CN117946875A - 一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含Sn-2位DHA藻油中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种裂殖壶菌及其在发酵生产富含Sn‑2位DHA藻油中的应用，属于生物工程技术领域，该裂殖壶菌菌株为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD‑2212，其保藏编号为CCTCC No.M20221978；所述富含Sn‑2位DHA藻油由裂殖壶菌(TKD‑2212)发酵制得，包括如下制作步骤：使用富含Sn‑2位DHA藻油的裂殖壶菌活化得到种子液；种子液经过一级、二级和三级发酵生产出发酵液；发酵液经破壁、萃取处理得到粗DHA藻油；粗DHA藻油再经酸化脱胶、脱色、脱臭处理制得DHA藻油；最后将DHA藻油经过醇解及溶剂萃取后得到富含Sn‑2位DHA藻油。本发明生产出的藻油的DHA含量在40‑65％，其中Sn‑2位上DHA比例在35‑50％，与天然DHA更相似，较普通DHA更易被人体吸收。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含Sn-2位DHA藻油中的应用。
背景技术
二十二碳六烯酸又被称为DHA，分子式为C22H32O2，属于ω-3系列不饱和脂肪酸。DHA在人体内主要分布在大脑灰质、神经系统、视网膜系统、心肌、嗜酸性白细胞和母乳等处，具有重要的生理功能。研究表明DHA在Sn-2位的特殊结构甘油三酯更利于人体吸收，甘油三酯结构的油脂经胰腺脂肪酶分解后，Sn-1、Sn-3位脂肪酸形成游离的脂肪酸，难以渗入胆盐微胶粒被人体吸收，从而容易与肠道中钙、镁离子结合形成不溶性的皂盐损失掉；而Sn-2位脂肪酸形成单甘油酯，易渗入胆盐微胶粒被人体吸收，所以Sn-2位脂肪酸比Sn-1、Sn-3位脂肪酸具有更高的人体吸收率。
裂殖壶菌(Schizochytrium)又称裂壶藻，属于网粘菌门、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，因其生长速度快、易于培养等特点，被广泛应用于科研和商业生产。目前，微生物法获取DHA的主要来源是利用裂殖壶菌高密度发酵培养,其体内可积累大量脂肪，且70％以甘油三酯形式存在,其中DHA可以占到总脂肪酸的45-55％。
目前微生物来源的DHA油脂的甘油骨架上的分布比例是Sn-2位的含量，远远低于Sn-1、Sn-3位的含量，大量Sn-1、Sn-3位DHA在人体消化过程中形成皂盐而损失，微生物油脂的保健功效受到了限制。为提高人类对DHA藻油的利用率，本发明生产出一种富含Sn-2位DHA藻油，相较与普通商品化藻油与天然DHA更相似，提高了藻油中Sn-2位上DHA的含量，更容易被人类肠道黏膜吸收入。
发明内容
本发明的目的在于提供一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含Sn-2位DHA藻油中的应用，以解决背景技术中的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一株裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212，所述裂殖壶菌已于2022年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址位于中国-武汉-武汉大学，保藏编号为CCTCCNo.M20221978。
裂殖壶菌菌落及细胞形态：裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212在海水培养基上，25℃培养7天，菌落直径为3-5mm，白色，后期为浅褐色；菌体壁薄，球形，透明，菌体直径为6.0-18.2μm。
裂殖壶菌rRNA基因序列测定结果(18SrRNA序列片段)：
>rRNA_Scaffold34_21600-23382_DIR+/molecule＝18s_rRNA/score＝1330.9
ATCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTCGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTGTAAGTATAAGCGATTGTACTGTGAGACTGCGAACGGCTCATTATATCAGTAATAATTTCTTCGGTAGTTTCTTTTATATGGATACCTGCAGTAATTCTGGAAATAATACATGCTGTAAGAGCCCTGTATGGGGCTGCACTTATTAGAATGAAGCCGATTTTATTGGTGAATCATGATAATTGAGCAGATTGACATTTTTGTCGATGAATCGTTTGAGTTTCTGCCCCATCAGTTGTCGACGGTAGTGTATTGGACTACGGTGACTATAACGGGTGACGGAGAGTTAGGGCTCGACTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGACGGCTACCATATCCAAGGATAGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCACTGTGGACTCCACGAGGTAGTGACGAGAAATATCGATGCGAAGCGTGTATGCGTTTTGCTATCGGAATGAGAGCAATGTAAAACCCTCATCGAGGATCAACTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAGAAGCATATGCTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGGCATGGGCGACCGGTGCTTTCCCTGAATGGGGATTGATTGTCTGTGTTGCCTTGGCCATCTTTCTCATGCTTTATTGGTATGAGATCTTTCACTGTAATCAAAGCAGAGTGTTCCAAGCAGGTCGTATGACCGGTATGTTTATTATGGGATGATAAGATAGGACTTGGGTGCTATTTTGTTGGTTTGCACGCCTGAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGTATTCGTATTTAGGAGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTTCCGAAAGACGAACTAGAGCGAAGGCATTTACCAAGCATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCTGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTAGACCGTAAACGATGCCGACTTACGATTGTTGGGTGCTTATTAATGGGCCTCAGCAGCAGCACATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGGTAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCATGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTCGGCCTACTAAATAGTGCGTGGTATGGCAACATAGTGCGTTTTTACTTCTTAGAGGGACATGTCCGGTTTACGGGCAGGAAGTTCGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGGGTTCATCGGGTTTTAATTCTGTTTTTATGGAATTGAGTGCTTGGTCGGAAGGCCTGGCTAATCCTTGGAACGCTCATCGTGCTGGGGCTAGATTTTTGCAATTATTAATCTCCAACGAGGAATTCCTAGTAAACGCAAGTCATCAGCTTGCATTGAATACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCACCTACCGATTGAACGGTCCGATGAAACCATGGGATGTTTCTGTTTGGATTGATTTTTGGACAGAGGCAGAACTCGGGTGAATCTTATTGTTTAGAGGAAGGTGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTA。
一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含Sn-2位DHA藻油中的应用，包括如下步骤：
步骤一：采用富含Sn-2位DHA藻油的裂殖壶菌活化后得到裂殖壶菌种子液；
步骤二：将裂殖壶菌种子液经过一级种子罐扩大培养和二级种子罐扩大培养后进行三级发酵，生产出裂殖壶菌发酵液；
步骤三：采用酶法对裂殖壶菌发酵液进行破碎处理后经过萃取处理得到粗DHA藻油；
步骤四：粗DHA藻油再经酸化脱胶和脱臭处理制得精炼DHA藻油；
步骤五：DHA藻油经过醇解及溶剂萃取纯化后得到富含Sn-2位DHA藻油。
进一步地，步骤一筛选菌种的方法为：从自然环境中经筛选、诱变、选育，获取裂殖壶菌，进行全基因测序后进行定向驯化，筛选出裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212菌种后加甘油封存，在-80℃条件下保存。
