓缩至40g，将其加入到300g丙酮中，于40℃搅拌1小时，而后降温至-10℃，保温结晶0.5小时，过滤，得滤饼和滤液。将得到的滤饼用少量丙酮洗涤，干燥后得磷脂12.3g，纯度为95.1％，收率为97.6％，主要成分为磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂。
合并上述滤液和丙酮洗涤液，浓缩至干，加入200g正己烷溶解，然后用400g乙醇水溶液(乙醇所占的质量百分比为60％)进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干，加入20g乙醇于40℃搅拌溶解，加入吸附树脂脱色2小时，过滤，滤液降温至10℃，保温结晶4小时，过滤，得辅酶Q10粗品。将辅酶Q10粗品进行硅胶柱层析分离，得辅酶Q10成品2.72g，纯度为99.5％，收率为95.6％。
实施例4
取100g上述辅酶Q10发酵菌粉，加入500g氯仿-乙醇混合溶剂(氯仿所占体积分数为54％，混合溶剂的三维Hansen溶解度参数为22.5(J/cm3)1/2，其氢键项的贡献为12.0(J/cm3)1/2)进行回流浸提，浸提温度为60℃，浸提2次，得浸提液。将浸提液浓缩至干，回收混合溶剂，浓缩物用200g异戊烷溶解，过滤去除不溶物，再浓缩至40g，将其加入到400g丙酮中，于30℃搅拌2小时，而后降温至-10℃，保温结晶2小时，过滤，得滤饼和滤液。将得到的滤饼用少量丙酮洗涤，干燥后得磷脂12.0g，纯度为95.8％，收率为95.9％，主要成分为磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂。
合并上述滤液和丙酮洗涤液，浓缩至干，加入100g正己烷溶解，然后用100g乙醇水溶液(乙醇所占的质量百分比为85％)进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干，加入50g乙醇于60℃搅拌溶解，加入活性炭脱色2小时，而后降温至10℃，保温结晶6小时，过滤，得辅酶Q10粗品。将辅酶Q10粗品进行硅胶柱层析分离，得辅酶Q10成品2.75g，纯度为99.1％，收率为96.3％。
实施例5
取100g上述辅酶Q10发酵菌粉，在渗漉筒中使用1000g正己烷-正丙醇混合溶剂(正己烷所占体积分数为35％，混合溶剂的三维Hansen溶解度参数为21.1(J/cm3)1/2，其氢键项的贡献为11.3(J/cm3)1/2)进行渗漉法提取，提取温度为20℃，反复渗漉3次，得浸提液。将浸提液浓缩至干，回收混合溶剂，浓缩物用500g石油醚溶解，过滤去除不溶物，再浓缩至80g，将其加入到600g丙酮中，于30℃搅拌2小时，而后降温至10℃，保温结晶3小时，过滤，得滤饼和滤液。将得到的滤饼用少量丙酮洗涤，干燥后得磷脂11.8g，纯度为97.1％，收率为95.6％，主要成分为磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂。
合并上述滤液和丙酮洗涤液，浓缩至干，加入300g正己烷溶解，然后用200g异丙醇水溶液(异丙醇所占的质量百分比为50％)进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干，加入60g乙醇于50℃搅拌溶解3小时，加入活性炭脱色3小时，过滤，滤液降温至20℃，保温结晶5小时，过滤，得辅酶Q10粗品。将辅酶Q10粗品进行硅胶柱层析分离，得辅酶Q10成品2.77g，纯度为99.4％，收率为97.3％。
实施例6
取100g上述辅酶Q10发酵菌粉，加入400g乙酸乙酯-乙醇混合溶剂(乙酸乙酯所占体积分数为61％，混合溶剂的三维Hansen溶解度参数为21.4(J/cm3)1/2，其氢键项的贡献为12.0(J/cm3)1/2)进行浸渍提取，浸提温度为60℃，浸提2次，得浸提液。将浸提液浓缩至干，回收混合溶剂，浓缩物用200g石油醚溶解，过滤去除不溶物，再浓缩至90g，将其加入到800g丙酮中，于20℃搅拌3小时，而后降温至10℃，保温结晶5小时，过滤，得滤饼和滤液。将得到的滤饼用少量丙酮洗涤，干燥后得磷脂12.0g，纯度为96.4％，收率为96.5％，主要成分为磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂。
合并上述滤液和丙酮洗涤液，浓缩至干，加入400g正己烷溶解，然后用200g异丙醇水溶液(异丙醇所占的质量百分比为70％)进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干，加入80g乙醇于70℃搅拌溶解，加入白土脱色0.5小时，过滤，滤液降温至20℃，保温结晶10小时，过滤，将滤饼加入40g乙醇再进行一次重结晶，得辅酶Q10粗品。将辅酶Q10粗品进行硅胶柱层析分离，得辅酶Q10成品2.70g，纯度为99.6％，收率为95.0％。

Claims (12)

1.一种从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法，其特征在于，以三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂对辅酶Q10生产菌株的发酵菌粉进行浸提。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合溶剂是由溶剂(a)与溶剂(b)形成的混合溶剂，所述溶剂(a)为四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醚、丁酮、二氯甲烷、氯仿、正戊烷、正己烷、正庚烷、和环己烷的至少一种，且所述溶剂(b)为甲醇、乙醇、正丙醇、和异丙醇的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述混合溶剂为四氢呋喃-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-乙醇、氯仿-甲醇、氯仿-乙醇、正己烷-甲醇、正己烷-乙醇、或正己烷-正丙醇。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述混合溶剂的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的3-10倍；优选所述浸提的温度为10-60℃，和进行2-5次的所述浸提。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述浸提为浸渍提取、渗漉提取、回流提取、煎煮提取、和超声波辅助提取中的一种；优选地，所述浸提为浸渍提取。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，进行所述浸提后得到的浸提液通过下述方法进行分离：
1)将所述浸提液浓缩至干，用低极性溶剂溶解，过滤去除不溶物，再浓缩至辅酶Q10发酵菌粉重量的30％-90％，再将其加入到丙酮中；待其完全混溶后，进行冷却结晶，过滤得滤饼和滤液；滤饼用丙酮进行洗涤，干燥后得到磷脂；和
2)合并步骤1)中得到的滤液和洗涤液，浓缩至干，加入正己烷溶解，然后用低碳醇水溶液进行洗涤；将洗涤后的溶液浓缩至干，加入乙醇溶解，然后降温结晶，得辅酶Q10粗品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述低极性溶剂为戊烷、己烷、和石油醚中的一种；优选所述低极性溶剂的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的1-5倍。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述丙酮的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的2-8倍；步骤2)中所述正己烷的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的0.5-4倍。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述低碳醇水溶液为甲醇水溶液、乙醇水溶液、和异丙醇水溶液中的一种；优选其中低碳醇的质量百分数为50％-95％；还优选所述低碳醇水溶液的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的1-8倍。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)所述结晶的温度为0-20℃，优选所述乙醇的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的0.2-0.8倍。
11.根据权利要求6-10任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中在结晶前，加入脱色剂，进行脱色处理；优选所述脱色剂为活性炭、白土、和吸附性树脂中的一种。
12.根据权利要求6-11任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)得到的辅酶Q10粗品经硅胶柱层析，得到高纯辅酶Q10。
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