CN118028119A - 一种高含量dha油脂的裂殖壶菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种高含量DHA油脂的裂殖壶菌株，所述裂殖壶菌株命名为裂殖壶菌AH1(Schizochytrium sp AH1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M20232590，保藏日期为2023年12月18日。所述裂殖壶菌是发明人从广东茂名红树林地区收集水样，然后经分离‑诱变‑筛选获得。所述菌体为圆球形或椭球形，直径在10‑20微米，细胞主要采用分裂方式进行繁殖。本申请还公开了采用如前所述的裂殖壶菌株或者包含所述裂殖壶菌株的菌剂发酵生产，得到高含量DHA藻油的方法。所述高含量DHA藻油中，DHA占总脂肪酸的含量高于70％，突破了现有技术的天花板，实现了不可预料的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及海洋微生物的应用技术，具体涉及一种高含量DHA油脂的裂殖壶菌菌株。
背景技术
二十二碳六烯酸(DHA)是一种重要的ω-3多不饱和脂肪酸，具有促进脑细胞发育、降血脂、保护视力、抗癌和提高免疫力等重要生理功能，广泛应用在婴幼儿食品及医药行业。通过微生物培养，进而结合发酵工艺获得的含DHA的藻油，是目前工业生产中采用的主要方式。其中，裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)是一种海洋真菌，属于Chromophyta界，Heterokonta门，Thraustochytriales目，Thraustochytriaceae科，在2007年后也被人称为Aurantiochytrium。裂殖壶菌具备生长快、抗逆性强、脂类含量高、DHA产量高等特点，是目前工业生产DHA的理想菌种。
基于裂殖壶菌在工业生产DHA中的广泛应用，研究人员也进行了大量的相关研究；目前，通过改善工艺参数如复合碳源、温度控制，通气量(溶氧控制)等，已将裂殖壶菌的DHA产量提升到一个相对可观的数值，能够基本上满足工业生产的需求。但提高菌株本身的性能，提升DHA在总脂肪酸中的含量仍然是解决问题的根本方法。这是因为：(1)依赖工艺参数的改善提升DHA的产量仍然受限于菌株本身的性能；(2)DHA在总脂肪酸中含量的提升，不但能够提升DHA的产量，还能降低产业化生产的成本。此前报道的裂殖壶菌菌株中，DHA通常占到总脂肪酸的45-55％。
综上，虽然前述专利申请通过菌株及相应方法的实施，使生产的DHA藻油中DHA的含量有所提升，但仍无法满足药品和特医食品领域对于DHA藻油中DHA含量的要求。因此进一步提升藻油中DHA的含量，不但对于产业化生产具有重要的意义，也是拓展藻油DHA应用领域所必须解决的关键技术问题。
发明内容
针对现有技术中DHA藻油中DHA含量的现状，本发明提供一种高含量DHA油脂的裂殖壶菌菌株及其应用。采用所述的裂殖壶菌菌株发酵生产富含DHA的油脂，DHA含量占藻油中总脂肪酸的含量高于70％，突破了现有技术的天花板，实现了不可预料的技术效果。
本发明的技术方案是：
一种高含量DHA油脂的裂殖壶菌株，所述裂殖壶菌株命名为裂殖壶菌AH1(Schizochytrium sp AH1)，保藏于位于湖北省武汉市武昌区武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 20232590，保藏日期为2023年12月18日。所述裂殖壶菌是发明人从广东茂名红树林地区收集水样，然后经分离-诱变-筛选获得。所述菌体为圆球形或椭球形，直径在10-20微米，细胞主要采用分裂方式进行繁殖，如图1所示。
一种菌剂，所述菌剂包含如前所述的裂殖壶菌株。
一种富含DHA的油脂的生产方法，采用如前所述的裂殖壶菌株或者包含所述裂殖壶菌株的菌剂发酵生产，得到富含DHA的油脂。
其中，所述液体培养基中裂殖壶菌的接种量为10-15％。所述发酵的具体条件为：25-30℃、pH＝6-7、溶解氧不低于20％的条件下培养4-5天。所述液体培养基包括：葡萄糖60-120g/L，酵母提取物3-20g/L，蛋白胨3-20g/L，磷酸二氢钾2-8g/L，硫酸镁1-5g/L，柠檬酸钠1-4g/L，海水晶5-30g/L，维生素B1 1-30mg/L，维生素B6 1-30mg/L，维生素B12 1-10mg/L，生物素1-10mg/L。所述的发酵生产为：在液体培养基中高密度发酵，将菌体细胞依次进行破碎、分离和精制。