活化方法为：将所述裂殖壶菌按照8％接种量接种至种子培养基中，30℃恒温培养36h得到藻种，在从种子培养基中按照5％接种量接种至发酵培养基中，控制温度为30℃、转速180rpm培养得到种子液。所述种子培养基的制作过程包括：葡萄糖10g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨5g/L，pH为6.5～7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。所述发酵培养基的制作过程包括：葡萄糖40g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨5g/L，pH6.5～7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。
进一步地，步骤二中发酵温度控制为20℃-28℃、转速为160-200rpm,使用3L种子罐进行进行发酵，发酵过程中发酵体系葡萄糖浓度低于5g/L时开始以0.8-1.2g/L/h速度流加高浓度葡萄糖补充碳源。
进一步地，步骤三中使用比酶活为3.5×105U/g的碱性蛋白酶,该酶为胞外酶，培养简单，产量大，适用于大规模生产应用。
酶法破碎和萃取方法为：在50℃-60℃、pH 9-10条件下使用1.5％-2.5％的碱性蛋白酶破碎裂殖壶菌发酵液，搅拌3h-5h。酶解后的发酵液加入等体积的正己烷常温搅拌2h-3h，高速离心分离(6000rpm，5min)。沉淀用正己烷重复萃取2-3次，合并上清油相为藻油与正己烷混合液。混合液进行减压蒸发(50-55℃、-2.8～1.2kPa)将正己烷蒸出，得到富含DHA的粗藻油。
进一步地，步骤四中使用85％磷酸可以把磷脂和磷脂金属复合物转化成水化磷脂从而有效降低油脂中胶质和微量金属含量。
酸化脱胶和脱臭方法为：在300～400Pa真空罐中添加初级藻油质量0.1％-0.3％的磷酸(质量浓度85％)，搅拌15min(60rpm),静置15min后离心分离(6000rpm，10min)，脱去藻油中胶类物质和醛酮类物质，收集上清液得到富含DHA的精炼藻油。
进一步地，步骤五中使用的固定化脂酶是酰基水解酶Lipozyme RM IM(丹麦诺维信公司)，该酶为Sn-1,3特异性脂肪酶，其在藻油酶解反应中可以保留Sn-2位的DHA，而将Sn-1位和Sn-3位的脂肪酸水解为游离脂肪酸，进而富集得到较多的Sn-2位的DHA；乙醇和正己烷溶剂萃取纯化后可得到高纯度的Sn-2位DHA藻油。
富集Sn-2位DHA藻油具体方法如下：无水乙醇添加量为DHA藻油质量的3～5倍，混合后添加藻油质量8～12％的固定化脂肪酶，在温度25～35℃、搅拌转速为300～400rpm条件下反应8～10小时，反应结束将固定化脂肪酶离心过滤分离(5000rpm,10min)，上清液旋转蒸发除去乙醇，得到的藻油富含Sn-2位DHA。醇解反应生成产物中除Sn-2位DHA单甘酯外还含较多的脂肪酸乙酯，采用溶剂萃取方式进行纯化：藻油用85％的乙醇溶液溶解(藻油与乙醇体积比为1：10)，然后用与乙醇溶液等体积的正己烷洗涤乙醇体系三次，取乙醇相，旋转蒸发除去乙醇后即为富含Sn-2位DHA单甘酯的藻油。
本发明的有益效果是：本方法选育出一种裂殖壶菌TKD-2212，在经过一、二级扩大培养、三级发酵后实现DHA的高产率；利用Sn-1,3位酰基特异性选择脂肪酶对脱胶、脱臭后的藻油进行醇解反应，降低非Sn-2位脂肪酸含量，利用非水相(无水乙醇)条件减少Sn-2位DHA向Sn-1和Sn-3位的迁移，结合溶剂萃取纯化，实现藻油中Sn-2位DHA的富集。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中裂殖壶菌微观图；
图2为裂殖壶菌TKD-2212系统进化树图；
图3A所示为富含Sn-2位DHA藻油的总脂肪酸组成液相色谱图，图3B为Sn-2位脂肪酸组成液相色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
从自然环境中经筛选、诱变、选育，获取裂殖壶菌，进行全基因测序后进行定向驯化，筛选出裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212菌种(请参阅图1)后加甘油封存，在-80℃条件下保存。
如图1所示，裂殖壶菌菌落及细胞形态：裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212在海水培养基上，25℃培养7天，菌落直径为3-5mm，白色，后期为浅褐色；菌体壁薄，球形，透明，菌体直径为6.0-18.2μm。
该裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212已于2022年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址位于中国-武汉-武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M20221978。
