CN112159825A - 一种发酵提取dha的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种发酵提取DHA的方法。本发明采用混合的芽孢杆菌和假丝酵母菌对裂壶藻进行发酵，将破壁过程和DHA富集过程相联合，使在破壁的同时对DHA进行富集提取，提高了裂壶藻的破壁率以及DHA的提取率，并减少腥味的产生，降低后续脱臭工序的难度，所得DHA藻油成品无溶剂残留，生产成本低，生产效率高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种发酵提取DHA的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)是第一个不饱和键出现在碳链甲基端第三位的不饱和脂肪酸，多以油脂形式存在。人的乳汁中含有DHA，DHA和胎儿的认知有关，其对大脑思维和记忆形成过程有直接影响，并能改善视敏锐性，促进视功能的发展[1-2]。医学上也已经证明它对心血管疾病、癌症、精神分裂症和阿尔茨海默氏症有治疗作用[3-5]。如今市面上在售的DHA产品有很多，涉及饲料、奶粉、饮品等，其市场价值还在不断挖掘。生产DHA的传统来源是海洋鱼油，但鱼油存在着加工成本高、易氧化的缺点。海洋微藻和海洋真菌作为DHA的新来源，比鱼油更有优势，利用这些新资源生产DHA具有广阔的前景。目前微藻和真菌发酵生产DHA的研究已取得了一定的进展。
裂壶藻是一种类藻异养的海洋真菌，是目前用于商业化生产DHA的高产菌种之一。裂壶藻的脂质主要存在于由细胞壁包裹的裂壶藻细胞内。其中，总脂肪酸中有35％-45％为DHA[6]。裂壶藻细胞壁比较厚且结构紧密，如何高效破壁成为提高油脂和DHA提取率的关键[7]。目前，可采取三种方法对藻体细胞进行破壁，分别是物理法、生物法和化学法。其中，物理法有反复冻融法、高压匀浆法、珠磨法等；化学法有有机溶剂法和碱热法；生物法有酶溶法，包括溶菌酶法和自溶酶法等[8]。
其中，反复冻溶法涉及的高温可能会带来藻体和藻油一些不良的变化[9]；高压均质机法适合于大规模生产，破碎效率高，但是能耗高，设备费用较高，因此限制了其应用[10]；珠磨法设备成熟，便于控温，易于放大，劳动强度低，是规模化破壁常考虑的方法，其主要缺陷是机械摩擦造成能量损失，并影响生物产物的活性[11]；有机溶剂法破壁效果好，但可能存在溶剂残留问题，而碱热法还可能引起目标产物变性分解[12]；酶溶法破壁条件温和、耗能少，可达到良好的破壁效果，但由于常需用到多种酶进行组合，相对复杂且成本较高[13-15]，另外由于酶解时藻细胞内容物质大量渗出，故收集的油脂腥味很重[16]。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种发酵提取DHA的方法，以提高裂壶藻的破壁率以及所得DHA藻油成品中的DHA含量，同时使所得DHA藻油成品无溶剂残留，降低后续脱臭工序的难度，成本更加低廉。
为实现上述目的，本发明提供了一种发酵提取DHA的方法，包括以下步骤：
(1)将裂壶藻藻粉和水混合，得到发酵培养基；
(2)在所述发酵培养基中接种混合菌液，发酵后静置或离心，得到第一DHA粗油；
(3)将所述第一DHA粗油在-10～0℃下冷冻后，过滤或离心，得到第二DHA粗油；
(4)将所述第二DHA粗油脱色后，脱胶脱臭，加入抗氧化剂，得到DHA藻油成品；
其中混合菌液中包括芽孢杆菌和假丝酵母菌。
上述方法主要以裂壶藻藻粉作为固态发酵基质，并采用芽孢杆菌和假丝酵母菌进行发酵，将破壁过程和DHA富集过程联合，即在破壁过程中，初步实现对DHA的富集作用，提高了第一DHA粗油中的DHA含量，进而提高了DHA藻油成品中的DHA含量，且无溶剂残留；同时破壁条件温和，相比直接采用多酶法破壁，可以减少腥味的产生，降低后续脱臭工序的难度，而且成本更低，还缩短了工艺流程。