优选的是，所述的破碎步骤为酶解，所述的分离步骤为离心，所述的精制步骤为脱胶、脱色、脱臭和冬化处理。其中，所述分离和精制均在真空度小于-0.08Mpa为或者氮气浓度大于99％的条件下进行；所述分离的温度条件为55-90℃。
优选的是，所述发酵步骤还包括补糖操作，保证葡萄糖的浓度为5-20g/L。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种自主筛选的裂殖壶菌高产菌株，采用所述裂殖壶菌发酵生产高含量DHA藻油，DHA含量占藻油中总脂肪酸的含量高于70％，突破了现有技术的天花板，实现了不可预料的技术效果。
(2)采用本发明所述菌株发酵生产的DHA藻油中DHA含量的提升，不但扩展了其在药品和特医食品领域的应用，而且使得藻油的熔点显著降低，极大的提升了藻油在精制过程中的回收率，这对产业化生产来说意义重大。
(3)本发明所述的裂殖壶菌高产菌株是自然筛选的菌株，采用其制备DHA藻油，不存在目前消费者对转基因产品抵触带来的负面影响，进一步增加了其在药品和特医食品领域的应用前景。
附图说明
附图1是本申请所述的裂殖壶菌AH1菌株在显微镜下的形态；
附图2是采用气相色谱法对实施例4制备的DHA藻油的脂肪酸组成分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：筛选高含量DHA裂殖壶菌细胞
将广东茂名红树林地区收集的水样在含有20g/L葡萄糖、20g/L酵母提取物、卡那霉素100mg/L、氨苄青霉素50mg/L和15g/L海水晶的培养基中富集培养12h。收集细胞样品，然后进行重离子束12C6+辐射诱变；其中，离子束能量为80Mev/u，辐射强度为280Gy。将诱变后的样品涂布到含有20g/L葡萄糖、20g/L酵母提取物和15g/L海水晶的固体培养基中，25℃培养2天，选取单个菌落利用气相色谱方法分析其脂肪酸组成。
结果表明：对150个平板上的与3000个单菌落细胞进行脂肪酸组成分析后，共筛选得到脂肪酸中DHA含量大于50％的细胞57株，经过五轮复筛培养后获得DHA含量仍大于50％的细胞8株。将这8株裂殖壶菌细胞培养后，采用气相色谱对其油脂中DHA含量进行分析(详见表1)；经分析发现，有1株裂殖壶菌细胞培养后其油脂中DHA含量达到71.6％，遂命名为裂殖壶菌AH1菌株。此外，研究发现，显微观察AH1菌株细胞为圆球形或椭球形，直径在10-20微米(如图1所示)，细胞主要采用分裂方式进行繁殖。
表1筛选的得到的部分裂殖壶菌菌株油脂中DHA含量分析
| 菌株编号 | 油脂中DHA含量(％总脂质) |
| AH1 | 71.6％ |
| AB3 | 61.5％ |
| AE3 | 65.7％ |
| AF2 | 56.4％ |
| AG5 | 60.2％ |
| AG6 | 65.3％ |
| AG8 | 58.8％ |
| AH9 | 64.5％ |
实施例2：裂殖壶菌AH1菌株的发酵试验
(1)裂殖壶菌AH1菌株的活化及种子液制备：
将保存在甘油管的AH1菌株接入装有培养基(葡萄糖60g/L，酵母提取物20g/L，海水晶为15g/L)的摇瓶中，在30℃的摇床中，以150rpm的转速，培养24h，种子液在600nm处的吸光值为21，获得一级种子液；将一级种子按10％的接种量接入新的种子摇瓶中，在30℃的摇床中，以200rpm的转速，培养24h，种子液在600nm处的吸光值为26，获得二级种子液。
(2)裂殖壶菌AH1菌株的发酵：
将获得的裂殖壶菌种子液按照10％的接种量接种于装有液体培养基的5L发酵罐中，在25-30℃的条件下培养4-5天。通过搅拌转速(从300-800rpm)和通气比(1.2-2.0vvm，vvm为每分钟单位培养基内通入的空气量)联动，使发酵液中溶解氧保持在20％以上。自动添加1％(w/v)的柠檬酸和10％(w/v)的氨水调节pH值，使pH值保持在6.5。
所述液体培养基包含如下组分：葡萄糖60g/L，酵母提取物20g/L，蛋白胨3g/L，磷酸二氢钾8g/L，硫酸镁5g/L，柠檬酸钠1g/L，海水晶5g/L，维生素B1 1mg/L，维生素B6 30mg/L，维生素B12 1mg/L，生物素10mg/L。
发酵过程中进行补糖操作，保证葡萄糖的浓度为20g/L。