裂殖壶菌TKD-2212的rRNA基因序列测定结果(18SrRNA序列片段，参见图2)如下所示：
裂殖壶菌rRNA基因序列测定结果(18SrRNA序列片段)：
>rRNA_Scaffold34_21600-23382_DIR+/molecule＝18s_rRNA/score＝1330.9
ATCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTCGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTGTAAGTATAAGCGATTGTACTGTGAGACTGCGAACGGCTCATTATATCAGTAATAATTTCTTCGGTAGTTTCTTTTATATGGATACCTGCAGTAATTCTGGAAATAATACATGCTGTAAGAGCCCTGTATGGGGCTGCACTTATTAGAATGAAGCCGATTTTATTGGTGAATCATGATAATTGAGCAGATTGACATTTTTGTCGATGAATCGTTTGAGTTTCTGCCCCATCAGTTGTCGACGGTAGTGTATTGGACTACGGTGACTATAACGGGTGACGGAGAGTTAGGGCTCGACTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGACGGCTACCATATCCAAGGATAGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCACTGTGGACTCCACGAGGTAGTGACGAGAAATATCGATGCGAAGCGTGTATGCGTTTTGCTATCGGAATGAGAGCAATGTAAAACCCTCATCGAGGATCAACTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAGAAGCATATGCTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGGCATGGGCGACCGGTGCTTTCCCTGAATGGGGATTGATTGTCTGTGTTGCCTTGGCCATCTTTCTCATGCTTTATTGGTATGAGATCTTTCACTGTAATCAAAGCAGAGTGTTCCAAGCAGGTCGTATGACCGGTATGTTTATTATGGGATGATAAGATAGGACTTGGGTGCTATTTTGTTGGTTTGCACGCCTGAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGTATTCGTATTTAGGAGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTTCCGAAAGACGAACTAGAGCGAAGGCATTTACCAAGCATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCTGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTAGACCGTAAACGATGCCGACTTACGATTGTTGGGTGCTTATTAATGGGCCTCAGCAGCAGCACATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGGTAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCATGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTCGGCCTACTAAATAGTGCGTGGTATGGCAACATAGTGCGTTTTTACTTCTTAGAGGGACATGTCCGGTTTACGGGCAGGAAGTTCGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGGGTTCATCGGGTTTTAATTCTGTTTTTATGGAATTGAGTGCTTGGTCGGAAGGCCTGGCTAATCCTTGGAACGCTCATCGTGCTGGGGCTAGATTTTTGCAATTATTAATCTCCAACGAGGAATTCCTAGTAAACGCAAGTCATCAGCTTGCATTGAATACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCACCTACCGATTGAACGGTCCGATGAAACCATGGGATGTTTCTGTTTGGATTGATTTTTGGACAGAGGCAGAACTCGGGTGAATCTTATTGTTTAGAGGAAGGTGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTA
实施例2