优选地，所述发酵培养基中，裂壶藻藻粉和水的质量比为1：(10～20)；所述接种混合菌液后，发酵培养基中芽孢杆菌菌体的初始浓度为1～10×106cfu/mL，酵母菌菌体的初始浓度为1～10×105cfu/mL。
优选地，所述步骤(2)中，混合菌液质量为发酵培养基质量的5～10％，混合菌液主要由芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液配制而成，芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液的体积比为(1～3):1，芽孢杆菌培养液中芽孢杆菌菌体浓度为10×107cfu/mL，酵母菌培养液中酵母菌菌体浓度为1×107cfu/mL。
优选地，所述芽孢杆菌培养液由初始芽孢杆菌菌体经活化和扩增培养所得，其中芽孢杆菌扩增培养所用培养液包含葡萄糖、玉米粉、豆粕和水；所述假丝酵母菌培养液由初始假丝酵母菌菌体经活化和扩增培养所得，其中假丝酵母菌扩增培养所用培养液包含蛋白胨、蔗糖和无机盐。初始芽孢杆菌菌体的活化以及初始假丝酵母菌菌体的活化都采用本领域常规活化方法；这两种菌的扩增培养按一级培养或多级培养方法在适宜发酵条件下进行培养。假丝酵母菌扩增培养所用培养液中采用的无机盐可以选用氯化钠、磷酸二氢钾、碳酸钠等。
进一步优选地，所述芽孢杆菌扩增培养所用培养液包含以下质量百分比的组分：葡萄糖1.5％，玉米粉2％，豆粕4％；所述酵母菌扩增培养所用培养液包含以下质量百分比的组分：蛋白胨3.5％，蔗糖7.5％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.15％，硫酸铵0.1％。
优选地，所述芽孢杆菌扩增培养的条件为：温度35～37℃，初始pH值7.0～7.2，转速200r/min，时间45～50h；所述假丝酵母菌扩增培养的条件为：温度28～30℃，初始pH值5.5～6.0，转速200r/min，时间52～60h。
进一步优选地，所述芽孢杆菌扩增培养的条件为：温度35℃，初始pH值7.0，转速200r/min，时间48h；所述假丝酵母菌扩增培养的条件为：温度30℃，初始pH值5.5，转速200r/min，时间55h。
优选地，所述发酵的条件为：温度为30～37℃，时间为1～48h，pH值为7.0～8.0。
进一步优选地，所述发酵的条件为：温度为35℃，时间为32h，pH值为7.2。
优选地，所述发酵培养基中还包含以下重量份的组分：葡萄糖0.5％，蛋白胨0.2％，磷酸氢二钾0.5％，磷酸二氢钾0.3％。
优选地，所述步骤(2)中，发酵后离心得到第二DHA粗油，离心条件为：先在2000-4000rpm转速下离心10-20min，再在8000-12000rpm转速下离心10-20min。
进一步优选地，所述步骤(2)中，发酵后离心得到第二DHA粗油，离心条件为：先在3000rpm转速下离心10min，再在10000rpm转速下离心20min。
优选地，所述步骤(3)中，冷冻温度为-5℃。
优选地，所述步骤(4)中，采用活性炭进行脱色。
优选地，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)，所述假丝酵母菌为解脂假丝酵母菌(Candida lipolytica)。枯草芽孢杆菌安全不产毒素，有较强分泌纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶等能力，有利于破壁；解脂假丝酵母菌的脂肪酶产量高，有利于DHA的富集与提取，且安全性好。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明采用芽孢杆菌和酵母菌一起对裂壶藻藻粉制成的固态发酵基质进行发酵，将破壁过程和DHA富集过程相联合，使在破壁的同时对DHA进行富集提取，提高了裂壶藻的破壁率以及DHA的提取率，并减少腥味的产生，降低后续脱臭工序的难度，所得DHA藻油成品无溶剂残留，生产成本低，生产效率高。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明发酵提取DHA的方法，包括以下步骤：