(3)细胞破碎与油脂分离：
将裂殖壶菌发酵液进行酶解，其中半乳糖苷酶+纤维素酶+中性蛋白酶的质量比为1：0.5：4，此时的细胞破壁率为100％。酶的添加量为发酵液体积的5‰。离心分离酶解液时温度为90℃，收集油相获得粗制藻油；酶解及离心过程中均使用99.9％氮气进行保护。
实验总结：5L发酵罐获得裂殖壶菌的产量为163g/L，获得油脂产量90g/L，油脂中DHA含量为72.3％，DHA产量为64.8g/L。
实施例3：裂殖壶菌AH1菌株的10L发酵试验
(1)裂殖壶菌AH1菌株的活化及种子液制备：
将保存在甘油管的AH1菌株接入装有培养基(同实施例2)的摇瓶中，在25℃的摇床中，以200rpm的转速，培养24h，种子液在600nm处的吸光值为22，获得一级种子液；将一级种子按15％的接种量接入新的种子摇瓶中，在25℃的摇床中，以150rpm的转速，培养24h，种子液在600nm处的吸光值为31，获得二级种子液。
(2)裂殖壶菌AH1菌株的发酵：
将获得的裂殖壶菌种子液按照15％的接种量接种于装有液体培养基的10L发酵罐中，在30℃的条件下培养2天，然后在25℃的条件下培养3天。通过搅拌转速(从300-800rpm)和通气比(1.2-2.0vvm，vvm为每分钟单位培养基内通入的空气量)联动，使发酵液中溶解氧保持在20％以上。自动添加10％(w/v)的柠檬酸和20％(w/v)的氨水调节pH值，使pH值保持在6.5。
所述液体培养基中包含如下组分：葡萄糖120g/L，酵母提取物3g/L，蛋白胨20g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1g/L，柠檬酸钠4g/L，海水晶30g/L，维生素B1 30mg/L，维生素B61mg/L，维生素B12 10mg/L，生物素1mg/L。
发酵过程中进行补糖操作，保证葡萄糖的浓度为5g/L。
(3)细胞破碎与油脂分离：
将裂殖壶菌发酵液进行酶解，其中半乳糖苷酶+纤维素酶+中性蛋白酶的质量比为1：0.5：4，此时的细胞破壁率为100％。酶的添加量为发酵液体积的5‰。离心分离酶解液时温度为90℃，收集油相获得粗制藻油；酶解及离心过程中均使用99.9％氮气进行保护。
实验总结：10L发酵罐获得裂殖壶菌的产量为145g/L，获得油脂产量72.5g/L；采用气相色谱对其油脂中DHA含量进行分析，油脂中DHA含量为70.4％，DHA产量为51.0g/L。
实施例4：裂殖壶菌AH1菌株的放大发酵试验
(1)裂殖壶菌AH1菌株的活化及种子液制备：
将保存在甘油管的AH1菌株接入装有培养基(同实施例2)的摇瓶中，在25℃的摇床中，以200rpm的转速，培养24h，种子液在600nm处的吸光值为20，获得一级种子液；将一级种子按12％的接种量接入新的种子摇瓶中，在25℃的摇床中，以180rpm的转速，培养24h，种子液在600nm处的吸光值为27，获得二级种子液。
(2)裂殖壶菌AH1菌株的发酵：
将获得的裂殖壶菌种子液按照12％的接种量接种于装有液体培养基的50L发酵罐中，在30℃的条件下培养2天，然后在25℃的条件下培养3天。通过搅拌转速和通气比联动，使发酵液中溶解氧保持在20％以上。自动添加5％(w/v)的柠檬酸和20％(w/v)的氨水调节pH值，使pH值保持在6.5。
所述液体培养基中包含如下组分：葡萄糖120g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，柠檬酸钠2g/L，海水晶20g/L，维生素B1 10mg/L，维生素B615mg/L，维生素B12 8mg/L，生物素8mg/L。
发酵过程中进行补糖操作，保证葡萄糖的浓度为10g/L。
(3)细胞破碎与油脂分离：
将裂殖壶菌发酵液进行酶解，其中半乳糖苷酶+纤维素酶+中性蛋白酶的质量比为1：1：3，此时的细胞破壁率为98％。酶的添加量为发酵液体积的10‰。离心分离酶解液时温度为55℃，收集油相获得粗制藻油；酶解及离心过程中均使用99％氮气进行保护。
实验总结：50L发酵罐获得裂殖壶菌的产量为140g/L，获得油脂产量74.2g/L；采用气相色谱对其油脂中DHA含量进行分析(如图2所示)，其油脂中DHA含量为70.2％，DHA产量为52.1g/L。
实施例5：常规菌株(对照菌株)裂殖壶菌SD116菌株的放大发酵试验
(1)裂殖壶菌SD116菌株的活化及种子液制备：