一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含Sn-2位DHA藻油中的应用，使用裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212生产富含Sn-2位DHA藻油，具体包括如下步骤：
裂殖壶菌TKD-2212生产富含Sn-2位DHA藻油的过程：筛选富含Sn-2位DHA藻油的裂殖壶菌TKD-2212菌种，活化裂殖壶菌菌种得到裂殖壶菌种子液；将裂殖壶菌种子液经过一级种子罐扩大培养和二级种子罐扩大培养后进行三级发酵，生产出裂殖壶菌发酵液；采用酶法对裂殖壶菌发酵液进行破碎处理后经过萃取处理得到粗DHA藻油，之后经酸化脱胶和脱臭处理制得精炼DHA藻油，最后经过醇解及溶剂萃取后得到富含Sn-2位DHA藻油。
上述裂殖壶菌TKD-2212菌种筛选方法为：从自然环境中经筛选、诱变、选育，获取裂殖壶菌，进行全基因测序后进行定向驯化，筛选出裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212菌种后加甘油封存，在-80℃条件下保存。
上述裂殖壶菌TKD-2212种子液制作方法为：将所述裂殖壶菌按照8％接种量接种至种子培养基中，30℃恒温培养36h得到藻种，在从种子培养基中按照5％接种量接种至发酵培养基中，控制温度为30℃、转速180rpm培养得到种子液。所述种子培养基的制作过程包括：葡萄糖10g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨5g/L，pH为6.5～7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。所述发酵培养基的制作过程包括：葡萄糖40g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨5g/L，pH6.5～7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。
上述种子液扩大培养方法为：种子液在3L、5L、10L的一级、二级种子罐和三级发酵罐中进行进行发酵，控制发酵温度为20℃、转速为180rpm进行发酵，发酵过程中体系葡萄糖浓度低于5g/L时开始以到1.2g/L/h速度流加高浓度葡萄糖补充碳源。
上述粗DHA藻油制作方法为：在55℃、pH 9.5条件下使用2％的碱性蛋白酶破碎裂殖壶菌发酵液，之后加入发酵液等体积的正己烷常温搅拌3h萃取3次得到粗DHA藻油。
上述精炼DHA藻油制作方法为：将粗藻油在400Pa真空罐中添加油重0.3％的85％磷酸以便于脱去藻油中胶类物质和醛酮类物质得到精炼藻油。
上述富含Sn-2位DHA藻油制作方法为：在25℃条件下添加精炼藻油体积10％的固定化脂肪酶在转速为350rpm条件下醇解得到粗富含Sn-2位DHA藻油，之后先后使用乙醇和正己烷溶剂萃取3次得到本发明产物(如图3A所示为富含Sn-2位DHA藻油的总脂肪酸组成液相色谱图，图3B为Sn-2位脂肪酸组成液相色谱图；框图中峰为Sn-2出峰)。
实施例3
一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含Sn-2位DHA藻油中的应用，使用裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212生产富含Sn-2位DHA藻油，具体包括如下步骤：
其中裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212生产富含Sn-2位DHA藻油的具体步骤与实施例2中的步骤一致。
其中上述裂殖壶菌TKD-2212菌种筛选和种子液制作方法与实施例2中的方法一致。
上述种子液扩大培养方法为：种子液在3L、5L、10L的一级、二级种子罐和三级发酵罐中进行进行发酵，控制发酵温度为22℃、转速为160rpm进行发酵，发酵过程中体系葡萄糖浓度低于5g/L时开始以到0.8g/L/h速度流加高浓度葡萄糖补充碳源。
上述粗DHA藻油制作方法为：在50℃、pH 9条件下使用1.5％的碱性蛋白酶破碎裂殖壶菌发酵液，之后加入发酵液等体积的正己烷常温搅拌2h萃取2次得到粗DHA藻油。
上述精炼DHA藻油制作方法为：将粗藻油在350Pa真空罐中添加油重0.2％的85％磷酸以便于脱去藻油中胶类物质和醛酮类物质得到精炼藻油。
上述富含Sn-2位DHA藻油制作方法为：在20℃条件下添加精炼藻油体积8％的固定化脂肪酶在转速为300rpm条件下醇解得到粗富含Sn-2位DHA藻油，之后先后使用乙醇和正己烷溶剂萃取2次得到本发明产物。
实施例4
一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含Sn-2位DHA藻油中的应用，使用裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212生产富含Sn-2位DHA藻油，具体包括如下步骤：