(1)将裂壶藻藻粉和水混合，得到发酵培养基；
(2)将步骤(1)所得发酵培养基中接种混合菌液，发酵后静置或离心，得到第一DHA粗油；
(3)将步骤(2)所得第一DHA粗油在-10～0℃下冷冻以除去高熔点的甘油三酯，过滤或离心，得到第二DHA粗油；
(4)将步骤(3)所得第二DHA粗油脱色后，脱胶脱臭，加入抗氧化剂，得到DHA藻油成品；
其中混合菌液中包括芽孢杆菌和假丝酵母菌。
本发明中的裂壶藻藻粉可选择任意裂壶藻制成的粉末，可以选择自制，也可以选择市售，其中，市售的裂壶藻藻粉一般以裂壶藻为原料经培养、分离、干燥工艺生产而成，具有微藻全细胞、富含多不饱和脂肪酸、蛋白质等营养成分。
本发明中的芽孢杆菌可以选择任意芽孢杆菌，优选纤维素酶产量高的芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)，或与枯草芽孢杆菌的纤维素酶产量相近，或比其纤维素酶产量更高的芽孢杆菌，这样能更好的破坏裂壶藻的细胞壁，提取内容物。
本发明中的假丝酵母菌可选择任意假丝酵母菌，优选脂肪酶产量高的假丝酵母菌，如解脂假丝酵母菌(Candida lipolytica)，或与解脂假丝酵母菌的脂肪酶产量相近，或比其脂肪酶产量更高的酵母菌，这样能更好的使脂肪水解，从而更好的对DHA富集。
优选所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌，所述假丝酵母菌为解脂假丝酵母菌，这两种菌组合不仅安全性好，而且所得DHA的产量明显更高。优选发酵培养基中，裂壶藻藻粉和水的质量比为1：(10～20)。
优选接种混合菌液后，发酵培养基中芽孢杆菌菌体的初始浓度为1～10×106cfu/mL，假丝酵母菌菌体的初始浓度为1～10×105cfu/mL。进一步优选，步骤(2)中，混合菌液质量为发酵培养基质量的5～10％，混合菌液主要由芽孢杆菌培养液和假丝酵母菌培养液配制而成，芽孢杆菌培养液和假丝酵母菌培养液的体积比为(1～3):1，芽孢杆菌培养液中芽孢杆菌菌体浓度为10×107cfu/mL，假丝酵母菌培养液中假丝酵母菌菌体浓度为1×107cfu/mL。
优选发酵条件为：温度为30～37℃，时间为1～48h，pH值为7.0～8.0。进一步优选发酵条件为温度为35℃，时间为24h，pH值为7.2。
发酵培养基中还可以添加葡萄糖、蛋白胨、无机盐等以为芽孢杆菌和假丝酵母菌提供更加丰富的营养物质，提高其代谢活力。优选发酵培养基中还包含以下重量份的组分：葡萄糖0.5％，蛋白胨0.2％，磷酸氢二钾0.5％，磷酸二氢钾0.3％。
本发明中混合菌液可由芽孢杆菌培养液和假丝酵母菌培养液混合而成，也可以直接是芽孢杆菌和假丝酵母菌的混合液。优选混合菌液主要由芽孢杆菌培养液和假丝酵母菌培养液混合而成，芽孢杆菌培养液和假丝酵母菌培养液的体积比为芽孢杆菌培养液：假丝酵母菌培养液＝(1～3)：1，芽孢杆菌培养液中菌体浓度为10×107cfu/mL，假丝酵母菌培养液中菌体浓度为1×107cfu/mL，混合菌液的接种质量为发酵培养基质量的5～10％。当采用芽孢杆菌培养液和假丝酵母菌培养液混合制备混合菌液时，芽孢杆菌培养液一般采用市售的初始芽孢杆菌菌体经活化和扩增培养所得，其中活化方法可为任意常规的芽孢杆菌活化方法，扩增培养按一级培养或多级培养方法在适宜发酵条件下进行培养，扩增培养所用培养液包含葡萄糖、玉米粉、豆粕和水，优选扩增培养所用培养液包含1.5wt％葡萄糖、2wt％玉米粉、4wt％豆粕和余量水；假丝酵母菌培养液液一般采用市售的初始假丝酵母菌菌体经活化和扩增培养所得，其中活化方法可为任意常规的酵母菌活化方法，扩增培养按一级培养或多级培养方法在适宜发酵条件下进行培养，扩增培养所用培养液包含蛋白胨、蔗糖、无机盐和水，无机盐也可以选择氯化钠、磷酸二氢钾、碳酸盐等等，优选扩增培养所用培养液包含3.5wt％蛋白胨、7.5wt％蔗糖、0.2wt％磷酸二氢钾、0.15wt％硫酸镁、0.1wt％硫酸铵和余量水。