将保存在甘油管的SD116菌株接入装有培养基(同实施例2)的摇瓶中，在25℃的摇床中，以200rpm的转速，培养24h，种子液在600nm处的吸光值为20，获得一级种子；将一级种子按12％的接种量接入新的种子摇瓶中，在25℃的摇床中，以180rpm的转速，培养24h，种子液在600nm处的吸光值为27，获得二级种子；
(2)裂殖壶菌SD116菌株的发酵：
将获得的裂殖壶菌种子液按照12％的接种量接种于装有培养基的50L发酵罐中，在30℃的条件下培养2天，然后在25℃的条件下培养3天。通过搅拌转速和通气比联动，使发酵液中溶解氧保持在20％以上。自动添加5％(w/v)的柠檬酸和20％(w/v)的氨水调节pH值，使pH值保持在6.5。
所述培养基中包含如下组分：葡萄糖120g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，柠檬酸钠2g/L，海水晶20g/L，维生素B1 10mg/L，维生素B615mg/L，维生素B12 8mg/L，生物素8mg/L。
发酵过程中进行补糖操作，保证葡萄糖的浓度为10g/L。
(3)细胞破碎与油脂分离：
将裂殖壶菌发酵液进行酶解，其中半乳糖苷酶+纤维素酶+中性蛋白酶的质量比为1：1：3，此时的细胞破壁率为98％。酶的添加量为发酵液体积的10‰。离心分离酶解液时温度为55℃，收集油相获得粗制藻油；酶解及离心过程中均使用99％氮气进行保护。
实验总结：50L发酵罐获得裂殖壶菌的产量为150g/L，获得油脂产量90.2g/L；采用气相色谱对其油脂中DHA含量进行分析，其油脂中DHA含量为42.1％，DHA产量为38.0g/L。
表2裂殖壶菌AH1菌株的发酵指标汇总
从表2可以得知，虽然本申请所述的裂殖壶菌AH1菌株和对照菌株SD116的生物量、油脂产量相差无几，但油脂中DHA的含量42.1％提升到了70.2％-72.3％，实现了显著的提升，产生了预料不到的技术效果。即便是与专利文献中的报道数据相比，本申请所述的裂殖壶菌AH1菌株发酵生产的油脂中DHA的含量也实现了突破。此外，该数据也远远高于现行国家标准(GB26400-2011食品添加剂二十二碳六烯酸油脂(发酵法))中规定的35％的标准指标，有望满足药品和特医食品领域对于DHA藻油中DHA含量的要求。
实施例6：裂殖壶菌AH1菌株生产藻油的精制
对实施例3中AH1菌种发酵获得的高DHA含量藻油700mL进行精制，包括如下步骤：
①将粗制藻油进行脱胶、脱色和脱臭处理。将粗制藻油投入水化罐中并加热至60℃，边搅拌边加入粗制藻油1wt％的稀碱溶液，添加完毕后搅拌5min，然后静置2h，除去底层胶质和水，完成脱胶脱酸处理；将处理后的藻油加热至80℃，添加藻油总量2wt％的活性炭，进行吸附脱色，过滤得到脱色藻油；过程中保证装置内部的氮气浓度为99％。将脱色藻油投入脱臭塔中，在小于-0.08Mpa的真空度下进行脱臭处理，得到藻油632mL。
②将获得的脱臭藻油在氮气浓度为99％的环境下进行冬化处理，经过三级降温处理后，得到精制藻油578mL。计算可知，冬化处理的回收率达到91.5％。
裂殖壶菌AH1菌株生产的藻油其精制过程的总体回收率达到82.6％。
实施例7：裂殖壶菌AH1菌株生产藻油的精制
对实施例4中AH1菌种发酵获得的高DHA含量藻油3580mL进行精制，包括如下步骤：
①将粗制藻油进行脱胶、脱色和脱臭处理。将粗制藻油投入水化罐中并加热至65℃，边搅拌边加入粗制藻油1.5wt％的稀碱溶液，添加完毕后搅拌10min，然后静置1h，除去底层胶质和水，完成脱胶脱酸处理；将处理后的藻油加热至85℃，添加藻油总量1.5wt％的活性炭，进行吸附脱色，过滤得到脱色藻油；过程中保证装置内部的氮气浓度为99.5％。将脱色藻油投入脱臭塔中，在小于-0.09Mpa的真空度下进行脱臭处理，得到藻油3270mL。
②将获得的脱臭藻油在氮气浓度为99％的环境下进行冬化处理，经过三级降温处理后，得到精制藻油2835mL。冬化处理的回收率达到86.7％。
裂殖壶菌AH1菌株生产的藻油其精制过程的总体回收率达到79.2％。
实施例8：常规菌株(对照菌株)裂殖壶菌SD116菌株生产藻油的精制
对实施例5中SD116菌种发酵获得的普通DHA藻油4350mL进行精制，包括如下步骤：