其中裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212生产富含Sn-2位DHA藻油的具体步骤与实施例2中的步骤一致。
其中上述裂殖壶菌TKD-2212菌种筛选和种子液制作方法与实施例2中的方法一致。
上述种子液扩大培养方法为：种子液在3L、5L、10L的一级、二级种子罐和三级发酵罐中进行进行发酵，控制发酵温度为24℃、转速为170rpm进行发酵，发酵过程中体系葡萄糖浓度低于5g/L时开始以到0.9g/L/h速度流加高浓度葡萄糖补充碳源。
上述粗DHA藻油制作方法为：在53℃、pH 9.3条件下使用1.8％的碱性蛋白酶破碎裂殖壶菌发酵液，之后加入发酵液等体积的正己烷常温搅拌3h萃取2次得到粗DHA藻油。
上述精炼DHA藻油制作方法为：将粗藻油在330Pa真空罐中添加油重0.25％的85％磷酸以便于脱去藻油中胶类物质和醛酮类物质得到精炼藻油。
上述富含Sn-2位DHA藻油制作方法为：在23℃条件下添加精炼藻油体积9％的固定化脂肪酶在转速为330rpm条件下醇解得到粗富含Sn-2位DHA藻油，之后先后使用乙醇和正己烷溶剂萃取3次得到本发明产物。
实施例5
一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含Sn-2位DHA藻油中的应用，使用裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212生产富含Sn-2位DHA藻油，具体包括如下步骤：
其中裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212生产富含Sn-2位DHA藻油的具体步骤与实施例2中的步骤一致。
其中上述裂殖壶菌TKD-2212菌种筛选和种子液制作方法与实施例2中的方法一致。
上述种子液扩大培养方法为：种子液在3L、5L、10L的一级、二级种子罐和三级发酵罐中进行进行发酵，控制发酵温度为26℃、转速为190rpm进行发酵，发酵过程中体系葡萄糖浓度低于5g/L时开始以到1.0g/L/h速度流加高浓度葡萄糖补充碳源。
上述粗DHA藻油制作方法为：在58℃、pH 9.8条件下使用2.3％的碱性蛋白酶破碎裂殖壶菌发酵液，之后加入发酵液等体积的正己烷常温搅拌2h萃取3次得到粗DHA藻油。
上述精炼DHA藻油制作方法为：将粗藻油在380Pa真空罐中添加油重0.1％的85％磷酸以便于脱去藻油中胶类物质和醛酮类物质得到精炼藻油。
上述富含Sn-2位DHA藻油制作方法为：在28℃条件下添加精炼藻油体积11％的固定化脂肪酶在转速为380rpm条件下醇解得到粗富含Sn-2位DHA藻油，之后先后使用乙醇和正己烷溶剂萃取2次得到本发明产物。
实施例6
一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含Sn-2位DHA藻油中的应用，使用裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212生产富含Sn-2位DHA藻油，具体包括如下步骤：
其中裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212生产富含Sn-2位DHA藻油的具体步骤与实施例2中的步骤一致。
其中上述裂殖壶菌TKD-2212菌种筛选和种子液制作方法与实施例2中的方法一致。
上述种子液扩大培养方法为：种子液在3L、5L、10L的一级、二级种子罐和三级发酵罐中进行进行发酵，控制发酵温度为28℃、转速为200rpm进行发酵，发酵过程中体系葡萄糖浓度低于5g/L时开始以到1.1g/L/h速度流加高浓度葡萄糖补充碳源。
上述粗DHA藻油制作方法为：在60℃、pH 10条件下使用2.5％的碱性蛋白酶破碎裂殖壶菌发酵液，之后加入发酵液等体积的正己烷常温搅拌3h萃取3次得到粗DHA藻油。
上述精炼DHA藻油制作方法为：将粗藻油在400Pa真空罐中添加油重0.15％的85％磷酸以便于脱去藻油中胶类物质和醛酮类物质得到精炼藻油。
上述富含Sn-2位DHA藻油制作方法为：在30℃条件下添加精炼藻油体积12％的固定化脂肪酶在转速为400rpm条件下醇解得到粗富含Sn-2位DHA藻油，之后先后使用乙醇和正己烷溶剂萃取3次得到本发明产物。
本发明使用裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)TKD-2212生产富含Sn-2位DHA藻油，与普通裂殖壶菌相比，TKD-2212生产的藻油中Sn-2位DHA含量较高，更容易被人类肠黏膜吸收。裂殖壶菌TKD-2212和普通裂殖壶菌比较如表1。
表1
本发明在种子液扩大培养过程中优化裂殖壶菌发酵工艺，控制发酵温度，检测发酵体系中葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于5g/L时使用流加高浓度葡萄糖的方法补充碳源，可以提高裂殖壶菌的生物量，提高DHA藻油产能，并且而较低的温度有利于DHA的积累。