优选芽孢杆菌扩增培养的条件为：温度35～37℃，初始pH值7.0～7.2，转速200r/min，时间45～50h。进一步优选芽孢杆菌扩增培养的条件为：温度35℃，初始pH值7.0，转速200r/min，时间48h。
优选假丝酵母菌扩增培养的条件为：温度28～30℃，初始pH值5.5～6.0，转速200r/min，时间52～60h。进一步优选假丝酵母菌扩增培养的条件为：温度30℃，初始pH值5.5，转速200r/min，时间55h。
优选所述步骤(2)中，发酵后离心得到第二DHA粗油。进一步优选所述步骤(2)中采用两级以上的离心方法，如先在2000-4000rpm转速下离心10-20min，再在8000-12000rpm转速下离心10-20min。更进一步优选所述步骤(2)中的离心条件为先在3000rpm转速下离心10min，再在10000rpm转速下离心20min。
优选所述步骤(3)中，冷冻温度为-5℃。在-5℃下即能很好的将粗油中的高熔点成分(饱和脂肪酸等)固化，而保证DHA的纯度，有利于后续的分离。
优选所述步骤(4)中，采用活性炭进行脱色。采用活性炭不仅能很好的脱色，还能除去极性物质、金属离子等杂质。
实施例1
本实施例为本发明发酵提取DHA的方法的一种实施例。本实施例发酵提取DHA的方法包括以下步骤：
(1)将市售枯草芽孢杆菌和市售解脂假丝酵母菌分别活化、扩增培养，得到枯草芽孢杆菌培养液(菌体浓度为10×107cfu/mL)和解脂假丝酵母培养液(菌体浓度为1×107cfu/mL)，然后将枯草芽孢杆菌培养液和解脂假丝酵母培养液按体积比1:1混合，得到混合菌液，其中枯草芽孢杆菌扩增培养所用培养液包含1.5wt％葡萄糖、2wt％玉米粉、4wt％豆粕和余量水，扩增培养在摇床中进行，扩增培养的条件为：温度35℃，初始pH值7.0，摇床转速200r/min，时间48h；解脂假丝酵母菌扩增培养所用培养液包含3.5wt％蛋白胨、7.5wt％蔗糖、0.2wt％磷酸二氢钾、0.15wt％硫酸镁、0.1wt％硫酸铵和余量水，扩增培养在摇床中进行，扩增培养的条件为：温度30℃，初始pH值5.5，摇床转速200r/min，时间55h；
(2)将裂壶藻藻粉和水按裂壶藻藻粉：水＝1:10的质量比混合，并添加葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，得到含0.5wt％葡萄糖，0.2wt％蛋白胨，0.5wt％磷酸氢二钾，0.3wt％磷酸二氢钾的发酵培养基，然后添加5％的混合菌液(即混合菌液质量为发酵培养基质量的5％，其余实施例该添加量计算方法相同)，在发酵温度为35℃、pH值为7.2、发酵时间为24h的条件下进行发酵，发酵后先在3000rpm转速下离心10min，再在10000rpm转速下离心20min，得到第一DHA粗油；
(3)将第一DHA粗油在-5℃下冷冻，过滤除去其他油脂类物质，得到第二DHA粗油；
(4)将第二DHA粗油用活性炭进行脱色，再经过脱胶脱臭工序后加入抗氧化剂，得到DHA藻油成品。本实施例所采用的脱臭的工艺为：蒸汽连续脱臭，除臭所需时间为20min。镜检发现本实施例发酵后裂壶藻破壁率超过95％。所得DHA藻油成品无臭味，DHA含量为43.3wt％。
实施例2
本实施例为本发明发酵提取DHA的方法的一种实施例。本实施例发酵提取DHA的方法包括以下步骤：