①将粗制藻油进行脱胶、脱色和脱臭处理。将粗制藻油投入水化罐中并加热至65℃，边搅拌边加入粗制藻油1.5wt％的稀碱溶液，添加完毕后搅拌10min，然后静置1h，除去底层胶质和水，完成脱胶脱酸处理；将处理后的藻油加热至85℃，添加藻油总量1.5wt％的活性炭，进行吸附脱色，过滤得到脱色藻油；过程中保证装置内部的氮气浓度为99.5％。将脱色藻油投入脱臭塔中，在小于-0.09Mpa的真空度下进行脱臭处理，得到藻油4002mL。
②将获得的脱臭藻油在氮气浓度为99％的环境下进行冬化处理，经过三级降温处理后，得到精制藻油2453mL。冬化处理的回收率为61.3％。
裂殖壶菌SD116菌株生产的藻油其精制过程的总体回收率达到56.4％。
表3实施例6-8藻油精制后指标汇总
从表3可以得知，采用本申请所述的AH1菌株发酵生产的粗制藻油，进一步处理获得的精制藻油，其过氧化值仅为0.3-0.4，显著低于现行国家标准(GB26400-2011食品添加剂二十二碳六烯酸油脂(发酵法))中规定的5meq/kg的标准指标；茴香胺值也显著低于其他种类油脂中的相关数值。更为重要的是，由AH1菌株制备的高含量DHA藻油与菌株SD116制备的DHA精制藻油相比，虽然过氧化值和茴香胺值相差不多，但其精制过程中整体回收率(91.5％vs61.3％)，特别是冬化过程回收率(82.6％vs56.4％)却显著提高，在产业化方面上具有极大的应用前景。
综上可知，采用本发明所述的裂殖壶菌高产菌株AH1发酵生产高含量DHA藻油，DHA含量占藻油中总脂肪酸的含量高于70％，突破了现有技术的天花板。与此同时，而高DHA含量使得藻油的熔点显著降低，极大的提升了藻油在精制过程中的回收率，这对产业化生产来说意义重大。进一步的，本发明所述的裂殖壶菌高产菌株是自然筛选的菌株，采用其制备的DHA藻油，不存在当前消费者对转基因产品抵触产生的负面影响，进一步增加了其在药品和特医食品领域的应用前景。
Claims (10)
1.一种高含量DHA油脂的裂殖壶菌株，其特征在于：所述裂殖壶菌株命名为裂殖壶菌AH1(Schizochytrium sp AH1)，保藏于位于湖北省武汉市武昌区武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 20232590，保藏日期为2023年12月18日。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂包含权利要求1所述的裂殖壶菌株。
3.一种富含DHA的油脂的生产方法，其特征在于：采用如权利要求1所述的裂殖壶菌株或者权利要求2所述的菌剂发酵生产，得到富含DHA的油脂。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于：所述的发酵生产具体为：在液体培养基中高密度发酵，将菌体细胞依次进行破碎、分离和精制。
5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于：所述液体培养基中裂殖壶菌的接种量为10-15％。
6.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于：所述发酵的具体条件为：25-30℃、pH＝6-7、溶解氧不低于20％的条件下培养4-5天。
7.根据权利要求4-6中任意一项所述的生产方法，其特征在于：所述液体培养基包括：葡萄糖60-120g/L，酵母提取物3-20g/L，蛋白胨3-20g/L，磷酸二氢钾2-8g/L，硫酸镁1-5g/L，柠檬酸钠1-4g/L，海水晶5-30g/L，维生素B1 1-30mg/L，维生素B6 1-30mg/L，维生素B121-10mg/L，生物素1-10mg/L。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于：所述的破碎步骤为酶解，所述的分离步骤为离心，所述的精制步骤为脱胶、脱色、脱臭和冬化处理。
9.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于：所述分离和精制均在真空度小于-0.08Mpa为或者氮气浓度大于99％的条件下进行；所述分离的温度条件为55-90℃。
10.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于：所述发酵步骤还包括补糖操作，保证葡萄糖的浓度为5-20g/L。
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