根据实施例2-6制备的Sn-2位DHA藻油与普通DHA藻油相比，计算总DHA含量，具体结果如表2。
表2
本发明使用碱性蛋白酶进行藻油提取，较其他方法生产出的藻油得油率和油脂中DHA含量高，并且该酶为胞外酶，培养简单，产量大，适用于大规模生产应用。
根据实施例2-6制备的Sn-2位DHA藻油与普通DHA藻油相比，计算不饱和脂肪酸含量，具体结果如表3。
表3
本发明使用固定化脂肪酶对藻油进行醇解后进行萃取可得到富集的Sn-2位DHA藻油，计算Sn-2位DHA与总DHA含量比例，具体实施例效果如表4。
表4
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一株裂殖壶菌，其特征在于，其分类命名为裂殖壶菌(Schi zochytri umsp.)TKD-2212，所述裂殖壶菌已于2022年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址位于中国-武汉-武汉大学，保藏编号为CCTCCNo.M20221978。
2.根据权利要求1所述的裂殖壶菌在发酵生产富含Sn-2位DHA藻油中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：采用富含Sn-2位DHA藻油的裂殖壶菌活化后得到裂殖壶菌种子液；
步骤二：将裂殖壶菌种子液经过一级种子罐扩大培养和二级种子罐扩大培养后进行三级发酵，生产出裂殖壶菌发酵液；
步骤三：采用酶法对裂殖壶菌发酵液进行破碎处理后经过萃取处理得到粗DHA藻油；
步骤四：粗DHA藻油再经酸化脱胶和脱臭处理制得精炼DHA藻油；
步骤五：DHA藻油经过醇解及溶剂萃取纯化后得到富含Sn-2位DHA藻油。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤一中的裂殖壶菌为富含Sn-2位DHA藻油的裂殖壶菌TKD-2212。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤一中活化方法为：将所述裂殖壶菌按照8％接种量接种至种子培养基中，30℃恒温培养36h得到藻种，在从种子培养基中按照5％接种量接种至发酵培养基中，控制温度为30℃、转速180rpm培养得到种子液；所述种子培养基的制作过程包括：葡萄糖10g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨5g/L，pH为6.5～7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min；所述发酵培养基的制作过程包括：葡萄糖40g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨5g/L，pH6.5～7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤二中发酵温度控制为20℃-28℃、转速为160-200rpm,使用3L、5L、10L种子罐进行进行发酵，发酵过程中发酵体系葡萄糖浓度低于5g/L时开始以0.8-1.2g/L/h速度流加高浓度葡萄糖补充碳源。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤三具体酶法如下：在50℃-60℃、pH9-10条件下使用1.5％-2.5％的碱性蛋白酶破碎裂殖壶菌发酵液，之后加入发酵液等体积的正己烷常温搅拌萃取2h-3h，离心分离取上清液，萃取2-3次,得到粗DHA藻油。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤四具体方法为：在300～400Pa真空罐中添加油重0.1％-0.3％的85％磷酸以便于脱去藻油中胶类物质和醛酮类物质。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤五中醇解反应使用固定化脂肪酶，在20-30℃、非水相条件下添加藻油体积8～12％的固定化脂肪酶在转速为300～400rpm条件下醇解得到粗富含Sn-2位DHA藻油，之后使用乙醇和正己烷溶剂萃取纯化2-3次得到产物。
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Citations (5)
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2024
- 2024-02-02 CN CN202410154611.5A patent/CN117946875A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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