(1)将市售枯草芽孢杆菌和市售解脂假丝酵母菌分别活化、扩增培养，得到枯草芽孢杆菌培养液(菌体浓度为10×107cfu/mL)和解脂假丝酵母培养液(菌体浓度为1×107cfu/mL)，然后将枯草芽孢杆菌培养液和解脂假丝酵母培养液按体积比枯草芽孢杆菌培养液：解脂假丝酵母培养液＝2:1混合，得到混合菌液，其中枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母菌的活化以及扩增培养均同实施例1；
(2)将裂壶藻藻粉和水按裂壶藻藻粉：水＝1:15的质量比混合，并添加葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，得到含0.5wt％葡萄糖，0.2wt％蛋白胨，0.5wt％磷酸氢二钾，0.3wt％磷酸二氢钾的发酵培养基，然后添加7％的混合菌液，在发酵温度为35℃、pH值为7.2、发酵时间为24h的条件下进行发酵，发酵后先在3000rpm转速下离心10min，再在10000rpm转速下离心20min，得到第一DHA粗油；
(3)将第一DHA粗油在-5℃下冷冻，过滤除去其他油脂类物质，得到第二DHA粗油；
(4)将第二DHA粗油用活性炭进行脱色，再经过脱胶脱臭工序后加入抗氧化剂，得到DHA藻油成品。本实施例所采用的脱色、脱胶脱臭工艺均同实施例1，除臭所需时间为20min。镜检发现本实施例发酵后裂壶藻破壁率超过95％。所得DHA藻油成品无臭味，DHA含量为42.5wt％。
实施例3
本实施例为本发明发酵提取DHA的方法的一种实施例。本实施例发酵提取DHA的方法包括以下步骤：
(1)将市售枯草芽孢杆菌和市售解脂假丝酵母菌分别活化、扩增培养，得到枯草芽孢杆菌培养液(菌体浓度为10×107cfu/mL)和解脂假丝酵母培养液(菌体浓度为1×107cfu/mL)，然后将枯草芽孢杆菌培养液和解脂假丝酵母培养液按体积比枯草芽孢杆菌培养液：解脂假丝酵母培养液＝3:1混合，得到混合菌液，其中枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母菌的活化以及扩增培养均同实施例1；
(2)将裂壶藻藻粉和水按裂壶藻藻粉：水＝1:15的质量比混合，并添加葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，得到含0.5wt％葡萄糖，0.2wt％蛋白胨，0.5wt％磷酸氢二钾，0.3wt％磷酸二氢钾的发酵培养基，然后添加9％的混合菌液，在发酵温度为35℃、pH值为7.2、发酵时间为24h的条件下进行发酵，发酵后先在3000rpm转速下离心10min，再在10000rpm转速下离心20min，得到第一DHA粗油；
(3)将第一DHA粗油在-5℃下冷冻，过滤除去其他油脂类物质，得到第二DHA粗油；
(4)将第二DHA粗油用活性炭进行脱色，再经过脱胶脱臭工序后加入抗氧化剂，得到DHA藻油成品。本实施例所采用的脱色、脱胶脱臭工艺均同实施例1，除臭所需时间为20min。镜检发现本实施例发酵后裂壶藻破壁率超过98％。所得DHA藻油成品无臭味，DHA含量为42.9wt％。
实施例4
本实施例为本发明发酵提取DHA的方法的一种实施例。本实施例发酵提取DHA的方法包括以下步骤：
(1)将市售枯草芽孢杆菌和市售解脂假丝酵母菌分别活化、扩增培养，得到枯草芽孢杆菌培养液(菌体浓度为10×107cfu/mL)和解脂假丝酵母培养液(菌体浓度为1×107cfu/mL)，然后将枯草芽孢杆菌培养液和解脂假丝酵母培养液按体积比枯草芽孢杆菌培养液：解脂假丝酵母培养液＝3:1混合，得到混合菌液，其中枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母菌的活化以及扩增培养均同实施例1；
(2)将裂壶藻藻粉和水按裂壶藻藻粉：水＝1:20的质量比混合，并添加葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，得到含0.5wt％葡萄糖，0.2wt％蛋白胨，0.5wt％磷酸氢二钾，0.3wt％磷酸二氢钾的发酵培养基，然后添加7％的混合菌液，在发酵温度为35℃、pH值为7.2、发酵时间为24h的条件下进行发酵，发酵后先在3000rpm转速下离心10min，再在10000rpm转速下离心20min，得到第一DHA粗油；
(3)将第一DHA粗油在-5℃下冷冻，过滤除去其他油脂类物质，得到第二DHA粗油；
(4)将第二DHA粗油用活性炭进行脱色，再经过脱胶脱臭工序后加入抗氧化剂，得到DHA藻油成品。本实施例所采用的脱色、脱胶脱臭工艺均同实施例1，除臭所需时间为20min。镜检发现本实施例发酵后裂壶藻破壁率超过98％。所得DHA藻油成品无臭味，DHA含量为43.2wt％。
实施例5
本实施例为本发明发酵提取DHA的方法的一种实施例。本实施例发酵提取DHA的方法包括以下步骤：
(1)将市售枯草芽孢杆菌和市售解脂假丝酵母菌分别活化、扩增培养，得到枯草芽孢杆菌培养液(菌体浓度为10×107cfu/mL)和解脂假丝酵母培养液(菌体浓度为1×107cfu/mL)，然后将枯草芽孢杆菌培养液和解脂假丝酵母培养液按体积比枯草芽孢杆菌培养液：解脂假丝酵母培养液＝3:1混合，得到混合菌液，其中枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母菌的活化以及扩增培养均同实施例1；
(2)将裂壶藻藻粉和水按裂壶藻藻粉：水＝1:20的质量比混合，并添加葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，得到含0.5wt％葡萄糖，0.2wt％蛋白胨，0.5wt％磷酸氢二钾，0.3wt％磷酸二氢钾的发酵培养基，然后添加10％的混合菌液，在发酵温度为30℃、pH值为7.0、发酵时间为1h的条件下进行发酵，发酵后先在3000rpm转速下离心10min，再在10000rpm转速下离心20min，得到第一DHA粗油；
(3)将第一DHA粗油在-5℃下冷冻，过滤除去其他油脂类物质，得到第二DHA粗油；
(4)将第二DHA粗油用活性炭进行脱色，再经过脱胶脱臭工序后加入抗氧化剂，得到DHA藻油成品。本实施例所采用的脱色、脱胶脱臭工艺均同实施例1，除臭所需时间为15min。镜检发现本实施例发酵后裂壶藻破壁率20％。所得DHA藻油成品无臭味，DHA含量为28.8wt％。
实施例6
本实施例为本发明发酵提取DHA的方法的一种实施例。本实施例发酵提取DHA的方法包括以下步骤：
(1)将市售枯草芽孢杆菌和市售解脂假丝酵母菌分别活化、扩增培养，得到枯草芽孢杆菌培养液(菌体浓度为10×107cfu/mL)和解脂假丝酵母培养液(菌体浓度为1×107cfu/mL)，然后将枯草芽孢杆菌培养液和解脂假丝酵母培养液按体积比枯草芽孢杆菌培养液：解脂假丝酵母培养液＝3:1混合，得到混合菌液，其中枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母菌的活化以及扩增培养均同实施例1；
(2)将裂壶藻藻粉和水按裂壶藻藻粉：水＝1:20的质量比混合，并添加葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，得到含0.5wt％葡萄糖，0.2wt％蛋白胨，0.5wt％磷酸氢二钾，0.3wt％磷酸二氢钾的发酵培养基，然后添加10％的混合菌液，在发酵温度为37℃、pH值为8.0、发酵时间为48h的条件下进行发酵，发酵后先在3000rpm转速下离心10min，再在10000rpm转速下离心20min，得到第一DHA粗油；
(3)将第一DHA粗油在-5℃下冷冻，过滤除去其他油脂类物质，得到第二DHA粗油；
(4)将第二DHA粗油用活性炭进行脱色，再经过脱胶脱臭工序后加入抗氧化剂，得到DHA藻油成品。本实施例所采用的脱色、脱胶脱臭工艺均同实施例1，除臭所需时间为22min。镜检发现本实施例发酵后裂壶藻破壁率超过99％。所得DHA藻油成品无臭味，DHA含量为40.1wt％。
对比例1
本对比例提供了一种发酵提取DHA的方法。本对比例发酵提取DHA的方法包括以下步骤：
(1)将市售枯草芽孢杆菌活化、扩增培养，得到枯草芽孢杆菌培养液(菌体浓度为1×108cfu/mL)，其中枯草芽孢杆菌的活化以及扩增培养均同实施例1；
(2)将裂壶藻藻粉和水按裂壶藻藻粉：水＝1:10的质量比混合，并添加葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，得到含0.5wt％葡萄糖，0.2wt％蛋白胨，0.5wt％磷酸氢二钾，0.3wt％磷酸二氢钾的发酵培养基，然后添加2.5％的枯草芽孢杆菌培养液，在发酵温度为35℃、pH值为7.2、发酵时间为32h的条件下进行发酵，发酵后先在3000rpm转速下离心10min，再在10000rpm转速下离心20min，得到第一DHA粗油；
(3)将第一DHA粗油在-5℃下冷冻，过滤除去其他油脂类物质，得到第二DHA粗油；
(4)将第二DHA粗油用活性炭进行脱色，再经过脱胶脱臭工序后加入抗氧化剂，得到DHA藻油成品。本对比例所采用的脱色、脱胶脱臭工艺均同实施例1，除臭所需时间为20min。镜检发现本对比例发酵后裂壶藻破壁率超过95％。所得DHA藻油成品无臭味，DHA含量为37.6wt％。
对比例2
本对比例提供了一种发酵提取DHA的方法。本对比例发酵提取DHA的方法包括以下步骤：
(1)将市售枯草芽孢杆菌、市售解脂假丝酵母菌以及市售双歧杆菌分别活化、扩增培养，得到枯草芽孢杆菌培养液(菌体浓度为10×107cfu/mL)、解脂假丝酵母培养液(菌体浓度为1×107cfu/mL)以及双歧杆菌培养液(菌体浓度为20×107cfu/mL)，然后将枯草芽孢杆菌培养液、解脂假丝酵母培养液和双歧杆菌培养液按体积比枯草芽孢杆菌培养液：解脂假丝酵母培养液：双歧杆菌培养液＝2:1:1混合，得到混合菌液，其中枯草芽孢杆菌和解脂假丝酵母菌的活化以及扩增培养均同实施例1，双歧杆菌扩增培养所用培养液包括葡萄糖1wt％，酵母粉1.5wt％，蛋白胨1wt％，番茄汁7wt％，K2HPO4 0.2wt％，CH3COONa 0.5wt％，C6H5O7(NH4)3 0.2wt％，MgSO4 0.02wt％，MnSO4 0.005wt％，以及余量水。扩增培养在摇床中进行，扩增培养的条件为：温度37℃，初始pH值7.0，摇床转速200r/min，时间24h；
(2)将裂壶藻藻粉和水按裂壶藻藻粉：水＝1:15的质量比混合，并添加葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，得到含0.5wt％葡萄糖，0.2wt％蛋白胨，0.5wt％磷酸氢二钾，0.3wt％磷酸二氢钾的发酵培养基，然后添加9％的混合菌液，在发酵温度为35℃、pH值为7.2、发酵时间为32h的条件下进行发酵，发酵后先在3000rpm转速下离心10min，再在10000rpm转速下离心20min，得到第一DHA粗油；
(3)将第一DHA粗油在-5℃下冷冻，过滤除去其他油脂类物质，得到第二DHA粗油；
(4)将第二DHA粗油用活性炭进行脱色，再经过脱胶脱臭工序后加入抗氧化剂，得到DHA藻油成品。本实施例所采用的脱臭工艺同实施例1，除臭时间为22min。镜检发现本对比例发酵后裂壶藻破壁率98％。所得DHA藻油成品无臭味，DHA含量为38.8wt％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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Claims (10)
1.一种发酵提取DHA的方法，其特征在于，所述发酵方法包括以下步骤：
(1)将裂壶藻藻粉和水混合，得到发酵培养基；
(2)在所述发酵培养基中接种混合菌液，发酵后静置或离心，得到第一DHA粗油；
(3)将所述第一DHA粗油在-10～0℃下冷冻后，过滤或离心，得到第二DHA粗油；
(4)将所述第二DHA粗油脱色后，脱胶脱臭，加入抗氧化剂，得到DHA藻油成品；
其中混合菌液中包括芽孢杆菌和假丝酵母菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中，裂壶藻藻粉和水的质量比为1：(10～20)；所述接种混合菌液后，发酵培养基中芽孢杆菌菌体的初始浓度为1～10×106cfu/mL，假丝酵母菌菌体的初始浓度为1～10×105cfu/mL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，混合菌液质量为发酵培养基质量的5～10％，混合菌液主要由芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液配制而成，芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液的体积比为(1～3):1，芽孢杆菌培养液中芽孢杆菌菌体浓度为10×107cfu/mL，酵母菌培养液中酵母菌菌体浓度为1×107cfu/mL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌培养液由初始芽孢杆菌菌体经活化和扩增培养所得，其中芽孢杆菌扩增培养所用培养液包含葡萄糖、玉米粉、豆粕和水；所述酵母菌培养液由初始酵母菌菌体经活化和扩增培养所得，其中酵母菌扩增培养所用培养液包含蛋白胨、蔗糖和无机盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌扩增培养所用培养液包含以下质量百分比的组分：葡萄糖1.5％，玉米粉2％，豆粕4％，余量水；所述酵母菌扩增培养所用培养液包含以下质量百分比的组分：蛋白胨3.5％，蔗糖7.5％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.15％，硫酸铵0.1％，余量水。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌扩增培养的条件为：温度35～37℃，初始pH值7.0～7.2，转速200r/min，时间45～50h；所述酵母菌扩增培养的条件为：温度28～30℃，初始pH值5.5～6.0，转速200r/min，时间52～60h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为：温度为30～37℃，时间为1～48h，pH值为7.0～8.0。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中还包含以下重量份的组分：葡萄糖0.5％，蛋白胨0.2％，磷酸氢二钾0.5％，磷酸二氢钾0.3％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，发酵后离心得到第二DHA粗油，离心条件为：先在2000-4000rpm转速下离心10-20min，再在8000-12000rpm转速下离心10-20min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌，所述酵母菌为解脂假丝酵母菌。
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